IJBM 国际期刊的生物材料 1687 - 8795 1687 - 8787 Hindawi出版公司 424571年 10.1155 / 2011/424571 424571年 研究文章 可生物降解聚合物诱导CD54 THP-1细胞在皮肤敏感试验 荣格 Yeon Suk 1、2 加藤 玲子 1 土屋 Toshie 1、3 Labow 罗莎琳德 1 的医疗设备 国家健康科学研究所 1-18-1 Kamiyoga Setagaya-ku 东京158 - 8501 日本 nihs.go.jp 2 部门的泌尿学 新泽西癌症研究所 罗伯特。伍德。约翰逊医学院 新布伦瑞克 新泽西08901 美国 cinj.org 3 医学转化研究中心 大阪大学医院 男童Yamadaoka Suita、大阪565 - 0871 日本 osaka-u.ac.jp 2011年 2 8 2011年 2011年 05年 01 2011年 18 05年 2011年 08年 06 2011年 2011年 版权©2011 Yeon Suk荣格et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

目前,另皮肤敏化测试的方法对各种化学品,生物可降解聚合物和生物材料正在开发,希望消除使用动物。人类细胞系激活测试(h-CLAT)是一种皮肤敏化评估模仿树突状细胞(dc)的功能。DCs是专门的抗原递呈细胞,他们与T细胞和B细胞启动免疫反应。dc表型变化,如生产CD86和CD54的内化MHC II级分子,已成为焦点的皮肤敏感试验。在这项研究中,我们使用h-CLAT评估生物降解聚合物的影响。结果表明,几种可生物降解聚合物CD54的表达增加,和可生物降解聚合物的相对皮肤敏化能力PLLG(75: 25) <事务所(40:60)< PLGA (50: 50) < PCG (50: 50)。这些结果可能导致创建新的指南的使用可降解聚合物支架或过敏的危险。

 1。介绍

直到最近,研究豚鼠皮肤敏化利用的最大化测试(GPMT) [ 1- - - - - - 3]。目前,当地淋巴结试验(LLNA) [ 4, 5通常被用作替代GPMT。LLNA的优点是能够使评价存在剂量依赖的相关性,减少动物使用量,缩短实验时间,和更低的成本 6, 7]。此外,运动,禁止使用动物进行安全测试新材料在世界范围内传播的 8]。最近,Ashikage et al。(2006) 9),坂口et al。(2006) 10)和几个实验室报告的使用新的替代动物实验,人类细胞系激活测试(h-CLAT) [ 11, 12]。

树突状细胞(dc)是接触皮肤和鼻子的内衬,肺,胃,肠( 13]。他们也可以发现血液中处于不成熟状态。不仅从病毒和微生物抗原诱导适应性免疫反应在DCs还引起先天免疫激活免疫系统( 14- - - - - - 16]。当皮肤敏化发展,DCs移民到二级淋巴器官出现幼稚T细胞( 17]。然后,未成熟dc成熟和细胞间粘附分子,costimulatory分子,和二主要组织相容性复合体(MHC II)抗原(CD54、CD86 HLA-DR抗原)( 18- - - - - - 21]。DCs的免疫反应没有costimulatory分子依然疲软。因此,皮肤敏化 在体外实验是根据CD54和CD86的表达。

THP-1细胞,人类单核细胞细胞系,可用于代替h-CLAT DCs。我们可以评估这些THP-1细胞表型的改变。在目前的研究中,我们评估皮肤敏化生物可降解聚合物 在体外措施。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养

THP-1细胞从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)是培养介质RPMI 1640 (GIBCO,宏伟的岛,纽约,美国)补充10%胎牛血清(美国纽约的边后卫,集,购买),0.05毫米2-mercaptoethanol (GIBCO),和1%链霉素(GIBCO)。测试中使用的细胞之间2周,2个月大。

 2.2。生物可降解聚合物及其治疗

生物可降解聚合物P1 P6(表 1)从塔基•化工有限公司有限公司(日本兵库县)。我们6初始可生物降解聚合物解决方案通过溶解在二甲亚砜(DMSO,σ,埃尔郡,英国)。生物可降解聚合物P1, P2, P3, P4, P5, P6在DMSO溶液分别溶解。4-Dinitrochlorobenzene (DNCB Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)也被溶解在DMSO溶液,用作积极控制皮肤敏感试验。我们做了6 substock每个系列聚合物稀释使用轻松的解决方案。这些sub-stock解决方案与RPMI介质1640稀释20倍。最后,工作的解决方案添加到细胞稀释100倍。

条件和可生物降解聚合物的成分。

样本 生物可降解聚合物 作文 Mn * 催化剂
P1 聚l-lactide-glycolide共聚物)(PLLG) 75:25 3540年 没有
P2 聚l-lactide-glycolide共聚物)(PLLG) 75:25 3580年 SnOct2
P3 聚X L-lactide-glycolide)共聚物(PLGA) 50:50 3550年 没有
P4 聚l丙交酯)(丙交脂) One hundred. 3390年 没有
P5 聚l-lactide-caprolactone共聚物)(事务所) 40:60 3110年 没有
P6 聚己内酯乙交酯共聚物)(PCG) 50:50 3000年 没有

