舒尼替结合Th1细胞因子强化人类乳腺癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长的her - 2的小鼠模型^pos乳腺癌

文摘

虽然免疫疗法在癌症治疗取得了显著进展,他们通常必须结合标准的治疗方法,包括细胞毒性药物,实现最大的临床益处。免疫疗法进一步先进和完善,相当大的努力将被要求识别联合疗法,临床反应的同时,最大化减少不愉快,有时危及生命的标准疗法的副作用。在过去的二十年里,证据,Th1细胞因子可以在保护性的抗肿瘤免疫中发挥核心作用,Th1细胞因子的组合可以在癌细胞诱导衰老和细胞凋亡。探索靶向药物结合的可能性Th1-polarizing疫苗,我们进行了一项研究,研究的影响结合Th1细胞因子和相对广谱酪氨酸激酶受体拮抗剂,舒尼替。我们发现,当五个表型不同的人类乳腺癌细胞系受到舒尼替加重组Th1细胞因子治疗干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α观察,协同效应的参数包括凋亡细胞死亡的不同方面。有趣的是,舒尼替被发现有一个深刻的抑制效应T细胞分泌干扰素-的能力γ,表明体内使用这种药物可能会阻碍健壮Th1反应。尽管如此,这种抑制是规避her - 2的小鼠模型^pos乳房疾病通过提供重组移行细胞实现联合治疗显著比代理更有效。

1。介绍

对her - 2^pos乳房恶性肿瘤,当CD4更好的临床效果观察^pos淋巴细胞浸润的显示特征Th1-type细胞(1]。有趣的是,位于新辅助疫苗有选择性地促进强劲的发展anti-HER-2 Th1免疫力,定义为选择的CD4 T细胞分泌细胞因子,如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α可以诱发肿瘤前期CD4的积累^pos(辅助T细胞)和CD20^pos(B细胞)淋巴细胞her - 2的网站^pos早期乳腺癌(导管原位癌,DCIS) [2,3]。在这些研究中,大约30%的接种her - 2^pos呃^负的受试者完成病理反应(定义为没有可检测剩余的疾病)的手术。对ER^pos主题,只有5%显示pCR。体外研究表明,原则Th1细胞因子在各种her - 2也可以诱导衰老和细胞凋亡^pos和her - 2^负的乳腺癌行(4,5]。

有趣的是,一些呃^pos乳腺癌行显示抗Th1细胞因子诱导的细胞凋亡,但当抗雌激素药物与细胞因子相结合,细胞显示细胞凋亡水平符合他们的ER^负的同行(6]。这些研究似乎表明,药物抑制生长因子信号(本例中是通过ER受体)可以进行宣传之前耐药细胞细胞因子诱导的细胞死亡。这一发现提出了一个抗雌激素药物临床试验将提供一致对her - 2疫苗接种^pos/嗯^pos科目。在这里,发现抗雌激素治疗+免疫平衡的pCR ER^pos主题与ER^负的疫苗接受者在30%左右(6]。

这样的研究表明,药物抑制生长因子信号结合诱发的一代的Th1免疫力能增强疫苗反应率。他们还表明,Th1细胞因子可作为体外替代Th1免疫筛选候选药物联合抗肿瘤效果选择有前途的制剂在临床试验中测试。

与雌激素受体不同,大多数生长因子受体酪氨酸激酶受体。为了测试的假设抑制生长因子信号是一个很好的整体战略改善Th1 cytokine-mediated抗肿瘤免疫力,我们研究了一种广谱RTK拮抗剂药物的能力,舒尼替,结合Th1细胞因子,加强合作活动对乳腺癌细胞死亡。苹果酸舒尼替是一个口头管理,小分子抑制剂干扰多种rtk包括VEGFR的活动,装备,FLT3和PDGFR。在体外研究已经证明,舒尼替抑制人脐静脉内皮细胞的生长依赖于VEGF, PDGF和干细胞因子(SCF)。舒尼替了时间和dose-depended抗肿瘤的活动在人类肿瘤异种移植模型(7)对结肠癌(8),神经胶质瘤,黑色素瘤,和乳房7癌症细胞系。它也被检查出乳腺癌患者在临床试验中并一直在检查组合与其他药物如曲妥珠单抗(9),多西他赛(10),和卡培他滨11]。虽然药物并没有显示出足够的活动与乳腺癌保证采用的标准治疗恶性肿瘤治疗方案,目前的迹象包括胃肠道间质瘤,先进的肾细胞癌,和一些胰腺神经内分泌肿瘤。

