IJBM 国际期刊的生物材料 1687 - 8795 1687 - 8787 Hindawi出版公司 378034年 10.1155 / 2011/378034 378034年 研究文章 年龄和糖尿病对响应的影响的间叶细胞祖细胞纤维蛋白矩阵 Stolzing 一个。 1 考利 H。 2 Scutt 一个。 3 Seifalian 亚历山大·马库斯 1 部细胞疗法 弗劳恩霍夫研究所细胞疗法 Perlickstra βe 1 04103年莱比锡 德国 2 学术单位的口腔及颌面部医学和外科手术 临床牙科学院 谢菲尔德大学 S10 2 ta谢菲尔德 英国 shef.ac.uk 3 工程材料和谢菲尔德运动医学中心 谢菲尔德大学 S10 2 rx谢菲尔德 英国 shef.ac.uk 2011年 13 12 2011年 2011年 30. 05年 2011年 23 08年 2011年 04 09年 2011年 2011年 版权©2011 A。Stolzing et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

间充质干细胞显示出增加的承诺在组织工程和细胞治疗等应用程序。骨髓MSC数量很低,因此 在体外扩张往往是必要的。 在活的有机体内,干细胞通常驻留在一个利基行动保护细胞。这些利基市场利基组成的细胞,干细胞和细胞外基质。血管受损时,纤维蛋白凝块形成的伤口愈合反应。血栓是一种干细胞利基,因为它似乎维持干细胞表型在治疗同时支持MSC增殖和分化。尤其适合作为纤维蛋白越来越被认为是组织工程支架意味着fibrin-based可能在某种程度上概括伤口愈合。在这里,我们描述如何单独使用纤维蛋白调节能力MSC源自年轻/旧人类捐助者和正常的糖尿病大鼠。纤维蛋白制备使用不同浓度调节衬底的刚度。MSC扩大在这些支架进行分析。MSC在松软的地上增加自我更新。老和糖尿病细胞失去了对这些信号做出反应的能力,不再能适应变化了的环境。

 1。介绍

成年组织干细胞被认为是参与组织维修流程。当数字很低,组织干细胞是补充的间充质干细胞(MSC)通过血液系统( 1]。损耗的干细胞群已建议为大量的退化性疾病的大脑,肝脏、皮肤、骨头和扮演一个角色在许多老龄化带来的疾病 2]。MSC驻留在骨髓和可以分化成各种组织包括骨骼、脂肪、软骨 在体外和 在活的有机体内( 3, 4]。MSC因此理想候选人用于组织工程和细胞治疗。MSC尤其具有吸引力,因为容易隔离和操纵。

它已经表明,MSC 体外展览的特征典型的海弗利克模型细胞衰老与寿命有限,除了端粒缩短,积累 β 牛乳糖( 5),和障碍的区别 6]。增加阻力 在体外衰老和延长扩张将是可取的特点来提高组织工程和细胞治疗特别是老年人。几次推迟 在体外老龄化已经执行包括减少氧气水平,温度、葡萄糖( 7),遗传操作( 8,端粒酶超表达( 9]。

许多表面和支架被广泛用于组织工程评估。机械刺激的影响特定表面的MSC的行为已经研究了各种潜在的分化的影响。通过振动机械刺激细胞,细胞或通过提供表面具有不同力学性能可以诱导成骨分化或抑制脂肪形成 10)通过耐用b-catenin激活( 11]。

纤维蛋白是一种可生物降解的聚合物,正在越来越多地用于组织工程应用和展示承诺作为替代支架在血管组织工程 12, 13)和皮肤( 14]。在生理条件下,形成纤维蛋白凝块后创伤和纤维蛋白负责大部分的生物和机械性能的血凝块 15]。纤维蛋白凝块的力学性能是特别重要的,因为他们作为填充物,防止出血和机械支持稳定的伤口。由于这种纤维蛋白凝块非常可扩展和弹性。纤维蛋白作为组织工程支架的使用将因此似乎在许多方面非常适合作为组织工程过程可以认为是一个重复的伤口愈合过程。

