年龄和糖尿病对间充质祖细胞对纤维蛋白基质反应的影响

摘要

间充质干细胞在组织工程和细胞治疗等应用中显示出越来越大的前景。骨髓中MSC的数量较少，因此在体外扩张通常是必要的。在活的有机体内在美国，干细胞通常驻留在一个能保护细胞的生态位中。这些生态位由生态位细胞、干细胞和细胞外基质组成。当血管受损时，纤维蛋白凝块形成，这是伤口愈合反应的一部分。血凝块构成了干细胞生态位的一种形式，因为它似乎维持了干细胞表型，同时在愈合过程中支持MSC增殖和分化。这尤其合适，因为纤维蛋白被越来越多的人认为是一种支架，这意味着基于纤维蛋白的组织工程可能在某种程度上再现伤口愈合。在这里，我们描述了纤维蛋白如何调节来自年轻/年老人类供体和正常/糖尿病大鼠的MSC克隆能力。用不同浓度的纤维蛋白来调节底物的硬度。在这些支架上扩增MSC并进行分析。MSC在软表面表现出增强的自我更新能力。老年和糖尿病细胞失去了对这些信号作出反应的能力，不再能适应变化的环境。

1.介绍

成人组织干细胞被认为参与组织维护和修复过程。当细胞数量减少时，间充质干细胞(MSC)通过血液系统补充组织干细胞[1］.干细胞群的耗尽被认为是导致大量脑、肝、皮肤、骨骼退化疾病的原因，并在许多与衰老相关的疾病中发挥作用[2］.MSC存在于骨髓中，可分化为骨、脂肪、软骨等多种组织在体外和在活的有机体内［3.，4］.因此，MSC是应用于组织工程和细胞治疗的理想候选者。MSC特别吸引人，因为它易于隔离和操作。

已证明MSC体外表现出海弗利克模型细胞衰老的典型特征，寿命有限，端粒缩短，积累牛乳糖(5]和分化障碍[6］.增加阻力在体外衰老和扩张是改进组织工程和细胞治疗的理想特征，特别是老年人。几次试图拖延在体外衰老包括氧气水平，温度，葡萄糖的降低[7，基因操纵[8端粒酶过度表达[9］.

许多表面和支架已经被广泛地评价为组织工程目的。研究了不同表面的机械刺激对间充质干细胞行为的影响。通过振动细胞、拉伸细胞或提供具有不同力学特性的表面的机械刺激可以诱导成骨分化或抑制脂肪生成[10]通过持久的b-连环蛋白活化[11］.

纤维蛋白是一种生物可降解聚合物，在组织工程应用中得到越来越多的应用，并显示出作为血管组织工程中替代支架的前景[12，13]和皮肤[14］.在生理条件下，创伤后形成纤维蛋白凝块，纤维蛋白是血凝块的大部分生物学和力学特性的决定因素[15］.纤维蛋白凝块的机械特性尤其重要，因为它们既可以作为间隙填充物防止出血，又可以作为机械支持物稳定伤口。因此，纤维蛋白凝块具有显著的可伸缩性和弹性。因此，使用纤维蛋白作为组织工程支架似乎是非常合适的，因为在许多方面，组织工程过程可以被认为是伤口愈合过程的重复。

虽然MSC在伤口愈合中的作用已被提出，但几乎没有直接的生物学证据支持这一观点。有人认为，纤维蛋白可以作为内皮祖细胞的“干细胞龛”[10]，而且似乎合乎逻辑的是，MSC的情况可能也是如此。已知间充质干细胞可通过循环进入移植组织[16- - - - - -18]，纤维蛋白已被证明对许多间充质细胞类型具有高度的haptotactic，包括MSC [19，20.］.已经完成的研究表明，当MSC被植入凝血酶与纤维蛋白原比值较低的纤维蛋白凝胶中时，MSC能够粘附、扩散和增殖[21］.基质细胞不收缩纤维蛋白，这种物质对lapine间充质干细胞没有毒性作用[11］.此外，由于间充质干细胞可以从同一供体中分离出纤维蛋白，因此，由于整个过程将使用自体材料，因此，纤维蛋白是临床转译细胞制剂的良好材料。然而，关于纤维蛋白对间充质干细胞生长和分化行为的影响，目前缺乏可用的数据。我们研究了纤维蛋白对正常和糖尿病I型大鼠间充质干细胞以及年轻和老年人类供体间充质干细胞的影响。据了解，糖尿病患者的MSC [22]和老捐款者[23，24确实减少扩张在体外并表现出更早的衰老。目的是建立一个表面最小化在体外具有较好的生长分化潜力。在不同硬度的纤维蛋白支架上评估生长和分化，以确定支持间充质干细胞的最佳纤维蛋白浓度。