在本文的研究中,我们表明,舒尼替和Th1细胞因子可导致极大地增强了对一个5人小组活动的乳腺癌细胞系,它们代表了各种不同的表型,这表明一个总体战略,结合干扰受体酪氨酸激酶感受器Th1免疫可能代表一个有用的方法来开发改进的免疫疗法。潜在的警告了舒尼替的趋势也深刻地抑制干扰素-γ由T淋巴细胞分泌。成功开发的一般方法可能会涉及更有选择性的使用RTK拮抗剂不强烈影响T细胞的功能。另外,T细胞重组效应细胞因子以及药物可以管理,以便达到治疗水平的代理都可以即使T细胞无法biosynthesize这些分子在药物压力下。

2。材料和方法

2.1。试剂和细胞培养

舒尼替(Selleckchem,休斯顿,德克萨斯州)溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和体外细胞培养媒体或PBS稀释使用。人乳腺癌细胞株mda - mb - 231, mda - mb - 468, SKBR-3 MCF-7, hcc - 1419从美国获得类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。mda - mb - 231, hcc - 1419和mda - mb - 468细胞株培养RPMI媒体(Sigma-Aldrich)。MCF-7细胞系培养在EMEM媒体(写明ATCC)。SKBR-3细胞培养在本人的5媒体(基博;马里兰州洛克维尔)。在所有媒体,10%胎牛血清(大西洋生物制剂、迈阿密、FL), 1%笔/喉炎的症状(Gibco), 1%丙酮酸钠,NEAA 1%, 1%谷氨酰胺(Gibco)补充说,培养细胞维持在37°C和5%的公司₂湿润的气氛。

2.2。Alamar蓝试验

乳腺癌细胞系镀在集群96孔板密度范围从5到 细胞每取决于个人线的生长特性。经过12个小时的最初的文化,与Th1细胞因子(TNF -细胞治疗α和干扰素-γ;每个PeproTech 5 ng / mL,落基山,NJ)和舒尼替(10μ米),然后培养72小时的额外的时间,在这段时间里,20μL(0.15毫克/毫升的刃天青盐在PBS (Sigma-Aldrich)被添加到每个。6 - 7小时后额外的文化,文化上层清液的光密度测量在630 nm使用Bio-Tek(模型EL312E)标使用Gen5分析软件。

2.3。可行性与锥虫蓝染色

乳腺癌细胞被播种密度 一夜之间在集群12-well盘子和孵化。第二天,细胞与细胞因子治疗(每个TNF - 5 ng / mLα和干扰素-γ)、舒尼替(10μ米),或不及时治疗。进一步培养72小时后,细胞被刮收获,0.002%台盼蓝染料(Lonza Walkersville, MD)添加到30μL细胞悬液的体积。染料吸收是评估通过流式细胞术使用FlowSight血细胞计数器(Amnis /微孔)使用642 nm激光,执行和分析使用想法6.2版本软件如前所述[12,13]。

2.4。膜联蛋白V / Propidium碘染色

治疗乳腺癌细胞系和台盼蓝研究培养的描述。在72小时后治疗,细胞被刮收获和洗膜联蛋白V染色缓冲区(BioLegend,圣地亚哥,CA)。细胞被沾fluorochrome-labeled膜联蛋白V (3μL添加到40μL总量)在4°C (BioLegend) 15分钟,其次是增加propidium碘(π)(1μg / mL) (Sigma-Aldrich)立即分析之前使用FlowSight成像流式细胞分析仪(使用642 nm和488 nm激光)和运行思想6.2版本软件如前所述12,13]。