虽然在伤口愈合的作用提出了MSC,几乎没有直接的生物学证据支持这种观点。有人建议,纤维蛋白可以作为一种“干细胞利基”内皮祖细胞( 10,似乎逻辑,这也可能与MSC。众所周知,MSC移植可以通过流通,成为旅游纳入组织( 16- - - - - - 18)和纤维蛋白已被证明是高度haptotactic的间充质细胞类型包括MSC ( 19, 20.]。研究已经完成证明MSC可以遵循,传播,扩散当播种与低凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白凝胶率( 21]。基质细胞不合同纤维蛋白和材料对lapine MSC(没有毒性作用 11]。此外纤维蛋白可以从相同的捐赠者分离MSC因此是一个很好的材料细胞制剂的临床翻译整个过程将使用自体材料执行。然而,缺乏可用数据观察纤维蛋白对MSC的影响生长和分化的行为。我们调查了纤维蛋白对MSC的影响从正常和糖尿病I型大鼠MSC从年轻和年龄在人类的捐助者。众所周知,MSC从糖尿病 22和旧的捐助者 23, 24少做扩大 在体外并显示早期衰老。目的是建立一个表面最小化 在体外衰老和良好的生长和分化潜能。生长和分化是评价纤维蛋白支架刚度确定最优的纤维蛋白的浓度来支持MSC。

 2。材料和方法 2.1。化学物质

所有的化学品都来自Sigma-Aldrich(英国多塞特郡),除非另有说明,使用前未经纯化。

 2.2。细胞培养

杜尔贝科的修改鹰介质(英国Cambrex生物科学,Workingham)补充血清最高为10% (Cambrex生物科学,Workingham,英国),1% Ultraglutamine(英国BioWhittaker),和1% penicillin-streptomycin解决方案和以后将称为生长介质。成骨分化细胞在生长培养基培养的补充与地塞米松( 10 - - - - - - 8 M)和ascorbate-2-phosphate (50 μ g / mL)。

 2.3。间充质干细胞

Wistar鼠买来哈伦(英国斯特)和保持现场按照内政部规定。诱导I型糖尿病老鼠注射一剂量链脲霉素(STZ 65毫克/公斤体重)在冰冷的0.01 M柠檬酸钠缓冲(pH值4.5)在3个月。老鼠被允许食物和水 随意。每周查阅监控,以及尿葡萄糖水平。血糖测定的时候死亡。年龄相仿的老鼠被用作比较健康。骨髓细胞得到离心地从胫骨和股骨的方法多布森et al。 25)和MSC孤立漫画家关谷神奇的方法等。 26]。

人类MSC买来杜兰大学(美国加州维尔)或AllCell(美国加州维尔)。MSC与捐赠者岁之间年龄在18岁至25岁之间的被归类为年轻而MSC与捐赠者年龄段分为旧。

 2.4。Immunophenotyping间充质干细胞

确认MSC表型,人类MSC收获后7天内与抗体染色CD11, CD31、CD44、CD45、CD90、CD105, D7fib和stro-1(稀释1:100;4°C;30分钟;Serotec,英国牛津大学)。大鼠MSC彩色CD11, CD44, CD45, CD90、CD105。细胞表型出现使用个人流式细胞术和细胞大小进行系统(番石榴仪器,海沃德,美国,或者一个Acuri流式细胞仪)。

 2.5。的间充质干细胞的分化潜力

20000个细胞被播种在成骨的介质(包含24-well盘子和孵化 10 - - - - - - 8 M地塞米松和50 μ g / mL ascorbate-2-phosphate为14天。MSC是固定和染色为碱性磷酸酶组织化学地活动。短暂,MSC孵化了30分钟在萘酚溶液在室温下是双磷酸盐(0.05毫克/毫升)三羟甲基氨基甲烷缓冲液(0.08米,pH值7.5)包含快红色bb或快紫(1毫克/毫升),洗,拍照。去20000细胞被播种在24-well盘子和孵化脂肪形成的分化培养基(1毫米地塞米松、5毫克/毫升胰岛素,0.5毫米isobutylmethylxanthine (IBMX), 60毫米吲哚美辛)为14天。细胞被固定和异丙醇沾油红O解决检测中性脂质空泡的存在和拍照。

