牛Hydroxyapatite-Based骨支架与庆大霉素加速形成血管和骨缺损的重建

文摘

骨髓炎是一种传染性疾病也是一个主要的并发症骨缺陷。本研究旨在确定牛hydroxyapatite-gelatin-based骨植入的效果与抗生素庆大霉素(BHA-GEL-GEN植入)骨再生的缺陷在活的有机体内。BHA-GEL-GEN和BHA-GEL植入物是由直接压缩。在活的有机体内与Wistar鼠进行了研究。老鼠被分为三组:消极的控制,BHA-GEL植入,BHA-GEL-GEN植入物。缺陷模型使用磨孔缺陷模型直径2.2毫米和2毫米深。2、7、14和28天,老鼠被牺牲掉了。骨的完整性进行了使用x光射线照相。放射学检查执行用苏木精和伊红染色和免疫组织化学技术(他)anti-vascular内皮生长因子(VEGF)和anti-alkaline磷酸酶(ALP)抗体。根据x光照片,植入组加速骨骼生长在缺陷区域。半定量的数据从他染色显示,植入组加速迁移的破骨细胞,成骨细胞和骨细胞在缺陷区域。免疫反应性的分数表明BHA-GEL-GEN组VEGF高表达与其他两组相比。三组并没有提供一个显著差异在高山的表情。 In conclusion, the BHA-GEL-GEN implant causes accelerated bone defects repair by accelerating tissue vascularity and does not interfere with the bone remodeling process. Therefore, the BHA-GEL-GEN implant is potentially a biomedical material for osteomyelitis therapy.

1。介绍

骨髓炎是一个主要的并发症各种骨骼病理条件下,如骨折和关节置换术(1]。慢性骨髓炎可以打扰病人的生活质量。黄等。2)报道,慢性骨髓炎患者死亡率增加,特别是老年患者。像其他的传染性疾病,骨感染需要抗生素治疗根除传染性病原体。除此之外,抗生素还作为预防,防止感染骨缺陷(1]。然而,抗生素的使用在骨组织的挑战。这是因为药物的渗透到骨头和关节组织非常低。口服抗生素治疗,一般来说,不能产生足够的麦克风骨组织。另一方面,肠外路线可能有毒的麦克风时达到骨组织(1,3]。由于这个原因,许多生物材料开发作为骨组织的抗生素交付系统,其中一个是植入的形式(1,3]。

羟基磷灰石是一种最广泛的开发对骨植入生物材料。羟基磷灰石是一种磷酸钙导数化学公式和物理性质类似于羟磷灰石中发现人类骨骼。羟磷灰石可以通过多种方式获得。例如,它是合成钙和磷酸盐或直接从天然来源中提取如牛骨。从牛骨羟磷灰石被称为牛羟磷灰石(BHA) (4]。叔丁基羟基茴香醚和合成羟磷灰石的区别之一是丁基羟基茴香醚碳酸盐岩组,增加成骨细胞增殖和分化,从而使骨基质合成速度(5,6]。然而,底部钻具组合为一个单一的植入材料很容易脆(7]。出于这个原因,需要一个聚合物增加植入物的机械强度。明胶是胶原蛋白的变性聚合物使其类似于骨的有机组成部分,也是主要由胶原蛋白(8]。因此,植入物与BHA-GEL矩阵可能模仿骨的自然属性和潜在的抗生素如庆大霉素(创)骨组织。基于我们之前的研究中,植入物与创BHA-GEL矩阵作为治疗剂能够抑制的增长金黄色葡萄球菌线性(3]。

一些文学评论表明,一些药物影响骨代谢(9,10]。然而,没有足够的信息的影响创BHA-GEL矩阵在骨组织的再生。因此,本研究旨在研究创植入矩阵之外的在活的有机体内骨再生过程。除了功能作为药物输送系统,植入的目的是支持有缺陷的骨组织,所以也建议加速骨再生。

2。材料和方法

2.1。制造BHA-GEL-GEN植入

牛羟磷灰石(BHA)从牛骨中提取1000°C的温度根据前面研究的过程(4]。总共10克的底部钻具组合,5毫升20 wt %明胶(凝胶、Cartino、泰国),和10%庆大霉素(创、烟台Justaware制药、中国)混合,直到达到均匀混合形成可以使颗粒的质量。颗粒被沉浸在0.5 wt %的戊二醛(美国默克GTA) 24小时。颗粒被清洗,直到他们自由与蒸馏水GA和干在烤箱24小时40°C。此外,25毫克的粒重和塑造0.5吨的重量,形成直径2毫米的植入。创剂量用于每个植入0.041毫克/ 25毫克。

