量化的肺损伤Elastase-Induced肺气肿的小鼠模型

文摘

客观的。定义的敏感性microcomputed断层摄影术(ct机)派生的量化描述符肺损伤引起的弹性蛋白酶滴注法。材料和方法。30肺弹性蛋白酶治疗和30控制/ J小鼠分析1、6、12、24小时和7和17天后弹性蛋白酶滴剂使用breath-hold-gated ct机(我),(2)肺功能测试(击球),(iii) RNA细胞因子表达的rt - pcr和histomorphometry (iv)。对于后者,一个自动并行软件工具集计算空域实施扩大描述符:意思是线性拦截和加权的领空直径(,,)。支持向量分类器的训练和测试是基于三个nonhistological描述符使用地面实况。结果。发现统计上显著差异两组之间在所有时间点。此外,在1小时(24小时)显著降低比在24小时(7天)。micro-CT-derived描述符上的分类器训练达到曲线下面积(AUC) 0.95远高于其他人(击球AUC = 0.71;细胞因子AUC = 0.88)。结论。Micro-CT-derived描述符比其他方法相比更敏感,检测在活的有机体内疾病的早期迹象。

1。介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一个复杂和异构的疾病。传统上,两种表型的描述了慢性阻塞性肺病:阻塞性支气管炎和肺气肿。因为目前的吸烟趋势和进步的世界人口的老化,增加COPD患病率和死亡率相关预计在未来几十年里1]。肺气肿病理上定义的永久性扩大空域远端终端细支气管,伴随着破坏他们的墙壁,没有明显的纤维化(2,3]。在分子水平上,肺气肿是一个inflammatory-driven过程引起的肺弹性蛋白和胶原蛋白的酶破坏嗜中性粒细胞和巨噬细胞弹性蛋白酶4]。这个过程是在大多数情况下,吸烟引起的5]。

动物模型是研究疾病的关键工具。可能最广泛的扩展一个是elastase-induced肺气肿的小鼠模型,由于其简单性和低成本(6]。需要高效、敏感的量化损伤疾病的特征和治疗干预措施的评估模型。在本文中,我们描述了有效的和敏感的方法量化组织学领空的扩大体外。这反过来可以用作一个适当的参考黄金标准描述符提取的比较和评价ct机和其他non-radiological在活的有机体内技术。

均值线性拦截()[7)是一种stereological规成立于六十年代初,通常用于量化肺气肿在组织学标本。被认为是一个空域指数大小,虽然形式上是一个测量表面area-to-volume比率。计算需要计算线性拦截(见图1),这是一个相对简单的手工任务(8]。然而,它不能等同于计算空域形状的大小没有知识。韦贝尔et al。9通过比较]说明这个问题计算在球面和椭球的体积相等。这两个物体的表面积不同,这是更大的椭球体。结果,测量线性随机拦截从横截面的对象将产生卷()表面()比为椭球低于球体。的确,低估了严重肺气肿的异构(即样本。,samples containing many small airspaces surrounding a few enlarged ones).

解决这个问题,而利用现代计算机的计算能力,Parameswaran et al。10)提出了三种替代测量(,,基于空域的时刻等效直径。当使用高的时刻,最大的空域加权比小的更严重。因此,应该更准确更健壮的比量化异构的、温和的肺气肿。作者测试他们的假设(即。、形状的依赖关系及其对异构的无法探测空域扩大样本)对合成图像和一些肺实质图像。这种方法之后,雅各等人在11)表明,发现更明显分离的控制和smoke-exposed老鼠(2 - 4支/天,6天/周,24周)。

在这里,我们提出一个全自动和并行计算上述指标的工具集(,,,)在整个组织部分以合理的速度。然后我们用这个in-house-developed软件量化elastase-induced肺气肿的肺气肿在大型研究小鼠模型(12),从早期阶段。

尽管histomorphometry形态疾病特征被认为是最准确的方法,这是一个体外技术。有几个其他的技术,可以用来描述在小鼠肺损伤和肺气肿在活的有机体内。这是巨大的价值的评估,例如,新的药物或治疗干预措施的有效性。其中,微型电脑x射线断层扫描(ct机)是一种特别适合肺的形态成像(表1)[13]。使用ct机,中度到重度肺气肿的形式可以很容易地发现在elastase-treated老鼠,比参与小鼠肺实质变暗(见图2)。肺功能测试(击球)提供生理数据对肺功能及其特征参数(电阻和合规)12]。最后,肺部的炎症反应造成的损害侮辱可以评估通过观察蛋白质或RNA细胞因子的水平,使用血浆或肺组织提取物。这些方法所提供的信息是互补的。

