亚临界CO的化学组成及抑菌活性₂提取的Lepidium latifoliuml .(十字花科)

摘要

属Lepidium来自十字花科贝纳。科覆盖超过150种，几乎遍布世界各地。在哈萨克斯坦，有21种被描述，其中4种具有药用特性(l . crassifoliumWaldst。等装备。l . perfoliatumll . ruderaleL。,l . latifolium(L.)，在民间医药中用作抗菌、刺激、泻药、抗肿瘤、镇痛和驱虫作用的手段。方法．原材料从阿拉木图地区(哈萨克斯坦共和国)收集。Lepidium latifolium L。草本植物的二氧化碳提取物(CO₂通过亚临界二氧化碳萃取得到。采用气相色谱仪和质谱检测器测定提取物的成分组成。采用微量串联稀释法和纸片扩散法测定其抗菌活性。使用四种微生物试验菌株:葡萄球菌金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538 - p,大肠杆菌ATCC 8739，克雷伯氏菌肺炎写明ATCC 10031,白色念珠菌ATCC 10231。结果．毫无疑问，二氧化碳提取技术比传统的提取方法有优势:它对生物活性物质的种类有可控的选择性，允许深度提取，并最大限度地释放出植物中所含的丰富的化合物复合物。在本研究中，首先，CO₂提取物是在亚临界条件下从植物的地上部分获得的l . latifolium，并测定了其组成。己烷是CO的最佳溶剂₂共鉴定出40个成分。抗菌活性的筛选l . latifoliums₂提取物显示所有临床检测的显著菌株的基本活性:葡萄球菌金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，克雷伯氏菌肺炎,白色念珠菌．结论．研究表明，CO₂提取的原料Lepidium latifoliumL.含有生物活性化合物，表现出必要的抗菌作用，因此有可能推荐开发用于医疗实践的各种药物。

1.介绍

药用植物自古以来就有药用价值。它们是生物活性物质的宝贵来源，具有非常不同的生物和药理活性[1]．与合成药物相比，草药的特点是价格最低，容易获得，相对安全，毒性低，而且作用复杂，可用于预防和长期治疗不同的疾病[2]．

Lepidium包括超过150种，几乎遍布世界各地。在哈萨克斯坦，有21种物种，有3种地方病:l . karatavienseRegel Schmalh。,L. Rubzovii.Vassil。,l .阿尔贝蒂Pavl。［3.]．

有四种具有药用特性的品种(l . crassifoliumWaldst。等装备。l . perfoliatumll . ruderaleL。,l . latifoliumL.）并用于民间医学作为抗菌，刺激性，泻药，抗肿瘤，镇痛和吻合。含有皂苷，黄酮类化合物，生物碱，糖苷和单宁[4，叶子含有以下类固醇:胆固醇、豆甾醇和β谷甾醇[5]．

Lepidium latifolium是一种有前途的药用植物，一种多年生草本植物，高30-100(150)厘米，稍被短柔毛或裸露。根厚可达3-12毫米。茎直，上部有分枝。基生叶刚硬，椭圆形或卵状披针形，和锐尖;上面的叶披针形，小，几乎无柄。花是白色和小和收集在锥体圆锥花序。豆荚是卵形的，在先端没有一个缺口。种子宽椭圆形，几乎光滑。在5 - 8月开花结果。在哈萨克斯坦,Lepidium latifolium从平原到中山区，在草甸、盐沼、草原的盐碱地、潮湿的地方，沿着河谷，在作物中作为杂草生长，在居民区附近[6]．

一般的传播发生在欧洲、地中海国家、中亚和西亚、巴基斯坦、俄罗斯、西藏、喜马拉雅山、中国西部和东部、蒙古、北美和中美洲以及澳大利亚[7]．

l . latifolium已被报道为美国蒙大拿的入侵物种[8]．

根据文献记载，l . latifolium被用作草药产品、配菜、饮料，也是一种具有消炎、抗菌、利尿和滋补作用的草药植物[9]．该植物的西部喜马拉雅山生态型被用作治疗胃肠道的草药产品。在民间医学中，草药和根源的煎汤用于皮肤病，伤口，关节，疼痛，牙痛，腹水和神经和消化系统疾病的疾病[10.]．