 2.6。纤维蛋白支架的生产

从牛血浆纤维蛋白原类型我是溶解在介质在37°C浓度范围(3、10和30毫克/毫升)。溶解纤维蛋白原是轻轻搅拌,直到混合物,然后冷却制冷。从牛血浆凝血酶添加(1单位/毫升)诱导凝胶。5毫升被添加到每个25厘米2培养瓶。烧瓶在37°C 1 h和孵化与PBS使用前清洗。MSC被播种在纤维蛋白支架的顶部。

 2.7。成纤维细胞的克隆形成单位分析

确定增殖分化的能力和维护潜在克隆形成单位纤维母细胞试验采用的改性技术最初由“库兹涅佐夫”等描述。 27]。主要MSC培养在纤维蛋白凝胶(3、10和30毫克/毫升)和组织培养塑料(TCP)控制了7天。1000个细胞被转移到55 cm2盘子和随后的14天的培养成骨的媒介。此时殖民地在乙醇固定,按顺序对碱性磷酸酶染色和总殖民地和拍摄如前所述 28]。

 2.8。殖民地的分析

殖民地数字评估使用的方法多布森et al。 25]。短暂,获得的数字图像被导入到Photoshop,殖民地违规平滑转换成一个256级灰度的格式。灰度图像被导入到Bio-image“智能量词”和殖民地数量计算。

 2.9。数据分析

值表示为三个实验的平均值±标准偏差。比较的结果是由单向方差分析(方差分析)和多个比较用图基的测试。数据被认为是明显不同的 P < 0.05 。

 3所示。结果 3.1。克隆细胞和成骨分化潜力的健康和糖尿病大鼠间充质干细胞后Preculture纤维蛋白

MSC是从正常或孤立链脲霉素I型糖尿病大鼠(2-3-month旧)及其表型确认流仪分析。细胞CD44和CD90积极、CD45低,不利于CD11(图 1(a))。细胞能够分化成脂肪细胞,成骨细胞在适当的培养条件(图 1(b)和 1(c))。

MSC验证。从人类和大鼠分离MSC immunophenotyped使用典型的MSC标记(数字 1(一)和 1(b)),证实了干细胞可能分化成脂肪细胞和成骨细胞(数字 1(c)和 1(d))。

确定影响clonogenicity和保留分化潜力的培养的MSC与生理有关弹性模三维纤维蛋白支架刚分离MSC培养3,10 - 30毫克/毫升血纤蛋白和TCP传输前7天1000个细胞进一步裸培养皿和培养14天在成骨生长介质。我们发现MSC来自年轻的老鼠显示CFU-f频率增加而MSC来自老鼠注射链脲霉素后12周。

高山殖民地的频率显著增加纤维蛋白相比,TCP(图 2(一个)),但殖民地的平均尺寸没有影响(图 2 (b))。同样的观察总殖民地(图的频率 2 (c))和殖民地的平均尺寸(图 2 (d))。最初殖民地数量降低糖尿病大鼠不是培养调制的纤维蛋白和同样的趋势被发现对于CFU大小(总菌落数)和ALP-positive殖民地的数量和规模(数字 2 (b)和 2 (d))。

纤维蛋白表面的影响健康和糖尿病大鼠MSC。MSC与年轻糖尿病老鼠生长在纤维蛋白凝胶为7天,然后1000细胞成骨的条件下被播种到CFU化验。ALP-positive(灰色)和菌落总数(黑)计算正常大鼠MSC (a)以及殖民地(b)的平均大小。CFU MSC的数字也计算(c)以及平均菌落大小(d)。*表示来自其他组织的统计上的显著差异。