2.5。评估线粒体细胞色素C的相对水平

SKBR-3细胞系被视为台盼蓝研究描述。在72小时后治疗,细胞收获借助胰蛋白酶(Gibco)和彩色intramitochondrial存在的细胞色素C根据克里斯坦森的方法等。14]。简单地说,100年resuspended细胞μL冰冷的透化作用缓冲(100毫米氯化钾,100μ在PBS g / mL洋地黄皂苷)。这些都是孵化5分钟,100年μ在PBS L多聚甲醛(4%)添加到permeabilized细胞。样本离心机在500 RPM在4°C 5分钟之后,上层清液的清除。细胞培养与4%多聚甲醛在室温下20分钟。细胞被洗了200年的三倍μL PBS (700 RPM 5分钟在4°C),并在200年resuspendedμL阻断缓冲区(皂苷0.05%和3% BSA在PBS),培养1小时在rt APC-conjugated anti-cytochrome C (1: 200) (BioLegend)添加和孵化一夜之间在4°C。第二天,细胞被洗了200年的三倍μL PBS (700 RPM在4°C)为5分钟。Anti-mouse二级(1:200)抗体(BioLegend)补充说,100年稀释μL阻断缓冲区,孵化一个小时在200年rt,细胞被洗了三次μL PBS (700 RPM在4°C)为5分钟。细胞色素C的表达进行了分析使用FlowSight成像血细胞计数器使用642 nm和想法软件套件6.2版。

2.6。评估表面her - 2的表达

台盼蓝研究SKBR-3细胞被视为描述。在72小时后治疗,细胞被刮收获,在PBS洗,resuspended 1毫升流式细胞仪缓冲区(PBS + 1%的边后卫+ 0.01%叠氮化钠)。圣地亚哥APC-conjugated anti-HER-2抗体(BioLegend CA)然后添加15分钟在4°C,和细胞表达her - 2的分析流式细胞术使用642 nm激光激发FlowSight成像血细胞计数器运行思想6.2分析软件。

2.7。通过免疫印迹分析评估PARP状态

SKBR-3细胞被播种 细胞在10毫升/毫升总量在培养皿中。第二天,细胞治疗5 ng / mL的Th1细胞因子,10μM舒尼替,或两者兼而有之。孵化后72小时,样本收集。收获细胞离心5分钟,每分钟800转,上层的删除和丢弃。100细胞颗粒细胞溶解使用μTris-base L•瑞帕裂解缓冲(50毫米,150毫米氯化钠,1% Triton-X 100钠脱氧胆酸盐,0.5%和0.1%十二烷基硫酸钠)添加了皮尔斯蛋白酶抑制剂鸡尾酒(热科学,罗克福德,IL)和PhosStop磷酸酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,曼海姆,德国)。这些提取物在20000转离心20分钟在4°C。上层清液收集和储存在-80°C之前分析。

BCA蛋白质分析被用来生成一个标准曲线估计在每个提取的蛋白质。提取被稀释5倍减少加载缓冲区,涡短暂,煮5分钟。30微克的总蛋白从每个样本被加载到4 - 15%迷你千变万化TGX凝胶(Bio-Rad大力神,CA)和分离了40分钟在160伏特。蛋白质的凝胶被electrotransferred到PVDF膜(Bio-Rad) 100伏了一个小时。膜与TBS-T洗3次(20毫米三、150毫米氯化钠和0.1%渐变20 pH值为7.6),5分钟的间隔。膜被封锁的5%牛奶30分钟和孵化隔夜主要抗体:1:1000年PARP anti-rabbit(细胞信号,丹佛,MA)和1:1000反β肌动蛋白anti-mouse (GenScript,皮斯卡塔韦,NJ)。膜被TBS-T缓冲区,和一个适当的二次HRP-tagged抗体增加,孵化在室温下了一个小时。其次是洗膜与TBS-T 3 * 5分钟的间隔。细胞膜是由使用西方SuperSignal Pico化学发光底物(热科学)。化学发光检测使用富士拉斯维加斯3000执行检测系统(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。带强度和褶皱变化使用ImageJ量化分析。