自由基介导的氧化应激是许多慢性疾病和糖尿病的主要原因之一。的乙acetate-solublel . latifolium馏分是一种富含抗氧化剂的抗氧化剂来源，用于治疗与人代谢的氧化副产物相关的许多疾病，由于其具有强大的酚类化合物具有较强的自由基的能力。它也是治疗与人新陈代谢氧化产品相关的一些疾病的抗氧化剂潜在的抗氧化剂来源[11.]．

脂肪酸组成分析表明，被测植物叶片富含多不饱和脂肪酸，特别是亚油酸和亚麻酸，其含量达到50%。高葡萄糖和蛋白质含量，以及高氮硫比，也增加了这种植物的营养价值[12.]．

叶子和花l . latifolium含有Kaempferol-3-D-葡聚糖脲糖基-6-L- rhamnyAlyside和槲皮素-3-D-吡喃葡萄糖黄酮类化合物。它们每天用水用水消耗，以治疗风湿病的关节疼痛[13.]．硫香精已在干叶中鉴定l . latifolium，是清除肾结石和其他尿路阻塞的有力手段，突出其有效的利尿作用[14.]．

l . latifolium含有具有抗氧化、抗炎和甾体活性的黄酮类化合物，并对芳香化酶有抑制作用[15.]．

l . latifolium提取物具有细胞毒活性在体外，诱导多种人肿瘤细胞中caspase依赖的凋亡。经鉴定，上皮腈-1-氰基-2,3-上皮丙烷(CETP)为主要影响因素l . latifolium，积极杀死癌细胞[16.]．

栽培的多年生植物l . latifolium含硫糖苷，其中以苦苷和葡萄糖苷最为常见。并对所得提取物对致病菌和真菌的抗癌和抗菌活性进行了评价[17.]．因此,l . latifolium对其成分和治疗作用的进一步研究具有广阔的前景。

毫无疑问，二氧化碳提取技术比传统的提取方法有优势:它对生物活性物质的种类有可控的选择性，允许深度提取，并最大限度地释放出植物中所含的丰富的化合物复合物。与超临界萃取相比，亚临界二氧化碳萃取的优势如下:该工艺成本更低，技术更先进，最终产品更清洁[18.]．

在本研究中，我们获得了厚的CO₂在亚临界条件下从地下部分提取Lepidium latifoliuml．，探索了不同溶剂的成分组成，首次确定了其对病原微生物的抑菌活性。这项研究的结果使得可以使用该公司₂提取的Lepidium latifolium开发医疗用抗菌药物及化妆品．

2.材料和方法

2．1．植物材料

研究材料是开花的地上部分Lepidium latifoliumL.在2018年6月至2018年7月收集的萨尔玛·阿拉木图地区Enbekshikazakhsky地区的遗址（哈萨克斯坦共和国）（43°33.304'，078°25.748'e）。植物材料在阳光灿烂的日子阳光明媚的一天收集10:00，在25℃的温度下干燥草。

原料的干燥在良好的通风室内在+ 25±5℃的温度下进行。原料的水分含量为±6.35％。

这种植物是由哈萨克斯坦共和国生态、地质和自然资源部林业和野生动物委员会植物学和植物引种研究所鉴定的。

2．2．提取液的制备

Lepidium latifolium从原料的地上部分获得草的二氧化碳提取物，在实验室萃取装置(安装二氧化碳流动萃取- 5l)上以液态CO在亚临界条件下进行萃取₂作为萃取剂。获得亚临界CO的最佳条件₂提取压力45-51 atm，温度18-21℃，提取时间11 h。原料在KDU-2粉碎机上粉碎至1 - 3mm。原料用量2.6 kg，提取率为35 g(1.35%)。从外观上看，厚的亚临界CO₂提取的Lepidium latifoliuml是棕色的，有一种特殊的气味。