2.材料和方法

2．1．化学物质

所有化学药品均来自Sigma-Aldrich (Dorset, UK)，除非另有说明，并未经进一步净化使用。

2．2.细胞培养

Dulbecco 's Modified Eagle Medium (Cambrex Bio Science, Workingham, UK)添加10% Serum Supreme (Cambrex Bio Science, Workingham, UK)、1% Ultraglutamine (BioWhittaker, UK)和1%青霉素-链霉素溶液，今后将被称为生长培养基。成骨分化细胞在添加了地塞米松(M)和抗坏血酸-2-磷酸(50g / mL)。

2．3.间充质干细胞

Wistar大鼠购自哈兰(比斯特，英国)，并根据内政部的规定在现场饲养。3个月大鼠单剂量链脲佐菌素(STZ 65 mg/kg体重)在冰水0.01 M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)中诱导1型糖尿病。老鼠被允许进食和饮水随意．每周监测体重和尿葡萄糖水平。在死亡时测定了血糖水平。年龄相近的大鼠作为健康比较。按照Dobson等人的方法从胫骨和股骨中离心获得骨髓细胞[25]和Sekiya等人的方法分离MSC [26］.

人类MSC购自杜兰大学(Emeryville, california, USA)或AllCell (Emeryville, california, USA)。从年龄在18-25岁的供体中分离的间充质干细胞为年轻型，从55-60岁供体中分离的间充质干细胞为老年型。

２.４.间充质干细胞的免疫表型研究

为了确定间充质干细胞表型，7天后采集人间充质干细胞，用CD11、CD31、CD44、CD45、CD90、CD105、D7fib和stro1(稀释1:100;4°C;30分钟;Serotec,英国牛津大学)。大鼠MSC染色检测CD11、CD44、CD45、CD90、CD105。细胞表型和细胞大小使用个人流式细胞仪系统(GUAVA Instruments, Hayward, USA，或Acuri FACS)进行。

2．5．间充质干细胞分化潜能的证明

2万个细胞接种于24孔板中，在成骨培养基(含M地塞米松和50g/mL抗坏血酸-2-磷酸。MSC被固定并进行组织化学染色以检测碱性磷酸酶活性。简单地说，MSC在室温下于含耐晒红bb或耐晒紫(1 mg/mL)的Tris缓冲液(0.08 M, pH 7.5)中的萘酚AS-BI磷酸盐(0.05 mg/mL)溶液中孵育30分钟，洗涤并拍照。2万细胞接种于24孔板，在成脂分化培养基(1 mM地塞米松、5 mg/mL胰岛素、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、60 mM吲哚美辛)中培养14天。用异丙醇固定细胞，用油红O液染色，检测中性脂空泡的存在，并拍照。

2.6。纤维蛋白支架的生产

牛血浆中的I型纤维蛋白原溶解在37°C的培养基中，浓度范围为3、10和30 mg/mL。轻轻地搅拌混合物，直到纤维蛋白原溶解，然后用冰箱冷却。加入牛血浆凝血酶(1单位/mL)诱导凝胶。每25 cm加5 mL²培养瓶。烧瓶在37°C孵育1小时，使用前用PBS冲洗。将间充质干细胞置于纤维蛋白支架的顶端。

2.7。菌落形成单位纤维母细胞测定

为了确定增殖能力和分化潜能的维持，菌群形成单位成纤维细胞试验被用作最初由Kuznetsov等人描述的技术的改进。27］.原代间充质干细胞在纤维蛋白凝胶(3、10和30 mg/mL)和组织培养塑料(TCP)上培养7天。1000个细胞转移到55厘米²并在成骨培养基中培养14天。此时菌落在乙醇中固定，依次进行碱性磷酸酶和总菌落染色，并按前面描述的方式拍照[28］.