大鼠MSC

平均殖民地地区

糖尿病大鼠MSC

平均殖民地地区

 3.2。克隆细胞和成骨分化潜力之间的古老而年轻的人类间充质干细胞

年轻MSC隔绝18-25-years-old捐赠者和旧MSC捐助者55到60岁。证实了细胞表型流仪分析。细胞CD44, CD90、stro-1 D7fib积极CD11, CD31、CD45低(图 1(d))。细胞能够分化成成骨细胞和脂肪细胞在适当的培养条件(数据 1(e)和 1(f))。

殖民地的数量扩大年轻人类MSC积极与柔软的纤维蛋白基质。MSC培养在不同的表面,然后受移植者到TCP CFU-f化验。ALP-positive殖民地的数量显著增加文化后3和10毫克/毫升血纤蛋白相对于TCP(图 3(一个))。菌落总数遵循相同的趋势;然而只有3毫克/毫升血纤蛋白导致殖民地人数显著增加。殖民地的大小略而不显著增加在扩大10毫克/毫升纤维蛋白凝胶(图 3 (b))。

纤维蛋白表面对年轻和年老的影响人类的MSC。孤立的MSC岁年轻的捐赠者和捐助者的种植在纤维蛋白凝胶为7天,然后1000细胞成骨的条件下被播种到CFU化验。ALP-positive殖民地的数量(灰色)和菌落总数(黑)计算为年轻岁(a)和(c) MSC。平均大小的殖民地计算岁年轻(b)和(d)捐赠MSC。*表示来自其他组织的统计上的显著差异。

年轻hMSC

年轻hMSC

老hMSC

老hMSC

 3.3。老MSC培养纤维蛋白的反应

一般CFU来源于培养的MSC的数量从旧捐助者低得多,年轻的MSC捐助者(图 3)。有趣的是,我们看到了相反的趋势CFU数字使用不同的表面上的旧MSC扩展相比,年轻的MSC。我们发现更多的殖民地在TCP在柔软的表面,和更少的纤维蛋白浓度没有区别。ALP-positive殖民地的趋势不显著但总殖民地。从捐赠者岁我们发现MSC ~从年轻的捐助者50% ALP-positive殖民地而MSC。菌落总数下降了 ~40%。如果我们比较这的纤维蛋白浓度最高的CFU数字与年轻的MSC捐助者我们找到一个更大的减少。3毫克/毫升血纤蛋白ALP-positive殖民地,我们只有找到5% ~10%的总殖民地利用年龄供体的MSC。菌落大小也略大的塑料和30毫克/毫升血纤蛋白但没有达到意义(数据 3 (b)和 3 (d))。也老MSC变得更小的纤维蛋白表面所有测试浓度(数字 4 (c)- - - - - - 4 (h))。塑料上他们有扩大形态典型的衰老MSC,在我们找到他们的最高浓缩的纤维蛋白凝胶和高度一致(数据小得多 4 (f)和 4 (h))。MSC在另外两个年轻捐献者的浓度都遵循着相同的模式MSC(数据没有显示)。

MSC形态和自我更新。MSC从一个18岁的健康的捐赠者是培养10毫克/毫升血纤蛋白补种前7天到不同浓度的纤维蛋白或TCP。我们称这些次要的殖民地。不同的表面又组织培养塑料3毫克/毫升纤维蛋白凝胶,10毫克/毫升,30毫克/毫升(d)。TCP上培养的MSC从55岁的捐赠者和30毫克/毫升纤维蛋白凝胶。菌落数(a)和大小(b)所示的不同形态(碳氢键)所示。*表示来自其他组织的统计上的显著差异。

Sec.年轻hMSC

Sec.年轻hMSC

TCP年轻hMSC

年轻hMSC纤维蛋白(10)

纤维蛋白(3)年轻hMSC

年轻hMSC纤维蛋白(30)

TCP老hMSC

老hMSC纤维蛋白(30)

