皮肤致敏试验中生物可降解聚合物诱导THP-1细胞产生CD54

摘要

目前，各种化学品、生物可降解聚合物和生物材料的皮肤致敏试验的非动物方法正在开发中，希望消除使用动物。人类细胞系活化试验(h-CLAT)是一种模拟树突状细胞(DCs)功能的皮肤致敏评估。树突状细胞是特化的抗原提呈细胞，它们与T细胞和B细胞相互作用，引发免疫反应。DCs的表型改变，如CD86和CD54的产生以及MHC II类分子的内化，已成为皮肤增敏试验的重点。在本研究中，我们使用h-CLAT来评估生物可降解聚合物的影响。结果表明，几种可生物降解聚合物增加了CD54的表达，可生物降解聚合物的相对皮肤增敏能力为PLLG (75: 25) < PLLC (40: 60) < PLGA (50: 50) < PCG(50: 50)。这些结果可能有助于为在支架或过敏原危害中使用生物可降解聚合物制定新的指南。

1.介绍

直到最近，皮肤致敏研究还使用豚鼠最大化试验（GPMT）[1.–3.].目前，局部淋巴结分析（LLNA）[4.,5.]LLNA的优点是能够进行剂量依赖性评估、减少动物使用、缩短实验时间和降低成本[6.,7.］.此外，一项禁止使用动物对新材料进行安全测试的运动正在世界各地蔓延[8.]最近，Ashikage等人（2006年）[9]Sakaguchi等人（2006年）[10]，若干实验室报告使用了一种替代动物实验的新方法，即人类细胞系激活试验(h-CLAT) [11,12］.

树突状细胞（DC）与皮肤和鼻、肺、胃和肠的内层接触[13］.它们也可以在血液中处于未成熟状态。来自病毒和微生物的抗原不仅在树突状细胞中诱导适应性免疫反应，而且还诱导先天免疫以激活免疫系统[14–16].当皮肤出现致敏反应时，树突状细胞向次级淋巴器官迁移，形成幼稚的T细胞[17].然后，未成熟DC成熟和细胞间粘附分子、共刺激分子和主要组织相容性复合体II（MHC II）抗原（CD54、CD86、HLA-DR抗原）[18–21］.在没有共刺激分子的情况下，树突状细胞的免疫反应仍然较弱。因此，皮肤敏化在在体外实验通过CD54和CD86的表达来判断。

THP-1细胞是一种人单核细胞系，用于h-CLAT中代替DCs。我们可以评估THP-1细胞的表型改变。在目前的研究中，我们通过以下方法评估皮肤对可生物降解聚合物的敏感性在体外措施。

2.材料和方法

2.1.细胞培养

从美国类型培养收集(Manassas, Va, USA)购买的THP-1细胞在RPMI培养基1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA)中添加10%胎牛血清(FBS, Intergen, Purchase, NY, USA)、0.05 mM 2-巯基乙醇(GIBCO)和1%链霉素(GIBCO)培养。用于试验的细胞年龄在2周到2个月之间。

2．2.生物可降解聚合物及其处理

生物可降解聚合物P1至P6（表1.)从日本兵库市立基化学有限公司(Taki Chemical Co.， Ltd.)获得。我们将生物可降解聚合物溶解在二甲基亚砜(DMSO, Sigma, Ayrshire, UK)中，制成了6种原始溶液。将生物可降解聚合物P1、P2、P3、P4、P5和P6分别溶于DMSO中。2,4-二硝基氯苯(DNCB, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA)也溶解在DMSO中，用作皮肤致敏试验的阳性对照。我们用两倍稀释系列制作了每种聚合物的6个子库存溶液。这些子库存溶液用RPMI培养基1640稀释20倍。最后，将工作溶液稀释100倍加入细胞中。

2.3.流式细胞仪分析

细胞接种于96孔板(Corning, Corning, NY, USA)，密度为(细胞/ 160μL/井）和工作溶液，并在有限公司培养_2.24小时孵化器 h、 将培养的细胞移入V形培养板（BMbio，日本东京），然后在700℃下离心收集细胞 ×g为3 用流式细胞仪缓冲液（PBS+0.1%BSA）洗涤细胞3次，用200 μL 0.01% Cohn分数II和III (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)冷冻15分钟。离心后将上清液从培养皿中取出。将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人CD86抗体(CD86, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)，单克隆小鼠抗人CD54, ICAM-1/FITC抗体(CD54, Dako，丹麦)，或小鼠IgG1/FITC抗体(IgG, Dako)加到平板上，遮光30分钟。用FACS缓冲液清洗3次。最后，细胞在400重悬μL FACS缓冲液，并在BD FACSCalibur细胞分选机(Becton Dickinson Co.， Ltd, Franklin Lakes, NJ, USA)上进行流式细胞术，分析细胞表面的CD标记物。