2.8。殖民地的分析

采用Dobson等人的方法评估菌落数量[25］.简单地说，获得的数字图像被导入Photoshop，菌落的不规则性被平滑，并转换成256级灰度格式。然后将灰度图像导入生物图像“智能量化器”中，计算菌落数量。

2.9。数据分析

数值用三个实验的平均值±标准差表示。结果比较采用单因素方差分析(ANOVA)，多重比较采用Tukey检验。数据被认为有显著差异．

3.结果

３．１．健康和糖尿病大鼠间充质干细胞纤维蛋白预培养后的克隆和成骨分化潜能

从正常或链脲佐菌素I型糖尿病大鼠(2-3月龄)中分离出间充质干细胞，并用流式细胞仪分析其表型。CD44和CD90阳性，CD45低，CD11阴性(图)1(a))。在适当的培养条件下，细胞可分化为脂肪细胞和成骨细胞(图)1(b)和1(c))。

为了确定在具有生理相关弹性模量的三维纤维蛋白支架上培养MSC对克隆原性和分化潜能保留的影响，新鲜分离的MSC在3，10或30 mg/mL纤维蛋白，在TCP上培养7天，然后将1000个细胞转移到无包被培养皿中，在成骨培养基中再培养14天。我们发现，与注射链脲佐菌素12周后的大鼠MSC相比，年轻大鼠MSC的CFU-f频率增加。

与TCP相比，ALP在纤维蛋白上的菌落频率显著增加(图)2(一个))，但平均菌落大小不受影响(图2 (b)）.总菌落的频率也观察到了同样的结果(图)2 (c))和它们的平均菌落大小(图2 (d)）.起初，糖尿病大鼠的菌落数量较低，但纤维蛋白培养并没有对其进行调节，在CFU大小(菌落总数)和alp阳性菌落数量和大小方面也发现了相同的趋势(图)2 (b)和2 (d)）.

３.２．老年人和年轻人间充质干细胞的克隆和成骨分化潜能

年轻MSC分离自18 - 25岁的供体，老年MSC分离自55 - 60岁的供体。流式细胞分析证实细胞表型。细胞的CD44, CD90, stro1和D7fib阳性，CD11, CD31和CD45低(图)1(d))。在适当的培养条件下，细胞能分化成成骨细胞和脂肪细胞(图)1(e)和1(f))。

扩大的年轻人MSC的菌落数量与纤维蛋白底物的柔软度呈正相关。MSC在不同表面培养，然后移植到TCP上进行CFU-f检测。相对于TCP，在3和10 mg/mL的纤维蛋白上培养后，alp阳性菌落数量显著增加(图)3(一个)）.总菌落数变化趋势相同;然而，只有3mg /mL的纤维蛋白导致菌落数量显著增加。在10 mg/mL纤维蛋白凝胶上扩增菌落时，菌落的大小略有增加，但没有显著增加(图)3 (b)）.