 3.4。纤维蛋白对扩张和次要的间充质干细胞的分化

评估基体刚度的影响是否在单独使用MSC后仍然存在的潜力初步扩张10毫克/毫升血纤蛋白制备(CFU-f最高的数字),MSC补种在不同纤维蛋白基质(3-30毫克/毫升)细胞是否保留第一个基础的影响。二次MSC遵循相同的趋势主要MSC。增加的数量每道菜preculture后殖民地观察纤维蛋白比TCP控制;然而这次也10毫克/毫升fibrin-cultured MSC显示显著差异相比TCP-cultured MSC(图 4(一))。但是,与主要的人类MSC,在蚁群的规模没有区别不同群体之间(图 4 (b))。

 3.5。形态比较

上培养的MSC纤维蛋白纤维柔软(数据显示改变了形态 4 (c)- - - - - - 4 (h))。细胞大小减少纤维蛋白的表面。这证实了通过流式细胞术分析细胞大小(表 1)。30毫克/毫升血纤蛋白,并在较小程度上10毫克/毫升血纤蛋白,MSC是高度一致的。此外,在3毫克/毫升表面细胞开始形成网络。这暗示对一个潜在的更好的自我更新我们培养这些MSC的一段不同的纤维蛋白浓度和分析第二代集落形成。塑料损失了大约90%的MSC培养他们的克隆形成能力。CFU的频率可能增加了大约5倍时,细胞培养3毫克/毫升血纤蛋白;但是不影响扩散率(图 4(一)和 4 (b))。

生长在纤维蛋白细胞大小。纤维蛋白凝胶是由混合纤维蛋白原(3、10和30毫克/毫升)与凝血酶(1 μl /毫升)。细胞大小不同的MSC类型进行分析。

细胞类型 Abitary单位
年轻rMSC 329年 ± 136年
糖尿病rMSC 392年 ± 150年
年轻rMSC(30毫克/毫升) 420年 ± 10
年轻hMSC 408年 ± 51
岁hMSC 420年 ± 57
岁hMSC(30毫克/毫升) 344年 ± 127年
3.6。纤维蛋白浓度对凝胶硬度的影响

一个可能的因素的影响,纤维蛋白浓度在MSC单独使用能力是其对纤维蛋白凝胶硬度的影响。确定纤维蛋白在凝胶硬度的影响应力应变图使用Bose Electroforce 3200(数据计算 5(一个)- - - - - - 5 (c))。没有发现线性区域,刚度测量使用应变切线模量为20%。数据显示,随着纤维蛋白原的浓度增加也刚度模量16.7 kPa 3毫克/毫升,40.4 kPa 10毫克/毫升,77 kPa毫克/毫升30毫克/毫升。的刚度30毫克/毫升凝胶有统计学差异(图3和10毫克/毫升凝胶 5 (d))。

切线模量的纤维蛋白凝胶产生不同纤维蛋白原浓度。纤维蛋白凝胶是由混合纤维蛋白原(3、10和30毫克/毫升)与凝血酶(1 μl /毫升)。拉伸试验的凝胶进行使用Bose ElectroForce 3200 (a - c)。切模计算边坡的应力和应变的情节在应变20% ( n = 6 )(d)。

纤维蛋白3毫克/毫升

纤维蛋白10毫克/毫升

纤维蛋白30毫克/毫升

切线模量

 4所示。讨论

MSC正变得越来越受欢迎的组织工程和细胞治疗由于易于分离和培养。其免疫调节功能检查参与组成分泌腺以及他们让他们治疗的理想来源。然而 在体外扩张需要扩大数量,MSC发生在低数量100000个细胞(1)在骨髓 29日]随着年龄的增长和下降的频率( 24]。扩张导致 在体外老化的MSC伴随着增殖和分化潜能下降( 30.]。岁年龄MSC表达标记的典型体细胞包括增加p53、p21水平( 31日),有一个改变形态( 3,表达了衰老标记 β 牛乳糖( 23]。临床使用MSC岁可能会导致严重的副作用众所周知,衰老细胞可以诱发癌症的形成( 32]。人类adipose-tissue-derived间充质干细胞可以自发地改变当他们到达衰老( 33]。由于这个原因,有必要保持衰老细胞的数量在组织工程构建尽可能低,以减少衰老在扩张。现在也承认,干细胞与环境互动( 34]。干细胞的操纵行为通过改变干细胞的利基是可能的。细胞外基质成分的干细胞利基。纤维蛋白是一种天然的生物可降解聚合物越来越多地用于组织工程,可以产生自体,因此一个不错的选择的潜在的治疗应用脚手架。广泛应用于软骨组织工程( 35),可以通过血纤维蛋白溶酶迅速降解。因此一个理想的候选人 在体外移植MSC的扩张,也可以用于保护和调节MSC的行为。