2.2。体内研究

共有72名男性Wistar鼠体重200 - 250克用于至少一个星期被用作实验研究的动物。在操作之前,老鼠麻醉8毫克/ KgBW甲苯噻嗪和氯胺酮25毫克/ KgBW有氨苄青霉素的剂量25毫克/ KgBW肌内,以防止感染。股骨地区之后,头发被剃,用70%的酒精消毒。在那之后,一个切口在股骨骨是可见的。然后,进行钻井股骨远端部分的缺陷直径2.2毫米,深度约2毫米。治疗的小鼠被分为三组:第一组是阴性对照组,这是一个缺陷模型没有植入,第二组是植入BHA-GEL植入,第三组与BHA-GEN-GEN植入物植入。操作完成后,用纱布伤口缝合和清洁滋润正常生理盐水betadine紧随其后,用纱布包扎,然后张贴。伤口护理是每天进行涂抹伤口betadine和改变石膏。

天2、7、14和28手术后,老鼠被致命剂量的氯胺酮和甲苯噻嗪终止麻醉剂量(3倍)。此外,股骨被放到一个容器包含10 w / v %福尔马林溶液在室温下。骨脱钙作用进行浸泡10 w / v %的骨头EDTA溶液,直到它变得柔软。

2.3。放射学检查

评价骨完整性进行了用x光射线照相和澄清ImageJ 1.52 (Wayne Rasband国立卫生研究院、美国)。

2.4。苏木精和伊红染色

组织学检查开始与串行处理脱水的石蜡块酒精(70%对100%)为60分钟。随后,清算与二甲苯进行15分钟的三倍。之后,与液体石蜡渗透过程进行了三次转移在孵化器60分钟60°C。然后植入组织石蜡液体和在室温下冷却。每个石蜡块然后使用旋转式切片机切厚度4 - 6μ。

细胞形态与苏木精和伊红染色的染料。幻灯片是蘸二甲苯三次5分钟,与酒精(96%到70%酒精)水化2分钟。幻灯片,然后用自来水冲洗10分钟,放入梅尔的苏木精为15分钟,自来水下冲洗,并在显微镜下检查。此外,幻灯片放在1%曙红的解决方案30秒,脱水,并清除,其次是安装EZ山。

2.5。免疫组织化学

免疫组织化学技术是用于染色VEGF和高山immunopositive细胞。的下滑是deparaffinised二甲苯三次5分钟,其次是补液与酒精(无水酒精70%)4分钟,和用自来水清洗5分钟。之后,幻灯片被0.5%的内源性过氧化5分钟,用自来水清洗5分钟。之后,抗原检索显现室进行,冷却20分钟,洗PBS为3分钟。之后,狙击手阻塞了15分钟。然后,兔子的下滑是孵化anti-rat VEGF底漆(猫。不。pa1 - 21796热费希尔科学,1:100稀释)或兔子anti-rat高山(猫。不。PAB091Ra01 USCN生活1:200稀释)在PBS和洗了3分钟。 After that, the universal linked was done for 20 minutes, and slide was washed in PBS for 3 minutes. Then, Trekavidin-HRP Label was carried out for 10 minutes and washed in PBS for 3 minutes. After that, the slide was reacted with Chromogen DAB + Buffer Substrate for 2 to 5 minutes, followed by rinsing under running water for 5 minutes. Then, the slide was counterstained with haematoxylin for 1 to 2 minutes, followed by rinsing (twice) under running water for 5 minutes each. After that, the slide was dehydrated with alcohol (70% to absolute alcohol) for 5 minutes each, followed by clearing with xylol three times for 5 minutes each. Finally, mounting was carried out on the slide (ecomount) and covered with a cover glass.

3所示。结果

研究生物材料在骨缺损修复的影响进行了Wistar鼠磨孔缺陷模型。几个时间点,影像学和组织学检查,检查三组的骨生长(消极的控制,BHA-GEL, BHA-GEL-GEN)。x光照片显示,植入组经验加速骨骼生长缺陷的面积相比没有植入(图组1)。此外,细胞形态存在于骨组织植入组表明,经历加速细胞迁移;这些细胞被破骨细胞、成骨细胞和骨细胞(图2(一个))。基于细胞形态半定量的数据,BHA-GEL和BHA-GEL-GEN组没有显示显著差异在破骨细胞的数量,成骨细胞和骨细胞(图2 (b))。因此可以得出结论,庆大霉素的植入公式不打扰骨重塑过程。

与抗vegf进行组织学检查,以确定每个动物的骨组织血管化的组织(图3(一个))。术后第二天,鉴于BHA-GEL-GEN显示国税局得分高于其他两组(单向方差分析, vs BHA-GEL, 和消极控制;图3 (b))。此外,BHA-GEL集团7日术后当天显示国税局得分高于阴性对照组(单向方差分析, ;图3 (b))。至于28天,阴性对照组国税局分数高于BHA-GEL集团(单向方差分析, ;图3 (b)),而BHA-GEL-GEN组有更高的国税局得分相比BHA-GEL集团(单向方差分析, ;图3 (b))。