在这项研究中,我们训练一个分类器评估和比较的敏感性微ct density-based-derived描述符和其它non-radiological技术(即。击球时,单室模型,和RNA检测elastase-induced肺损伤炎性细胞因子水平)。histomorphometrical参数用作参考价值,因为是一个广义shape-independent定量描述符的空域维度,适合自动计算。

本文结构如下。在材料与方法中,我们描述了动物准备、击球和微ct成像,测量和组织学为RNA样品制备细胞因子水平。我们还展示了图像采集、图像分析管道,和组织学的统计分析数据。此外,我们描述我们的分类器以及它们如何被训练使用。下一节介绍了结果的敏感性histomorphometric描述符检测控制和elastase-treated组之间差异侮辱后几个小时,和研究疾病进展。最后,我们报告的其余部分描述符的能力充分的动物进行分类使用组织学作为参考。本文以讨论和结论。

2。材料和方法

2.1。动物准备和在活的有机体内测试

2.1.1。动物的准备

所有实验动物操作有关的协议都是西班牙纳瓦拉大学的实验伦理委员会批准。六十,11-week-old老鼠均匀分布到一个控制和治疗组。治疗小鼠气管内的灌输与6单位每30克猪胰弹性蛋白酶(PPE、EC134GI EPC、MI、美国),如先前所述出版协议(14]。控制动物生理盐水的灌输。每组五个动物采样在1小时,6、12、24和天治疗后7和17。在每个时间点,所有的动物接受胸微ct成像和肺功能测试。然后,他们牺牲了,肺为histomorphometry收集和细胞因子的测量(RNA和蛋白质)。

2.1.2。肺功能测试

动物麻醉,气管内的空心,连接到一个Flexivent啮齿动物呼吸机设置(Scireq、蒙特利尔、QC、加拿大)的速度200次/分钟,潮汐卷10毫升/公斤。肺阻力()和遵从性(使用single-frequency-forced振荡)测量值,拟合测量数据到一个单室模型(15]。所有测量都是重复三次。

2.1.3。Breath-Hold-Gated微ct成像

麻醉,人工通风老鼠使用x射线扫描微型电脑层析x射线摄影机(Micro-CAT II,西门子临床前解决方案,诺克斯维尔,TN,美国)。用于微ct图像采集参数表中给出2。七百微ct预测在650年收购了等压呼吸女士持有H在12厘米₂o .两个正常的呼吸周期诱导呼吸之间。进行肺活量扰动每20呼吸防止肺不张。

重建的三维图像与各向同性46 640片μ米体素的大小和每片像素。扫描时间大约是30分钟。估计的x射线剂量为71.6 cGy /考试(西门子临床前解决方案,诺克斯维尔,TN,美国)。水幻影被用来校准图像Hounsfield单位(胡)。

2.1.4。微ct图像分析

首先,肺部自动划定在3 d ct机使用现有的图像分割方法(16]。然后,航空公司是分割和重建使用由我们开发的一种快速、鲁棒算法[17]。算法是基于快速行进波阵面传播树分为部分。许多特定的规则被应用在每一个迭代的传播,以避免不必要的漏到实质。分段航空,左右主支气管的半径测量(RMBR LMBR, resp)计算。航空公司是量化之前从肺容积中删除。另外两个实质损伤描述符也计算:意思是肺体元强度(MLVI)和相对体积低于900−胡锦涛(VBT)。这个阈值被选中是因为强度值低于900−胡锦涛是罕见的在扫描的健康小鼠(VBT小于5%的肺总量在任何年龄的所有健康的动物)。

2.2。样品制备的RNA细胞因子表达与组织学

老鼠被麻醉,然后牺牲放血。接下来,肺部被固定在一个恒压20厘米的H₂从附件叶o . RNA提取,然后执行中存在应用生物系统公司7900 ht快速实时PCR系统。四个免疫调节细胞因子和趋化因子参与肺部炎症反应(18)进行了分析,即白介素6(白细胞介素6)10 (IP10)免疫蛋白,角化细胞化学引诱物(KC)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP1)。β2微球蛋白(B2M)作为内生控制基因的实验。