３．３．老间充质干细胞对纤维蛋白的培养反应

总的来说，与年轻供体的MSC相比，来自年长供体培养的MSC的CFU数量要低得多(图)3.）.有趣的是，我们看到了与年轻MSC相比，使用旧MSC在不同表面扩展的CFU数字的相反趋势。我们发现TCP表面的菌落明显更多，而软表面的菌落更少，纤维蛋白浓度之间没有差异。在碱性磷酸酶阳性菌落中趋势不明显，但在总菌落中趋势明显。对于来自老年捐赠者的MSC，我们发现～50%的alp阳性菌落与年轻捐赠者的MSC相比。总菌落数量减少～40%。如果我们将其与给予最高CFU数的纤维蛋白浓度与来自年轻供者的MSC进行比较，我们发现前者的下降幅度更大。在3mg /mL的纤维蛋白上，我们只发现5%的alp阳性菌落～使用来自老年供体的MSC的总菌落的10%。塑料和30 mg/mL纤维蛋白组的菌落大小也略大，但没有达到显著性(图)3 (b)和3 (d)）.此外，在所有测试浓度下，旧的间充质干细胞在纤维蛋白表面确实变小了(图)4 (c)- - - - - -4 (h)）.在塑料上，它们有衰老间充质干细胞典型的放大形态，在最高浓度的纤维蛋白凝胶上，我们发现它们小得多，高度对齐(图)4 (f)和4 (h)）.其他两种浓度的MSC遵循与年轻供体MSC相同的模式(数据未显示)。

3．4．纤维蛋白对次生间充质干细胞增殖和分化的影响

评估基体刚度的影响是否在单独使用MSC后仍然存在的潜力初步扩张10毫克/毫升血纤蛋白制备(CFU-f最高的数字),MSC补种在不同纤维蛋白基质(3-30毫克/毫升)细胞是否保留第一个基础的影响。次级MSC与初级MSC的趋势相同。与TCP对照组相比，在纤维蛋白上预培养后，每个培养皿的菌落数量增加;但这一次，10mg /mL纤维蛋白培养的MSC与tcp培养的MSC相比也有显著差异(图)4(一)）.然而，不同于最初的人类MSC，不同组间的群体大小没有差异(图)4 (b)）.

3．5．形态比较

在纤维蛋白上培养的MSC根据纤维蛋白的柔软程度改变其形态(图)4 (c)- - - - - -4 (h)）.所有纤维蛋白表面的细胞大小均减少。流式细胞术分析细胞大小证实了这一点(见表)1）.在30mg /mL纤维蛋白组和10mg /mL纤维蛋白组间充质干细胞高度对齐。此外，在3mg /mL的表面，细胞开始形成网络。由于这暗示了一个潜在的更好的自我更新，我们培养这些MSC在不同的纤维蛋白浓度的一个传代，并分析了第二代菌落形成。在塑料上培养的MSC丧失了约90%的菌落形成能力。纤维蛋白浓度为3 mg/mL时，CFU频率可提高约5倍;但对增殖率没有影响(图)4(一)和4 (b)）.

3.6。纤维蛋白浓度对凝胶硬度的影响

纤维蛋白浓度影响间充质干细胞克隆能力的一个可能因素是它对纤维蛋白凝胶硬度的影响。为了确定纤维蛋白对凝胶刚度的影响，使用Bose Electroforce 3200计算应力应变图(图)5(一个)- - - - - -5 (c)）.由于没有发现线性区域，刚度是在20%应变下用切线模量测量的。结果表明，随着纤维蛋白原浓度的增加，纤维蛋白原的刚度也随之增加，3 mg/mL时刚度为16.7 kPa, 10 mg/mL时刚度为40.4 kPa, 30 mg/mL时刚度为77 kPa。30 mg/mL凝胶的刚度与3和10 mg/mL凝胶有统计学差异(图)5 (d)）.

4.讨论

由于易于分离和培养，MSC在组织工程和细胞基础疗法中越来越受欢迎。它们的免疫调节功能以及它们的分泌细胞使它们成为治疗的理想来源。然而在体外由于骨髓间充质干细胞的数量很少(10万个细胞中只有1个)，因此需要扩大数目[29]，并随年龄增长而减少[24］.扩张导致在体外间充质干细胞老化伴增殖和分化潜能下降[30.］.衰老的MSC表达衰老体细胞的典型标记物，包括p53和p21水平升高[31，有变化的形态[3.，并表达衰老标志牛乳糖(23］.老年间充质干细胞临床使用可能导致严重的副作用，因为众所周知，衰老细胞可诱发癌症形成[32］.人类脂肪组织来源的间充质干细胞在衰老时可自发转化[33］.因此，有必要保持组织工程结构中衰老细胞的数量尽可能低，并在扩张过程中尽量减少衰老。现在大家都知道干细胞与环境相互作用[34］.通过改变干细胞的生态位来操纵干细胞的行为是可能的。细胞外基质成分是干细胞生态位的一部分。纤维蛋白是一种天然的生物可降解聚合物，越来越多地应用于组织工程，并可自主生产，因此是潜在治疗应用的良好选择。广泛应用于软骨组织工程[35并可被纤溶酶快速降解。因此，它是一个理想的候选人在体外也可用于移植，以保护和调节间充质干细胞的行为。