此外,考试是由反应与anti-ALP骨组织,检查每组的成骨细胞活动(图4(一))。基于半定量的数据2天7和14两个植入组没有任何明显差异国税局的高山相比,负对照组(单向方差分析, ;图4 (b))。另一方面,在28天,BHA-GEL和BHA-GEL-GEN团体国税局分数高于阴性对照组(单向方差分析, ;图4 (b))。

4所示。讨论

在活的有机体内进行研究BHA-GEL-GEN植入Wistar鼠。根据放射学结果,植入集团BHA-GEL和BHA-GEL-GEN显示加速修复骨缺损。这也证明在组织学染色haematoxylin-eosin在这项研究中,底部钻具组合是主要的组件用作植入矩阵。基于前面的其他研究中,兔子植入底部钻具组合显示加速骨骼生长基于新骨的百分比和bone-to-material接触与其他组相比11,12]。除了底部钻具组合,另一种物质作为植入矩阵是明胶(凝胶)。凝胶是刺激细胞的增殖和分化参与骨再生(13]。因此可以得出结论,加速骨骼生长的缺陷区域是由于综合分析植入矩阵的性质。

骨折愈合是一个复杂的过程,涉及一系列的细胞和分子的行动。在这个过程中,骨细胞与其他细胞,促进组织愈合14,15]。血管起到至关重要的作用在维持细胞生存能力通过提供灌注缺陷。提供矿物质和血管生长因子有缺陷的组织和发布旁分泌信号,调节生长、分化和再生骨细胞(15]。血管内皮生长因子(VEGF)是一种蛋白质,这种蛋白质中扮演一个重要的角色在内皮细胞增殖,迁移和活化。VEGF被广泛用作骨组织血管化的标志(16]。证明,VEGF基因表达,VEGF蛋白水平也会影响骨骼生长由于生物材料(17]。BHA-GEL-GEN集团在这项研究中,经验丰富的加速血管化与其他两组相比基于VEGF的表达。这可能是由于两个因素;加速骨组织损伤后的炎症阶段或/和完整的庆大霉素对骨组织的影响。第三天伤后炎症阶段(18]。Umeki [19)发现庆大霉素有抗炎作用通过抑制NADPH氧化酶在中性粒细胞的激活。另一方面,高表达VEGF BHA-GEL-GEN组也可能由于庆大霉素的完整效果。贾比尔和Abdelnoor20.]发现庆大霉素腹腔内管理导致增加VEGF水平然后支持C57BL / 6小鼠血管生成。此外,BHA-GEL集团也经历了加速比阴性对照组血管化。这可能是因为BHA-GEL作为矩阵的主要材料类似于骨无机和有机组成部分。因此,植入物也可以作为骨组织支架,使受损组织中的血管的生长速度比阴性对照组(4,11,12]。

碱性磷酸酶(ALP)是一种酶,这种酶在成骨细胞的分化过程。高山表达式是相当高的初始阶段的成骨细胞分化,将减少在其他标记(如骨钙素)增加(21]。目前的研究发现,动物组植入生物材料造成高山表达高于nonimplanted组在重构阶段。正如前面解释的,所使用的主要材料植入的矩阵是底部钻具组合。底部钻具组合是自然的羟磷灰石从牛骨中提取。丁基羟基茴香醚碳酸盐岩组作为自然存在于人类骨羟磷灰石,这不是在合成羟磷灰石(22]。碳酸羟基磷灰石是改善蛋白质吸附,以及增加粘附、增殖和成骨分化的间充质干细胞(23,24]。除此之外,碳酸羟基磷灰石也是增加成骨细胞增殖,提高高山的水平在体外(5,6]。目前的研究表明,高山表达式BHA-GEL和BHA-GEL-GEN组没有明显不同。这意味着增加庆大霉素BHA-GEL植入不打扰正在进行的骨重塑过程。

5。结论

的在活的有机体内研究BHA-GEL-GEN植入。BHA-GEL-GEN植入物引起的加速骨组织血管化,不打扰骨组织重建过程,造成加速修复骨缺损。因此,BHA-GEL-GEN植入可能用于治疗骨髓炎。然而,进一步在活的有机体内与骨感染模型研究是必要的。

数据可用性

所有的数据都包含在本文使用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

这项工作是支持的印度尼西亚共和国的研究和技术,通过加强产业创新研究计划2019财政年度(批准号007 / F1 / PPK.2 / Kp / V / 2019)。

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