*数量平均分子量(Mn)。

 2.3。流式细胞术分析

细胞被播种在96孔板(美国纽约康宁,康宁公司)的密度 1.6 × 10 5 (细胞/ 160 μ信用证)的工作解决方案和种植有限公司224小时的孵化器。培养细胞被转移到v型文化板块(BMbio、东京、日本),然后离心法收集的细胞在700 g×3分钟。这些细胞被洗3次使用流式细胞仪缓冲区(PBS + 0.1% BSA)。他们用200年被封锁 μL 0.01%的球蛋白科恩分数II和III (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)15分钟在冰上。使离心后的上层清液被移除板。异硫氰酸荧光素(FITC)共轭鼠标反人类的CD86抗体(BD Pharmingen CD86,圣何塞,CA,美国),鼠标反CD54单克隆,ICAM-1 / FITC抗体(CD54、Dako、丹麦),或鼠标IgG1 / FITC抗体(免疫球蛋白,Dako)添加到盘子,盘子是阴影的光为30分钟。板块与流式细胞仪缓冲洗3次。最后,这些细胞被resuspended在400年 μL流式细胞仪缓冲和受到流式细胞术BD FACSCalibur细胞分选仪(Becton Dickinson有限公司,富兰克林湖,新泽西,美国)分析CD的细胞表面标记。

 2.4。Propidium碘测定细胞的生存能力

在流式细胞仪分析,propidium碘(π,0.625 μg / mL)添加到测量悬浮细胞活细胞的数量。每个测试做了一式三份,10000活细胞被BD计算每次FACSCalibur流式细胞分析仪。

 2.5。相对荧光强度

我们分开的活细胞坏死细胞PI-dyed使用Flowjo计算机程序。我们评估了皮肤敏化引起的生物可降解聚合物通过测量CD86的荧光强度,CD54和免疫球蛋白。不到50%细胞生存能力,有可能破坏细胞壁和不规则的绑定的抗体。因此,我们测量细胞生存能力通过计算相对荧光强度(RFI)如下所示CD86和CD54的表达水平。 RFI ( % ) = 小额信贷机构 的 细胞 与 聚合物 - - - - - - 小额信贷机构 的 同形像统计图 控制 细胞 与 聚合物 小额信贷机构 的 车辆 控制 细胞 - - - - - - 小额信贷机构 的 车辆 同形像统计图 控制 细胞 × One hundred. * MFI:(几何)平均荧光强度。

 3所示。结果 3.1。细胞生存能力通过π化验

DNCB,积极控制,是用来测试细胞生存能力和表达水平THP-1 CD标记的细胞。DNCB 5.2 μ 产生高g / mL RFI表达水平,而细胞生存能力的变化是微乎其微的。与此同时,我们测试了DMSO溶剂对细胞活力的影响随着时间的推移(图 1)。细胞的异常并没有改变在24小时孵化DNCB和DMSO溶液。这些结果表明,24小时孵化和5.2 μ g / mL DNCB是一个适当的培养时间和浓度对皮肤敏感试验。

比较细胞的异常积极的控制、溶剂和媒介。所有细胞的异常都是衡量进展的时候了。(一)1640年RPMI介质细胞生存能力,(b)细胞生存能力在DMSO (2 μL /毫升),(c)细胞生存能力DNCB (5.2 μg / mL)和(d)与DNCB CD54和CD86表达水平随着时间的推移(5.2 μg / mL)。

接下来我们测试了可生物降解聚合物的影响THP-1细胞的异常。这些细胞被孵化24小时与不同浓度的生物可降解聚合物和π试验(图 2)。结果表明,细胞的异常不同取决于可生物降解的聚合物。然而,减少细胞的异常的倾向与聚合物的浓度成正比。样本P6没有测试,因为它不溶解在2毫克/毫升。

生物可降解聚合物浓度对细胞生存能力的影响。THP-1与可生物降解聚合物溶解细胞孵化24小时。使用流式细胞仪和π(0.625 μg / mL),只有活细胞在总细胞数。(一)P1, P2, (b) (c) P3, P4 (d), (e) P5, (f) P6,自备:没有测试。

 3.2。CD54的表达和CD86标记(替代RFI)

24小时孵化后,皮肤敏化RFI作为指数的变化是由测量CD86和CD54免疫标记的荧光强度。CD54 RFI增加剂量依赖性增加浓度的聚合物(图 3)。相比之下,CD86 RFI减少所有的聚合物解决方案。这些结果表明,降解聚合物的浓度增强,只有CD54表达标志。P1, P3、P5和P6高皮肤敏化产生如图所示的RFI达到200。特别是,RFI P6显示在250年超过200 μ克/毫升。