不同纤维蛋白原浓度的纤维蛋白凝胶具有不同的力学性能(杨氏模量)。在进行分析之前，将MSC植入这些凝胶并进行培养。我们发现年轻大鼠和年轻人类的MSC对不同的纤维蛋白原浓度有反应。使用CFU-f测定容量的最高自我更新发现在最柔软的纤维蛋白表面。然而，这一效应在糖尿病I型大鼠或老年人类供体MSC中均不存在。我们从以前的研究中知道糖尿病大鼠和老年人的CFU-f数字[24与年轻健康对照组相比这现在被证实为培养扩大MSC的频率与观察到的相同趋势。使用CFU-f作为测定细胞制备中存在的MSC数量的方法已被很好地描述[25，假设每个菌落来自单个细胞，允许菌落的数量与原始样本中的干细胞数量相关。纤维蛋白凝胶似乎改变了间充质干细胞培养中干细胞的频率，并可以增加年轻间充质干细胞的数量，具有高增殖和分化潜能。纤维蛋白培养的间充质干细胞沿同一轴排列，而TCP培养的间充质干细胞呈典型的“鹅卵石”样外观。不仅在细胞形态上有差异，而且在细胞大小上也有差异。细胞大小的增加与细胞的衰老有关，这是公认的，因此表明小细胞比大细胞“年轻”。23］.在柔软的纤维蛋白表面培养后，来自旧供体的MSC变小，可能是基质诱导的再生作用。在成纤维细胞中，通过抑制calveolin-1改变细胞附着，可以逆转衰老表型[36］.

我们观察到，在较软的基质上预培养年轻和非患病的供体细胞后，不仅CFU-f效率更高，而且ALP染色阳性的菌落数量也更高。这些数据表明，在较软的基质上进行预培养可以保持更像“干细胞”的表型。一项关于人类MSC表型维持的研究表明，基底膜ECM是干细胞增殖寿命和分化潜能维持的关键因素，并强调了天然的、软基质维持更像“干细胞”的表型，并显示出比生长因子(如成纤维细胞生长因子)更大的影响[37］.温度对旧供体间充质干细胞影响的研究表明，对环境挑战的反应同样降低[38］.人类老年间充质干细胞的蛋白质组学研究表明，老年间充质干细胞的抗氧化和细胞骨架功能减弱[39］.表面对“茎性”特性的有益影响可能是通过细胞骨架介导的，或由于信号转导途径的改变。细胞形状可调节干细胞分化[40］.Rho家族的小GTPases将信号从细胞外基质传递到肌动蛋白骨架和细胞核，调节基因表达[36，41］.参与信号传递的受体有整合素、难糖甘聚糖、辛德聚糖、CD44和Rhamm。这些信号可导致细胞形态和细胞结构(包括细胞骨架和染色质结构)的戏剧性变化，影响基因表达[42］.组成核膜的层蛋白通过网旋蛋白与肌动蛋白丝连接，将细胞核固定在细胞骨架上。肌动蛋白的破坏导致整体组蛋白去乙酰化和细胞聚集[43］.

前景
这是第一个关于在纤维蛋白支架上来自老年和患病供体的扩展MSC自我更新潜力的报告。我们已经证明，年轻的MSC在软纤维蛋白凝胶上保持了更好的自我更新，但当使用来自衰老或糖尿病组织的细胞时，这一好处部分丧失了。对支架进行额外的修饰可能是必要的，以获得在年轻MSC中看到的相同效果。

承认

作者感谢唐娜·塞勒斯博士为他们提供了糖尿病动物。

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