纤维蛋白凝胶与各种纤维蛋白原浓度是用不同的力学性能(不同的杨氏模)。MSC被播种到这些凝胶和培养分析。我们发现,从年轻的老鼠和MSC MSC年轻人类应对不同的纤维蛋白原浓度。最高的自我更新测量使用CFU-f试验能力被发现在最柔软的纤维蛋白的表面。这种效果但是丢了MSC的糖尿病I型大鼠或年龄在人类的捐助者。我们知道前研究CFU-f数字从岁糖尿病老鼠和人类 24年轻健康对照组相比要低。现在确认的频率culture-expanded观察MSC具有相同趋势。CFU-f的使用作为一个试验来确定MSC在细胞的数量已经准备好特征( 25),假设每个殖民地起源于单个细胞允许对殖民地的数量与原样品的干细胞数量。纤维蛋白凝胶的频率似乎改变干细胞MSC文化和年轻的MSC的数量可以增加MSC增殖和分化潜力高。纤维蛋白上培养的MSC沿着同一轴对齐而出现在TCP他们有典型的“鹅卵石——“像外观。不仅在细胞的形态学差异也是细胞的大小是不同的。能够很好的接受,增加细胞的大小与衰老细胞,从而表明,较小的细胞比更大的“年轻”( 23]。MSC从旧捐助者减少大小的软纤维蛋白表面的培养后,可能由于matrix-induced复兴的影响。在成纤维细胞衰老表型可以通过改变细胞通过抑制calveolin-1附件( 36]。

观察到,不仅CFU-f效率,而且殖民地的数量呈阳性高山pre-culture后高的软基质细胞年轻,nondiseased捐助者。这些数据表明,在柔软的基质pre-culturing维护一个更多的“干细胞——“像表型。调查研究维护人类MSC表型涉及的基底膜ECM的一个关键因素的增生性寿命和维护微分干细胞的潜力在文化和强调人的重要性,软基础维持一个更“干细胞——“像表型和显示效果比增长等因素成纤维细胞的生长因子( 37]。研究温度对MSC的影响从旧捐助者显示相同的降低应对环境挑战[ 38]。MSC岁人类蛋白质组学研究表明,抗氧化剂和细胞骨架的功能减弱岁MSC ( 39]。的有利影响表面“具备干细胞”属性可以通过细胞骨架介导,或由于信号转导通路的变化。细胞形状显示调节干细胞分化( 40]。ρ家族的小gtpase传递信号从细胞外基质肌动蛋白骨架和核,调节基因表达( 36, 41]。整合蛋白受体参与信号传输,dystroglycans, syndecans, CD44, Rhamm。这种信号可能导致戏剧性的变化在细胞形态和细胞架构涉及细胞骨架和染色质结构,影响基因表达( 42]。核纤层蛋白占核膜连接通过nespin肌动蛋白丝,锚定细胞核的细胞骨架。中断的肌动蛋白导致全球组蛋白脱乙酰作用和细胞围捕( 43]。

前景

这是第一次报告的自我更新潜能扩大MSC从年龄和患病的捐助者在纤维蛋白支架上。我们已经表明,年轻的MSC保持更好的自我更新软纤维蛋白凝胶,但这种好处是部分糖尿病生物体或细胞年龄时丢失。额外的支架的修改可能是必要的,以获得同样的效果出现在年轻的MSC。

 承认

作者感谢唐娜博士卖家提供糖尿病动物。

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