2.4.细胞活力的碘化丙啶测定

流式细胞术中，碘化丙啶(PI, 0.625μ向悬浮细胞中加入g/mL）以测量活细胞数。每次试验一式三份，每次用BD FACSCalibur流式细胞仪计数10000个活细胞。

2.5.相对荧光强度

我们使用Flowjo计算机程序从PI染色的死细胞中分离活细胞。我们通过测量CD86、CD54和IgG的荧光强度来评估可生物降解聚合物引起的皮肤致敏。在细胞存活率低于50%的情况下，存在细胞壁损伤和抗体不规则结合的可能性。因此此外，我们通过计算相对荧光强度（RFI）来测量细胞活力，如下所示，通过CD86和CD54的表达水平。 *MFI：（几何）荧光强度的平均值。

3.结果

3.1.通过PI测定的细胞活力

阳性对照DNCB检测THP-1细胞的细胞活力和CD标记物的表达水平。DNCB 5.2g/mL可产生较高的RFI表达水平，而细胞活力变化极小。同时，我们测试了DMSO溶剂随时间变化对细胞活力的影响(图)1.)在DNCB和DMSO的24小时孵育过程中，细胞存活率没有变化。这些结果表明，24小时孵育和5.2 g/mL DNCB为皮肤致敏试验的适宜培养时间和浓度。

接下来，我们测试了可生物降解聚合物对THP-1细胞活性的影响。将细胞与不同浓度的可生物降解聚合物一起培养24小时，并进行PI测定（图1）2.）.结果表明，生物可降解聚合物对细胞活性的影响不同。然而，细胞活力下降的趋势与聚合物浓度成正比。样品P6未被检测，因为它在2 mg/mL时不溶解。

３.２．CD54和CD86标记物的表达(替代RFI)

培养24小时后，通过测量CD86和CD54免疫标记物的荧光强度，确定作为皮肤致敏指数的RFI变化。CD54 RFI随所有聚合物浓度的增加而剂量依赖性增加（图3.）.相反，在所有聚合物溶液中，CD86 RFI均降低。这些结果表明，随着可降解聚合物浓度的增加，只有CD54标记物表达。P1、P3、P5和P6产生了高皮肤致敏性，RFI达到200。特别是，P6的RFI超过200，达到250μg/mL。

3.3.可生物降解聚合物中CD54的估计浓度

来自RFI实验（图3.)，我们知道一些可生物降解的聚合物只导致树突状细胞上CD54共刺激分子的表达。根据前人的研究，有效浓度(EC) 200 (CD54)和EC150 (CD86)成为判断CD54病例皮肤致敏的标准。P1、P3、P5和P6在表中所示的聚合物浓度下，通过这种方法估计可引起皮肤敏化2.．

4.讨论

由于DC在皮肤致敏中的作用已为人所知，利用人类外周血进行的研究已经扩大，但由于血液中DC的数量有限，其应用受到限制[22,23］.CD54和CD86标记物的表达水平已被证明与皮肤的敏感性密切相关[24,25]以前的研究已经为CD86设定了RFI值标准(≥150%）和CD54(≥200%) [26,27].在本研究中，我们使用h-CLAT作为在体外皮肤致敏方法，并研究生物可降解聚合物是否利用这些标记物致敏皮肤在体外．首先采用流式细胞术几何方法统计这些标记物在细胞上的表达水平，然后根据RFI公式计算RFI值。在以前的研究中，那些能够刺激CD86达到150%或更高，CD54达到200%或更高的聚合物被认为是增敏剂。

最初，我们测试了DNCB和DMSO随时间对细胞活力的影响。当假设中浓度组的细胞活力为100%时，DMSO组的细胞活力仅出现微小变化。48小时后，DMSO组和中浓度组的细胞活力仅略有下降。结果表明，溶剂DMSO不会改变细胞活力（图1.)。此外，增加5.2 μg/mL的DNCB对细胞的作用在24小时内都不会导致细胞活力的大变化。然而，在48小时，细胞活力下降到60%以下。因此，以DNCB作为皮肤敏化的阳性对照，在24小时后测量标记物最为合适。

我们用生物可降解聚合物培养所有样本，并在24小时时测量细胞活力和CD54和CD86的表达水平。每种聚合物对细胞活力产生不同的影响（图1）2.）.结果发现，聚合物P4随着剂量的增加，细胞活力急剧下降;因此，它可能是毒性最大的可生物降解聚合物。聚合体P1和P5在最高浓度时细胞活力达到70%以上。因此，它们对细胞活力的影响被认为是微弱的。