三个石蜡块不同肺小叶的创建和保留进行组织学分析。三个/块nonconsecutive部分被剪掉了,苏木精和伊红染色()),导致每鼠标共有九个幻灯片,包含两个叶碎片。获得和分析部分的总数是1080。

2.3。组织学图像分析

2.3.1。图像采集

1080张幻灯片视图的所有部分获得使用自动化Axioplan 2即蔡司显微镜(卡尔蔡司,耶拿,德国)。每个幻灯片最初收购Plan-Neofluar客观(数值孔径NA = 0.035,放大1.25倍,3.546像素的分辨率μ米/像素)。自动阈值方法首先进行(19)被应用于检测所有组织区域。度量对象的大小,只有对象与一个合理的大小来表示整个肺叶的部分被认为是进行进一步处理。为每个对象,创建一个边界框和它的四个顶点的坐标显微镜。然后,一个自动程序扫描这些地区Plan-Neofluar客观(NA = 0.3, 10倍,0.725μ米/像素)。一些重叠图像之间被允许领域促进大型马赛克的创造。的钉箱机ImageJ插件(20.)是用于它。由此产生的马赛克是存储在一个服务器进行定量分析。图3显示了一个示例马赛克(图3(一个))放大区域显示不均匀分布的领空增大(图3 (b))。

2.3.2。图像分析

准确量化善意的气性空气空间,所有船只,肺泡和虚假的结构必须承认,从图像中删除,因为他们可能会与放大肺泡空间混淆。在下面的文章中,我们描述了方法段血管,肺泡和图像描述符的提取。

分割
总结了分割算法的主要步骤如图所示的流程图4和快照如图所示5。这张照片包含一个特定大小的容器的中心视野。首先,8位灰度提取绿色通道24位RGB,因为它提供了最大的对比背景和红蓝)染色的组织。然后,面具的实质组织获得的阈值图像的直方图。一个典型的组织学图像的直方图是monomodal。因此,常见的双峰阈值技术首先thresholding-would不是工作得很好,留下了一些组织结构墙。作为一种替代方法,最大偏差单峰阈值(21(图)是使用6(一)从背景中提取所有组织区域。获得的面具就倒,所有的腔的结构被分割,通过连接组件贴上标签(图6 (b))。
自血管和细支气管腔可以与大空域混淆,他们必须从图像检测和去除与量化在继续之前。为此,我们应用二进制侵蚀的面具薄壁组织使用的结构元素大小7删除所有,但最厚的墙壁,相应的血管和细支气管。然后,我们使用所呈现的几何方法(22,23和有条理的Python包中实现24)计算凸壳剩余的墙(见图6 (c))。接下来,凸壳之间的交叉的墙和重心标记结构和执行所有的结构(即存在非空的十字路口。、血管和细支气管)从细分(见图中删除6 (d))。这个过程的最后,所有的标记区域代表空域。
十字路口的计算是一个集约经营。增加的速度,这个操作进行downsampled版本的形象。将采样因素是经验设置为四个,以避免失去壁结构。然而,空域扩大描述符的提取是进行全分辨率的图像。

提取描述符
我们从组织学中提取四个描述符,即线性意味着拦截和空域的时刻等效直径(,,)。
经典的意思是线性拦截被定义为平均长度的线性拦截在肺。在本文中,一个近似的计算如下:标记图像(图6 (d)每个叶)的像素转换成一个数组;然后光栅扫描的图片,和积极的像素的数量每一对之间连续两个零(墙)像素(即计算及其价值。的长度th线性拦截)存储;然后,计算的意思是所有存储线性肺叶上截取的长度。
计算索引,我们首先计算的面积th空域()的分段,标记图像,通过计算每个标记区域内像素的数量。这个值是按比例缩小的物理尺寸使用客观的校准。
然后领空直径相当于每个空间被定义为 等于一个圆的直径和面积。
索引的家庭然后定义为等效的两个时刻领空直径的比例分布呢: 在哪里表示算术平均值。可以表示为中央的时刻领空直径的函数。特别是,空域直径的算术平均值。是一个函数的意思()和方差(): 和是一个函数的,和偏态(空域的直径:

计算体系结构
代码写在一个混合的Python / c++平台,是专门设计来利用并行性。首先,这一过程是产卵走图像目录树和收集文件要处理。然后,为每个图像创建一个工作描述,其中包含所有参数用于指导分析通过详细的步骤。每个作业添加到网络上共享队列。几个进程访问远程队列从五个不同的机器上,下载一个职位描述,并在本地执行它。结果保存在一个分布式文件系统。

2.3.3。统计数据

中位数和四分位范围(差)计算每个组织学描述符和时间点。控制和使用Mann-Whitney elastase-treated组比较U以及。来衡量进展,执行相同的测试在elastase-treated动物连续时间点。值≤0.01被认为是具有统计学意义。的语言和环境统计计算(25)被用于统计分析。

2.4。分类

在前面的部分中,我们介绍了三个不同的疾病描述符:ct机density-based描述符:多层互连(胡),VBT (%), RMBR (μ米),LMBR (μ米);肺功能测试单室模型参数:电阻(H)(厘米₂O /毫升/秒)和遵从性(H) (mL /厘米₂O);RNA表达细胞因子浓度测量:白细胞介素6、IP10, KC, MCP1。

支持向量机(SVM)分类器是为每个描述符集创建。选择的内核是一个高斯径向基函数。分类器是由两个参数:面积的影响支持向量数据空间和软边缘参数。选择了最佳参数组合网格搜索的指数增长的序列和。特别是,选择的时间间隔(10⁻⁹,10³),在(10⁻¹,10¹³)。每个参数的组合是旨在,交叉验证精度最好的参数选择。在训练数据集划分(样本的60%)和测试组(剩下的40%)。

对于每一个分类器,生成接受者操作特征(ROC)曲线。histomorphometrical参数作为黄金标准和控制动物的第三四分位值作为阈值。所有可能的组合的特性,经典的性能指标的ROC曲线下面积(AUC)分数计算测试数据集。结果比较确定最佳分类器。

3所示。结果

3.1。组织学分析

均值线性拦截()和加权平均数(,,)也进行了计算,并用作估计领空扩大。图7和表2(),3(),4(),5()显示这些参数的过程在整个实验过程中两组(控制和弹性蛋白酶诱导)。正如所料,没有发现进展在对照组,不管所使用的参数。在治疗组中,所有的参数显著增加()从1小时到24小时后弹性蛋白酶治疗。和也有统计上显著的增加()从弹性蛋白酶治疗后24小时一周,不知为何未被发现的和。没有检测到进程在任何情况下从一个星期后17天的侮辱。

关于情感的控制和治疗组之间的差异,在各个时间点上均显著不同弹性蛋白酶除了在6 - 12小时后管理。在各个时间点上均显著不同除了早期,治疗后1小时。相反,和明显不同()的治疗和控制组织之间的时间点。总之,尽管所有的参数产生相似的结果,和更敏感的气性老鼠和控制之间的区别。

每个肺叶部分的计算时间约为20分钟。

3.2。分类

我们使用三个分类器为基础,分别在:ct机density-based描述符,RNA细胞因子表达qPCR相对RNA浓度的测量,和单室模型参数从肺功能测试。

交叉验证精度情节的选择最优估计参数如图8,9(一个)和9 (b)ct机、细胞因子表达和肺功能测试分类器,分别。最优估计参数,最佳的一组特性,auc,成绩表6而图10显示了ROC曲线为每个参数的最佳分类器集合。Micro-CT-based分类器使用多层互连特性,VBT, RMBR显示了最佳性能的AUC 0.95和一个得分为0.92,如图所示的ROC曲线真阳性率最高可以达到同样的假阳性。总而言之,RNA细胞因子表达分类器使用特性KC,白细胞介素6、IP10性能比0.88 ct机的AUC略微差一些得分0.71虽然达到最好的真阳性率0.8的假阳性率0.1。基于特征的分类器功能抗性表现明显比其他两个分类器的AUC 0.71和一个得分为0.66,最接近随机分类器的性能。

4所示。讨论

这项工作的主要目的是评估和比较的敏感性量化elastase-induced肺损伤,使用micro-CT-derived描述符,肺功能测试基于单室模型,细胞因子和RNA表达。Histomorphometry作为黄金标准的比较。