亚临界提取的使用增加了所提取物质的生物价值和安全性，而超临界二氧化碳提取则对所提取物质的安全性产生负面影响——一些耐热化合物会分解，从而破坏提取的完整性，同时污染最终产品[19.]．

为了确定成分组成，二氧化碳粗提取液溶解在以下溶剂中:正己烷(99.6%，Sigma-Aldrich)，甲醇(99.9%，Sigma-Aldrich)，乙酸乙酯(99.8%，AppliChem GmbH)和二氯甲烷(99.9%，Sigma-Aldrich)。0.1 g试验提取液溶解在10ml这些溶液中(0.01 g/ml)。

2.3。组分组成测定和组分识别

采用安捷伦7890B/5977A质谱检测器(GC-MS)进行气相色谱分析。色谱分析条件为:进样量:0.2μ.L与进样温度:240°С，无分流。采用WAXetr毛细管色谱柱进行分离，柱长30 m，内径0.25 mm，柱径0.25μ.M膜厚度在恒定的载气（氦气）速度为1ml / min。色谱温度从40℃（0分钟暴露）编程为260℃，加热速率为10℃/ min（20分钟暴露）。检测在扫描M / Z 34-850模式下进行。Agilent MSD Chem站软件（1701EA版）用于控制气相色谱系统，注册和处理所获得的结果和数据。数据处理包括确定检测时间间隔和峰面积的确定，以及使用质谱检测器获得的光谱信息的处理。Wiley第7版和NIST'02库用于识别所获得的质谱。

２.４.抗菌活性调查

检测4株微生物:革兰氏阳性菌(葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC 6538-P)、革兰阴性菌(克雷伯氏菌肺炎ATCC 10031，大肠杆菌写明ATCC 8739)和白色念珠菌ATCC 10231。

在标准营养培养基中进行微生物的敏感性研究：米勒·欣顿·艾格(М173)， HiMedia，印度Mueller Hinton Brooth（М391），希德米亚，印度Fluid Sabouraud medium (M013)， HiMedia，印度

确定抗微生物活性，浓稠的CO₂萃取物在己烷中溶解。

制备所需浓度的微生物悬浮液，用DEN-1密度计测定光密度(浊度)。在0.9% NaCl的盐溶液上制备微生物悬浮液。向试管中加入5ml生理盐水溶液，将试管置于密度计中，测量光密度。首先，用浓度为1.5 × 10的微生物悬液⁸ CFU/ml for bacteria was prepared, which corresponds to turbidity of 0.5 units according to McFarland; tenfold dilutions were made from these suspensions, transferring 1.0 ml of the suspension in 9.0 ml of sterile saline solution. Thus, a dilution of 1.5 × 10⁶细菌CFU/ml。对于蘑菇，用同样的方法制备悬浮液。菌悬液密度为2.0 × 10⁶CFU /毫升。

2.4.1。串行稀释方法

使用96孔板来确定抗微生物活性[20.，21.]．除第一口井外，所有井均加入Mueller-Hinton营养肉汤(用于检测细菌)和Sabouraud-dextrose肉汤(用于检测真菌)，添加量均为100μ.湖提取物的体积为100 μ.L进入第1孔，通过采用混合物进行连续稀释液（Muller-Hinton Broth / Sabouraud-Dextrose Brooth（100 μ.L) +试验药物(100μ.L))从第一口井中取量100μ.L到第二孔，已经包含100了μ.L的肉汤。将测试样品完全混合，然后以100的量转移μ.L从第二孔到第三孔的肉汤中，最初也含有100μ.L的肉汤。重复这个过程，直到达到所需的稀释次数。

经过一系列的稀释，20μ.所有孔均加试菌的L。在37±1℃温度下孵育18-24小时。在培养时间结束时，每孔用无菌环接种0.01 ml琼脂培养基。播种后，在37±1°C恒温器中放置18-24小时。