2.8。T细胞功能检测

同种异体、人类健康志愿者外周血单核细胞获得通过leukapheresis和用于实验提供通知书面同意后,按照《赫尔辛基宣言》的原则和NIH指南对于人体,通过协议的机构审查委员会批准的克利夫兰诊所(08 - 957)和肯特州立大学(18 - 421)。血液制品分为CD14^pos外周血单核细胞和lymphocyte-enriched分数通过逆流离心淘洗如前所述[15低温贮藏在液态氮,直到使用)和维护。树突细胞来源于单核细胞解冻和孵化在巨噬细胞SFM媒体(Gibco)和补充了gm - csf (50 ng / mL) (PeproTech)和il - 4 (1000 U) (PeproTech)。第二天早上,干扰素- 1000 Uγ(PeproTech)添加到文化,另外2小时后,有限合伙人(50 ng / mL;圣地亚哥InvivoGen CA)补充道。细胞被允许孵化为另一个4小时在收获之前,洗,resuspended RPMI补充5%的人类血清(Lonza)。同种异体lymphocyte-enriched分数被解冻,成长在一个相同的培养基。细胞被组合在一个20的比例:1(淋巴细胞:树突细胞)和镀在48-well集群菜1毫升每口井的总量。同种异体coculture要么接受舒尼替(10μ米)或不及时治疗控制。72小时后,上层清液是干扰素,收集和分析γ通过ELISA根据制造商的协议(BD生物科学,圣地亚哥,CA)。

有关酶联免疫斑点,对冻存未分离总外周血单核细胞(PBMCs)获得正常健康的捐赠者和干扰素-γELISPOT包从蜂窝技术有限公司(C.T.L.购买瓶的高度,哦)。根据制造商的建议,镀PBMC的解冻,每口井的200000个细胞的密度(在10的存在与否μ舒尼替)CEF-Class我肽池“+”(常见的病毒肽的混合物;10μ信用证,C.T.L)或破伤风毒素(2μg /σ)召回抗原或孵化仅在媒体(控制)。第二天,细胞被移除和干扰素-γ按设备指令spot-forming细胞被评估。所有盘子都读ImmunoSpot分析仪(C.T.L)。

2.9。治疗模式

雌性Balb / c小鼠,6 - 8周的年龄,从查尔斯河实验室购买(马威尔明顿)。他们依法维护全国卫生研究所的指导方针,在一个特定的无菌环境动物设施在肯特州立大学在坎宁安大厅。实验机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC) 481 GK-19-05肯特州立大学的协议。吐蕃乳腺癌细胞,来源于Balb-neuT鼠her - 2 (neu)转基因小鼠(Rovero et al . 2000),培养在RPMI补充10% 胎牛血清(的边后卫;佐治亚州亚特兰大的生物制剂,华丽的分支),100和100单位/毫升的青霉素μ克/毫升的硫酸链霉素(BioWhittaker Walkersville, MD), 2更易与L谷氨酰胺(BioWhittaker), 1更易与L丙酮酸钠(BioWhittaker),和1%的非必需的氨基酸(BioWhittaker)。细胞与细胞分裂收获缓冲区(Gibco,宏伟的岛,纽约),与PBS洗2次,然后在PBS resuspended接种。

老鼠被分成4组包含6小鼠每组。0天,所有老鼠皮下接种,进入该地区的乳房的脂肪垫, 100年吐蕃细胞μPBS的L。7天,肿瘤明显时,老鼠也不及时治疗(控制),通过腹腔注射治疗与舒尼替(1毫克/剂量)干扰素-γ(10μg),或两者同时治疗。日程管理个人实验表示。使用卡尺测量肿瘤大小(沿着最长轴长度乘以垂直宽度)每2 - 3天。

2.10。统计方法

单向方差分析(方差分析)进行了统计分析;值小于0.05被认为是显著的。确定之间的统计学意义,治疗组使用图基的诚实的显著差异测试。单向方差分析进行了分析使用SigmaPlot 12.5软件(Systat软件公司,圣何塞,CA)。

3所示。结果

3.1。Th1细胞因子和舒尼替共同抑制乳腺癌细胞的新陈代谢

五人乳腺癌细胞株mda - mb - 231, mda - mb - 468, MCF-7, SKBR-3,和hcc - 1419治疗Th1细胞因子(IFN -γ和肿瘤坏死因子-α),舒尼替,或两者兼而有之。添加Alamar蓝色染料,这是降低新陈代谢活跃的细胞(诱发变色),是用来确定个人和联合治疗对细胞的影响(低光密度对应于高代谢活动)。治疗Th1细胞因子和舒尼替导致更大程度的代谢抑制比治疗仅为所有5测试线(图1; )。Isobole分析(补充图1)似乎表明药物和细胞因子之间的协同作用。