我们的结果表明,能够区分控制和elastase-treated组在各个时间点上,早在一个小时后开始治疗。早期领空扩大可能造成表面活性剂功能障碍导致的弹性蛋白酶管理。的能力歧视这样的早期损伤可以归因于这一事实大量重量大空域和因此,更好的反映了领空大小分布。疾病的进展,和检测空域扩大在第一个24小时,从那时直到一周后治疗。最后增加被错过了和。

与先前的研究相比,我们histomorphometry价值观得到使用一个相当大的样本量。在以前的作品,一些随机领域被从每个获得小鼠肺。这里相反,整个肺叶的马赛克图像获取和分析部分,可能由于我们的完全自动化的软件。其他有趣的特点,像我们这样的自动化系统是运营商的减少偏见和大量减少的时间致力于分析。最后,我们的方法成功的关键是我们的工具集实现一个机制来消除肺泡和船只。以前,主要航空公司和脉管系统手动丢弃在收购或分析时使用大量的人工交互。

ct机特别适合学习在活的有机体内肺部疾病的动物模型的发展13]。我们已经建立了一个通用的协议微ct图像采集,允许纵向研究(26]。协议包括气管插管和iso-pressure呼吸减少运动工件。几个细分和分析方法是量化的影响疾病非常嘈杂,artifact-plagued微ct图像(12,16]。这些方法允许单独定量测量肺部和呼吸道,从而允许监控疾病的发展。在这项工作中,我们发现,使用micro-CT-derived SVM分类器,多层互连特性,VBT, RMBR达到很高的AUC,分数,从而表明ct机生产的可靠测量领空扩大甚至在疾病早期阶段。使用强迫振荡技术也进行肺功能测试与气管插管。肺功能测试参数的SVM分类器训练只使用组织电阻()最好的AUC和实现分数。这可能看起来很奇怪,最优分类器使用而不是或两者兼而有之。在长期的研究elastase-induced模型,被清楚地反映肺高刚度增加。我们的研究结果提出了(12]显示相反,减少在第一个24小时。只有在星期4开始增加。我们假设这种行为可能与急性炎症反应发生在elastase-induced模型,立即开始治疗后第七天,几乎消失。另一方面,支持向量机分类器训练的相对较好的业绩,这个短期炎症细胞因子表达水平可能反映了。然而,它能够探测空域扩大在长期研究尚未证实。

最后,作为结果,详细解释micro-CT-derived描述符似乎特别适合的空域估计扩大elastase-induced小鼠肺气肿模型。

5。结论

在本文中,我们提出了开源软件的自动量化领空扩大在大型组织组织部分。使用这个软件,我们可以自动处理大量的数据在一个相对短的时间内,以最少的用户交互。自动测量能够探测空域扩大后早期弹性蛋白酶的侮辱。这些测量是用作地面真理评估ct机和其他non-radiological技术的敏感性。有趣的是,典型的respiratory-gated ct机density-based描述符(平均肺密度和相对体积低于900−胡锦涛)和右主支气管的半径达到高敏感性和特异性识别早期疾病的迹象。

缩写

AUC:	ROC曲线下的面积
B2M:	β2微球蛋白
:	合规
慢性阻塞性肺病:	慢性阻塞性肺疾病
:	平均肺泡面积
:	纠正了一阶统计矩
:	修正的二阶统计矩
):	苏木精和伊红
白细胞介素6:	白介素- 6
IP10:	免疫蛋白10
余:	角化细胞化学引诱物
LMBR:	左主支气管
:	线性拦截
ct机:	Microcomputed x射线断层扫描
MLVI:	意思是肺容积密度
MCP1:	单核细胞化学引诱物蛋白1
击球时:	肺功能测试
:	肺阻力
RMBR:	右主支气管
中华民国:	接受者操作特性
支持向量机:	支持向量机
VBT:	量低于阈值。

确认

这个项目部分由“UTE项目CIMA;西班牙卫生部授予PI070751和RTICC RD06/0020/0066;独特的战略项目的子程序下西班牙科学和创新部授予MICINN PSE辛巴达和PSS 0100000-2008-2;nonfundamentally指导项目研究经费资助下西班牙科学和创新部MCYT tec2005 - 04732, MICINN dpi2009 - 14115 c03 - 03和MINECO dpi2012 - 38090 c03 - 02。答:Munoz-Barrutia持有·拉蒙-卡哈尔MICINN的奖学金。m . Ceresa拥有托雷斯y农业部长MICINN的奖学金。

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