RFI结果为每一个可生物降解的聚合物。只选择了活细胞通过π染料。接下来,我们显示活细胞FITC直方图,然后显示几何学的力量的意思。RFI(%)计算几何学的意思是所描述的测试。(一)P1, P2, (b) (c) P3, P4 (d), (e) P5, (f) P6,自备:没有测试。

 3.3。估计CD54在可生物降解聚合物的浓度

从射频识别实验(图 3),我们知道一些可生物降解聚合物的原因只有CD54的表达costimulatory树突细胞分子。基于之前的研究,有效浓度(EC) 200 (CD54)和EC150 (CD86)成为了皮肤敏化在CD54的情况下判断的标准。P1, P3、P5和P6被这种方法估计导致皮肤敏化,聚合物浓度的表所示 2。

EC 200可生物降解聚合物的影响。

样本 低的星期五 低浓缩的。 高射频识别 高浓缩的。 电子商务(毫克/毫升)
一个 b c d
P1 174.00 1.00 265.00 2.00 1.29
P3 178.00 0.62 250.00 1.25 0.81
P5 104.00 0.50 212.00 1.00 0.94
P6 108.00 0.13 236.00 0.25 0.21

公式:EC200 = ( d - - - - - - b )/ ( c - - - - - - 一个 ) × ( 200年 - - - - - - 一个 ) + b 。

 4所示。讨论

DCs在皮肤敏化的作用以来,研究使用人类外周血扩张,但它的使用限制血液中由于有限数量的DCs ( 22, 23]。标记CD54的表达水平和CD86已经证明是敏感皮肤是如何密切相关( 24, 25]。先前的研究已经设置RFI值标准CD86(≥150%)和CD54 (≥200%) 26, 27]。在这项研究中,我们使用h-CLAT作为 在体外皮肤敏化方法和调查是否可降解聚合物使敏感肌肤使用这些标记 在体外。这些标记细胞的表达水平是首先计算几何的流式细胞术,然后RFI的RFI值计算公式。聚合物,刺激CD86在150%或以上,CD54在200%或更多被判定为增敏剂如先前的研究。

最初,我们测试了DNCB和DMSO对细胞活力的影响。当细胞的可行性中浓度组被认为是100%,DMSO组的细胞生存能力显示只有极小的改变。48小时后,细胞生存能力的DMSO组和中浓度组仅略有下降。结果表明,细胞生存能力是由溶剂DMSO(图没有改变 1)。此外,添加5.2 μ克/毫升DNCB细胞没有导致大变化在细胞存活24小时。在48小时内,细胞生存能力已经下降到低于60%。因此,使用DNCB作为积极控制皮肤敏化是最合适的标记时测量24小时后。

我们的所有样品生物可降解聚合物和测量细胞的生存能力,CD54的表达水平和CD86在24小时。每个聚合物施加不同的影响细胞的生存能力(图 2)。我们发现聚合物P4大幅减少细胞生存能力随着用量增加;因此,它可能是最有毒的生物可降解聚合物。聚合物P1和P5最高浓度显示细胞的异常的70%或更多。因此,它们对细胞活力的影响被认为是弱。

聚合物CD54的表达增加标记,但没有增加CD86的表达标记(图 3)。P1, P3、P5和P6聚合物刺激高CD54的表达水平标记。P1和P5刺激高CD54的表达水平标记虽然不影响细胞的生存能力。P4 CD54的表达最低标记和细胞生存能力最低的聚合物。这些结果表明,生物可降解聚合物影响只有CD54标记和有不同的成分。

在过去的几十年,生物可降解聚合物已经被用于临床医学,他们已报告有更实质性的副作用最小的 28, 29日]。一般来说,众所周知,抗原抗体反应有延迟性由于局部磨损和炎症由于长期使用生物医学材料。这项研究可能表明有一个CD54和延迟抗原抗体反应之间的关系。它被认为是必要的比较结果可降解聚合物对树突细胞的影响与局部淋巴结化验(LLNA)。

 5。结论

直到现在,可生物降解聚合物的小研究原因 在体外敏化。我们测试了由h-CLAT可生物降解的聚合物。我们无法评估P4,因为即便是低浓度的P4引起细胞死亡。此外,皮肤敏化并不是增加了P2。可生物降解聚合物显示的证据,导致皮肤敏化表示为只有CD54 PLLG(75: 25) <事务所(40:60)< PLGA (50: 50) < PCG (50: 50)。我们确定不同成分的生物可降解聚合物对皮肤敏化产生明显不同的影响。总之,皮肤敏化由于暴露在可降解聚合物可以没有动物实验研究。

 确认

衷心的感谢博士去Nukada裕,Abo血型孝博士Ito祐一博士,他博士和卡瓦依博士认从花王公司(Tochiki、日本)的有价值的建议。我们也感谢冈田克也和m . Terao先生从塔基•化工有限公司,有限公司,准备的物质对我们的工作做出了巨大的贡献。最后,我想感谢MHLW资助,完成这项研究成为可能。

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