结果被认为是存在可见的微生物生长在稠密的营养培养基的表面。最低杀菌/杀真菌浓度(MBC/MFC)被认为是试验井中抑制微生物生长的最低浓度。

2.4.2。纸片扩散法

在整个Muller-Hinton琼脂表面的培养皿中预先播种密度为1.5 × 10的微生物悬浮液⁸CFU/ml，混悬液白色念珠菌浓度为7.5 × 10⁸CFU/ml用杯种于Saburo琼脂的整个表面[22.，23.]．接下来，椎间盘，预浸渍有二氧化碳提取物的研究浓度的己烷溶液（1000 μ.将G / ml）施用于接种培养物的表面。己烷被测试为对照样品。氨苄青霉素(10μ.G /盘)作为所有细菌的标准。氟康唑(25μ.G /光盘)光盘用于白念珠菌．将样品置于恒温器中37°C细菌孵育18-24小时白色念珠菌在22°C孵育48小时。结果是通过计算生长延迟/抑制区的直径，其精度为1 mm。

3.结果与讨论

3.1。CO中鉴定的化合物₂提取的Lepidium latifoliuml

在这项工作中，亚临界有限公司的植物化学组成₂提取的Lepidium latifoliumL.使用有机溶剂测定：己烷，甲醇，乙酸乙酯和二氯甲烷。GC / MS筛选揭示了己烷是二氧化碳提取物的最佳溶剂。如图所示1结果表明，生物活性物质在正己烷溶液中产率最高(40个化合物)，在甲醇溶液中产率最高(8个化合物)，在乙酸乙酯和二氯甲烷溶液中产率最高(17个化合物)和26个化合物。

在亚临界Со中发现的主要成分₂提取物为植物甾醇，如β-谷甾醇，油菜甾醇，豆甾醇和二萜，如叶绿醇，维生素E和脂肪酸(表1,图2）.它们具有显著的特异性药理活性，特别是抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗氧化[24.- - - - - -27.]．在定量方面，这些物质的含量在己烷溶液中占主导地位:β-谷甾醇(12.71%)、菜油甾醇(2.8%)、豆甾醇(1.76%)、叶绿醇(7.3%)和维生素E(10.84%)。除豆甾醇外，所有这些化合物均可在其他溶液中观察到;例如，内容β- 甲醇溶液中的-Sitosterol为11.8％，在乙酸乙酯中，二氯甲烷溶液为9.6％，6.12％，乙酸乙酯和二氯甲烷溶液中的炉灶含量为1.9％和1.21％，而在甲醇溶液中未鉴定它．甲醇溶液中的植物含量为7.3％，在乙酸乙酯和二氯甲烷溶液中，其含量分别为3.6％和3.9％。

值得注意的是β-谷甾醇具有抗菌潜力。当学习与伤寒沙门氏菌和大肠杆菌菌株的生长抑制带分别为20 mm和35 mm [28.]．a的活动β-谷甾醇氯仿提取物m . parviflora根反对S.金黄色葡萄球菌和大肠杆菌研究了(29.]．它已被证实β-谷甾醇具有显著的抗炎作用，作为最重要的草本成分之一，由于其来源广泛和无毒的天然特性，具有成为抗炎药物的潜力[30.]．Stigmasterol表现出对耐甲氧西林的抗菌活性葡萄球菌金黄色葡萄球菌［31.]，并已被证明在两阶段癌变中显著抑制肿瘤进展[32.]．植物甾醇的提取物（β-Sitosterol，Camperterol，Stigmasterol和Lanteroll）的达尔群泥膜显示出较强的抗菌活性铜绿假单胞菌(22.2±0.59 mm)答:尼日尔(14.5±0.25 mm) [33.]．