3.2。Th1细胞因子和舒尼替最大化细胞死亡

Alamar蓝色化验检测抑制细胞的代谢活动。然而,这并不能证明任何观察到抑制新陈代谢是实际的细胞死亡的结果。确定细胞死亡,用台盼蓝染色进行活体染色。乳腺癌细胞系受到Th1细胞因子,舒尼替,72小时,或不及时治疗(Rx)。显微镜检查显示相当大的细胞死亡的细胞;所有治疗组显示完整细胞较少,高水平的亚细胞碎片,与其他可行的细胞表现出改变的形态学特征(没有显示)。细胞暴露在两个治疗似乎是受影响最严重。

这些视觉观察被证实当剩下的细胞被收获和台盼蓝染色,这是排除在活细胞但保留在死的,传授强荧光信号可以通过流式细胞术进行评估。5测试细胞系,为每个治疗组细胞荧光仪数据流显示在直方图(图形式2(一个))。在分析一个地区建立了区分low-staining(生活)high-staining(死)细胞,使细胞死亡比例分配所有治疗组。例如,在一个有代表性的实验,mda - mb - 468细胞死亡是显示最高的综合治疗:治疗(17.7%),Th1细胞因子(37.4%)、舒尼替(52.3%),治疗(91.1%)。mda - mb - 231显示了相似的结果:治疗(11.9%),Th1细胞因子(27%)、舒尼替(29.6%),(95.1%)。SKBR-3细胞,8.4%未经处理的死,Th1细胞因子为43.1%,治疗舒尼替为51.8%,78.3%。hcc - 1419细胞死亡从未经处理的5%,20.8% Th1细胞因子、舒尼替56.8%,87.9%为治疗组合。也发现类似的结果对雌激素受体阳性细胞株,MCF-7有31.2%死于治疗,56.7% Th1细胞因子、舒尼替59.4%,86.4%在治疗组合。

我们也分析了流式细胞仪数据差异总体荧光强度(平均通道荧光指数)。复合数据从至少三个独立的实验中每个细胞线见图2 (b)。所有乳腺癌细胞系测试,Th1细胞因子的组合+舒尼替导致荧光染料的吸收大大提高( )比单独治疗。综上所述,这些数据表明,Th1细胞因子的组合+舒尼替显著增加细胞死亡/要么单独治疗。

3.3。Th1细胞因子结合舒尼替加强细胞标志物的表达与细胞凋亡有关

来确定观察到的细胞死亡发生通过凋亡机制,许多凋亡标记检查。首先,治疗乳腺癌细胞系是沾FITC-Annexin V / propidium碘(π)和分析流式细胞术(图3)。晚期的细胞凋亡染色同时积极与代理。mda - mb - 468行,细胞的比例,明亮染色膜联蛋白V和π是如下:未经处理的12.6%,Th1细胞因子28%,舒尼替46.6%,治疗81.3%。对于mda - mb - 231细胞系,这些值是未经处理的9.45%,Th1细胞因子25.4%,舒尼替36.4%,治疗组合51.4%。SKBR-3细胞系,这些值是17.8%(未经处理的),34.7% (Th1细胞因子),47.3%(舒尼替),58.4%(治疗)。为hcc - 1419细胞系,这些值是17%(未经处理的),22% (Th1细胞因子),22.2%(舒尼替),34.8%(治疗)。同样,激素依赖性细胞系MCF-7 33%(未经处理的),51.4% (Th1细胞因子),39.4%(舒尼替),77.1%(治疗)。这些结果说明双重治疗乳腺癌细胞系Th1细胞因子和舒尼替导致增强的凋亡细胞死亡比单独治疗。