这些聚合物增加了CD54标记物的表达，但没有增加CD86标记物的表达(图)3.)。P1、P3、P5和P6聚合物刺激CD54标记物的高表达水平。P1和P5刺激CD54标记物的高表达水平，但不影响细胞活力。P4产生的CD54标记物的表达最低，所有聚合物的细胞活力最低。这些结果表明，可生物降解聚合物ct仅显示CD54标记物，其组成不同。

在过去的几十年里，生物可降解聚合物已被用于临床医学，据报道它们有最小到更实质性的副作用[28,29］.一般来说，由于生物医学材料的长期使用，部分磨损和炎症会导致抗原-抗体反应延迟。本研究提示CD54与延迟的抗原-抗体反应有一定的关系。人们认为有必要将生物可降解聚合物对树突状细胞的影响结果与局部淋巴结检测(LLNA)的结果进行比较。

5.结论

到目前为止，可生物降解的聚合物还很少被研究作为导致在体外致敏作用。我们通过h-CLAT测试了可生物降解聚合物。我们无法评估P4，因为即使是低浓度的P4也会导致细胞死亡。此外，P2不会增加皮肤致敏作用。显示导致皮肤致敏作用的可生物降解聚合物仅表达为CD54，为PLLG（75 : 25）

致谢

我们衷心感谢Kao公司（Tochiki，日本）的Nukada Yuko博士、Abo Takayuki博士、Ito Yuichi博士、Nishiyama博士和Kawai Shuji博士感谢他们的宝贵建议。我们还感谢TAKI CHEMICAL CO.，LTD.的Okada先生和M.Terao先生，他们的物质制备为我们的工作做出了巨大贡献。最后，我要感谢MHLW的资助，使我们能够完成这项研究。