最近的研究表明，叶绿醇具有抗焦虑、代谢调节、细胞毒性、抗氧化、诱导自噬和凋亡、抗炎、免疫调节和抗菌作用[34.]．

3.2。抗微生物活性的结果

当用连续稀释法和圆盘扩散法测定其抑菌活性时，测定了二氧化碳提取物的正己烷溶液的抑菌和抑菌活性Lepidium latifolium建立了与分析的微生物菌株-金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，k .肺炎,白念珠菌（表格2和3.）.以往的研究证实了其抗菌活性Lepidium latifolium。二氯甲烷提取物和异硫氰酸烯丙酯(硫代葡萄糖苷的降解产物)l . latifolium对细菌有明显的抑制活性，如葡萄球菌金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌,白念珠菌［35]．从乙醇提取物中分离出的具有酚羟基的化合物l . latifolium对四种菌株表现出显著的抗菌活性:枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌,铜绿假单胞菌［36.]．

连续稀释试验结果表明，亚临界CO的正己烷溶液具有一定的抑菌活性₂提取的Lepidium latifoliuml．有最高的抗菌活性S.金黄色葡萄球菌，Kl.肺炎,白念珠菌浓度为32μ.g / ml;对大肠杆菌在美国，它在浓度为125时具有确定的杀菌活性μ.克/毫升(图3.）.

在研究亚临界一氧化碳己烷溶液的有效性时₂提取的Lepidium latifoliuml．，采用圆盘扩散法获得与使用的抗生素标准相比生长抑制带高值的数据。试验菌株的生长延迟带为18.33±0.57Kl.肺炎， 17.1±1.0相对大肠杆菌， 20.2±1.0S.金黄色葡萄球菌．抑菌活性白念珠菌生长迟滞带达19.33±0.57 mm。生长迟滞区反对S.金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，Kl.肺炎,白念珠菌具有抗生素的作用的菌株分别为15.6±0.57mm，分别为12.3±0.57mm，12.3±0.57mm，分别为14.0±0.0mm。它也被发现己烷作为对照没有显示对微生物培养的抗微生物活性（图4）.高活性的生长带延迟直径大于15 mm，中等活性的生长带延迟直径10 - 15 mm，低活性的生长带延迟直径小于10 mm，这是有条件接受的[37.]．

近年来，人类病原体对所使用的合成抗生素产生了耐药性，导致传染病的严重程度增加。一些抗生素的副作用和罕见感染的出现促使科学家寻找新的抗菌药物。筛选植物提取物使其成为潜在的抗菌剂来源[38.]．

4.结论

аco.₂从天线部分提取Lepidium latifolium对其生药进行了分离，并对其化学成分进行了测定。在所有测试的溶剂中，正己烷是溶解提取物的最佳溶剂，因为正己烷溶液具有更丰富的生物活性物质。主要成分为植物甾醇、二萜、维生素E和脂肪酸。

在二氧化碳提取液的所有溶液中，主要成分是β-Sitosterol含量在己烷溶液中达到12.71％和甲醇，乙酸乙酯和二氯甲烷溶液，分别为11.8％，9.6％和6.12％。除甲醇外，坎贝格尔出现在所有溶液中，而Stigmasterol仅在1.76％的己烷溶液中鉴定。除了乙酸乙酯之外，所有溶液中存在维生素E.将其最大产量记录在甲醇溶液中。根据科学文献，所呈现的生物活性物质具有非常有价值的药理学作用，例如抗微生物，抗炎，抗肿瘤等。

抗微生物活性筛选的结果表明CO的己烷溶液₂提取的Lepidium latifoliumL.对所有测试菌株进行抗菌活性（S.金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，Kl.肺炎,白念珠菌)，用连续稀释法和琼脂扩散法。

因此，首次，在来自空中部分的亚临界条件下获得二氧化碳提取物Lepidium latifolium并在不同溶剂下测定了其植物化学成分。结果表明，正己烷是最佳提取溶剂。大量的β-谷甾醇、油菜甾醇、豆甾醇、叶绿醇和维生素E。发现己烷溶液中CO₂经证实，该提取物具有一定的抗菌作用在体外．

这项研究的结果使得可以使用该公司₂提取的Lepidium latifolium开发医疗用抗菌药物及化妆品。这方面的研究正在继续进行。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者要感谢全体教职员工，以及药学院和制药技术学院的博士生，感谢他们对这项工作的支持。

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