参考文献

1. T. Maurer，“超敏试验中的豚鼠”方法，第41卷，第1期，第48-53页，2007年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
2. I. Kimber, D. A. Basketter, K. Berthold等人，“皮肤致敏试验的效力和风险评估”，毒物学的科学，第59卷，第59期2，页198-208,2001。视图:谷歌学术搜索
3. R. Kreiling, H. M. Hollnaqel, L. Hareng等，“通过小鼠局部节点试验(LLNA)和豚鼠最大化试验(GPMT)评估的不饱和化合物皮肤致敏潜力的比较”，食品和化学毒理学第46卷，第46期第6页，1896-1904,2008。视图:谷歌学术搜索
4. I. Kimber, R. J. Dearman, E. W. Scholes, D. A. Basketter，“局部淋巴结试验的发展和应用”，毒理，第93卷，第1期，第13-31页，1994年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
5. G. F. Gerberick, C. A. Ryan, R. J. Dearman, I. Kimber，“局部淋巴结试验(LLNA)用于检测化学物质的致敏能力”，方法号，第41卷。1，页54-60,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
6. R. J. Dearman, D. A. Basketter和I. Kimber，“局部淋巴结检测:在危害和风险评估中的应用”，应用毒理学杂志第19卷第2期5，页299-306,1999。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
7. M. Takeyoshi, K. Iida, K. Shiraishi, S. Hoshuyama，“通过局部淋巴结试验的非放射性同位素修饰，根据皮肤致敏性的化学物质分类的新方法”，应用毒理学杂志，第25卷，第2期2，页129-134,2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
8. Y. Ohno，《药物科学中替代动物实验研究的重要性》，Yakugaku Zasshi，第128卷，第5期，第735-740页，2008年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
9. T. Ashikaga, Y. Yoshida, M. Hirota等人，“利用人类细胞系开发体外皮肤致敏试验:人类细胞系激活试验(h-CLAT)。I. h-CLAT协议的优化体外毒理学，第20卷，第2期。5，第767-773页，2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
10. H.Sakaguchi，T.Ashikaga，M.Miyazawa等人，“利用人类细胞系开发体外皮肤致敏试验；人类细胞系活化试验（H-CLAT）II.H-CLAT的实验室间研究，”体外毒理学，第20卷，第2期。5，页774-784,2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
11. U. Neisius, P. Brand, S. Plochmann, J. Saloga, J. Knop，和D. Becker，“接触致敏剂刺激后小鼠朗格汉斯细胞中酪氨酸磷酸化的增加检测”皮肤病学研究档案，第291卷，第1期，第22-27页，1999年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
12. B.C.Hulette、C.A.Ryan和G.F.Gerberick，“阐明化学过敏原治疗后树突状细胞表面标记物表达的变化，”毒理学与应用药理学号，第182卷。3，页226-233,2002。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
13. T.Ashikaga，H.Sakaguchi，K.Okamoto等人，“皮肤致敏的人类细胞系活化试验（H-CLAT）的评估；第一次日本实验室间研究的结果，”动物试验的替代方案，第13卷，第1期，第27-35页，2008年。视图:谷歌学术搜索
14. E. S. Trombetta和I. Mellman，“体外和体内抗原处理的细胞生物学”，免疫学年度回顾，第23卷，第975-1028页，2005年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
15. M. Brandes, K. Willimann，和B. Moser，《免疫学:人类专业抗原呈递功能》γδ细胞，”科学号，第309卷第2页，第2 - 3页，2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
16. C.Moulon，J.Peguet Navarro，P.Coutellemont，G.Redziniak和D.Schmitt，“新鲜和培养的人表皮朗格汉斯细胞对半抗原特异性T细胞的体外初级致敏和再刺激，”免疫学，第80卷，第3期，第373-379页，1993年。视图:谷歌学术搜索
17. P. Hamrah和M. R. Dana，《角膜抗原递呈细胞》化学免疫学与过敏症， vol. 92, pp. 58-70, 2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
18. V. Vidal, J. Dewulf，和G. M. Bahr，“通过合成免疫调节剂Murabutide增强单核细胞来源的未成熟树突状细胞的成熟和功能能力，”免疫学，第103卷，第4期，第479-487页，2001年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
19. S. Aiba, A. Terunuma, H. Manome，和H. Tagami，“树突状细胞通过产生细胞因子和表达共刺激分子，对半抗原和刺激物有不同的反应，”欧洲免疫学杂志，第27卷，第11期，第3031-30381997页。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
20. K.D.Coutant、A.B.D.De Fraissinette、A.Cordier和P.Ulrich，“化学半抗原、金属过敏原和葡萄球菌超抗原对人类单核细胞衍生树突状细胞活性的调节，”毒物学的科学，第52卷，第2期，第189-198页，1999年。视图:谷歌学术搜索
21. M. S. Muthu和S. Singh，“利培酮生物可降解聚合物纳米颗粒的研究:体外和体内评估”，纳米医学，第3卷，第2期。3，页305 - 319,2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
22. Liu K.， C. Waskow, X. Liu, K. Yao, J. Hoh, M. Nussenzweig，“小鼠外周血淋巴器官中树突状细胞的起源”，自然免疫学，第8卷，第2期6，页578-583,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
23. P. Hubert, L. Bousarqhin, R. Greimers, E. Rranzen-Detrooz, J. Boniver，和P. Delvenne，“体外产生大量具有上皮内迁移能力的朗格汉斯细胞”，实验皮肤病学，第14卷，第6期，第469-477页，2005年。视图:谷歌学术搜索
24. C.Moulon，J.Peguet Navarro，P.Coutellemont，G.Redziniak和D.Schmitt，“新鲜和培养的人表皮朗格汉斯细胞对半抗原特异性T细胞的体外初级致敏和再刺激，”免疫学，第80卷，第3期，第373-379页，1993年。视图:谷歌学术搜索
25. H. Rizova, P. Carayon, A. Barbier, F. Lacheretz, L. Dubertret，和L. Michel，“接触过敏原，而不是刺激物，改变了人类表皮朗格汉斯细胞受体介导的内吞作用，”英国皮肤病杂志，第140卷，第2期，第200-209页，1999年。视图:谷歌学术搜索
26. T. Ashikaga, M. Hoya, H. Itagaki, Y. Katsumura, and S. Aiba，“评估THP-1人单核细胞中CD86表达和MHC II类分子内化作为接触致敏剂的预测终点”体外毒理学，第16卷，第5期。6，第711-716页，2002。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
27. Y.Yoshida、H.Sakaguchi、Y.Ito、M.Okuda和H.Suzuki，“使用共刺激分子CD54和CD86在原始THP-1细胞系上的表达评估化学品的皮肤致敏潜力，”体外毒理学，第十七卷，第二期2，页221-228,2003。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
28. K.Greish，“增强大分子药物在实体肿瘤中的渗透性和保留力：靶向抗癌纳米药物的皇家大门，”药物靶向杂志，第15卷，第5期。7-8，页457-464,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
29. S. D. Bruck和E. P. Mueller，“受控药物释放系统中合成聚合物的材料和生物学方面:问题和挑战”，治疗性药物载体系统综述，第5卷，第3期，第171-187页，1988年。视图:谷歌学术搜索

版权

版权所有©2011 Yeon Suk Jung等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原作被正确引用。