接下来我们把我们的注意力转向从线粒体细胞色素C的损失细胞系SKBR-3代表。对待SKBR-3收获,permeabilized(在解决方案包含氯化钾和洋地黄皂苷),和彩色anti-cytochrome C抗体。permeabilizing解决方案会破坏质膜完整性,允许从线粒体细胞色素C的释放中渗出细胞。然而,洋地黄皂苷在缓冲线粒体膜不妥协,允许保留和染色的细胞色素C在这些细胞器。这种差异只允许线粒体细胞色素C与被测量(14]。SKBR-3细胞系,每个治疗组的细胞荧光仪数据流显示在直方图(图形式4(一))。分析,定义一个区域来区分low-staining(损失的细胞色素C) high-staining(线粒体细胞色素C留存)细胞,允许细胞的百分比保留mitochondrial-associated测定细胞色素C。例如,在一个代表SKBR-3实验,细胞色素C污点是最低的两种治疗方法:没有治疗(83.9%),Th1细胞因子(83.8%)、舒尼替(23.8%),和治疗组合(4%)(图4(一))。也观察到类似的结果更多的试验。

最后,我们试图间接评估活动的刽子手半胱天冬酶3通过检查其下游的水平目标,PARP,对待SKBR-3细胞经免疫印迹分析。虽然单一代理PARP似乎收效甚微,舒尼替和Th1细胞因子似乎显示趋势失去PARP蛋白质实验试验(图4 (b))。

3.4。Th1细胞因子结合舒尼替最小化表面的表达her - 2相比,单一的治疗方法

先前的研究表明,Th1细胞因子治疗可能导致低水平的her - 2的表达在一些细胞系(4]。以确定是否加入舒尼替最大化her - 2损失,表面SKBR-3细胞系中检测her - 2水平。在72小时,治疗后细胞收获和沾her - 2抗体,通过流式细胞仪分析结果从一个代表性的实验中显示直方图(图形式5(一个)),和复合数据从3单独实验分析了相对荧光强度(图5 (b))。直方图数据显示抑制her - 2表达,最大限度地实现当SKBR-3细胞暴露在Th1细胞因子和舒尼替。意味着通道荧光分析从三个独立的实验验证,与双重治疗严重分歧的单一治疗(图5 (b); )。

3.5。舒尼替深刻地抑制干扰素-γ由T淋巴细胞分泌

自从舒尼替是一个相对广谱受体酪氨酸激酶抑制剂,我们担心这种药物会干扰T细胞的功能。因此我们进行干扰素-γELISPOT化验检查召回反应池的常见病毒多肽抗原(数字6(一)和6 (b)左面板)以及破伤风类毒素(数字6(一)和6 (b),对面板)。我们也进行同种异体高使用激活人类DCs刺激器和lymphocyte-enriched白细胞从MHC-unmatched个人分数应答细胞(图6 (c))。这些cocultures的存在与否进行中使用的相同浓度的舒尼替前研究癌症细胞系。我们可以看到有关酶联免疫斑点井(图示例6(一)综合分析)和3个独立的捐助者为每一个抗原(图6 (b)),舒尼替深刻的存在抑制干扰素-γ生产。同样,在8独特的刺激同种异体的配对DCs和反应的T细胞,几乎完全抑制干扰素-γ生产由舒尼替观察(图6 (c))。

3.6。治疗舒尼替加重组移行细胞抑制肿瘤生长在一个原位her - 2的小鼠模型^pos乳腺癌

因为我们证明舒尼替抑制干扰素——的能力γ由T淋巴细胞培养生产,得出的结论是,它可能会挑战把这种药物与疫苗接种等主动免疫治疗方案,因为它可能会干扰关键T细胞功能。因此我们试图设计一个潜在的可翻译为抗原T细胞疗法,绕过了需要提供重组干扰素-γ随着药物。因为前面的实验研究中使用了两个Th1细胞因子(TNF -α加干扰素-γ)结合舒尼替我们想第一个测试是否干扰素-γ只能大幅提高舒尼替效果。因此,小鼠吐蕃乳腺癌细胞浓度增加的孵化舒尼替鼠存在与否的重组干扰素-γ(图7(一)左面板)。Alamar蓝试验数据的统计分析显然最优浓度20μg / mL舒尼替表现出显著增强抑制代谢活动的双重治疗组相比,单一的治疗方法(图7(一)右面板),表明TNF -α没有绝对必要提高舒尼替的活动。

因此,小鼠植入一个右乳房的脂肪垫与吐蕃乳腺癌细胞,随后被分成4组每组小鼠(6)。当肿瘤明显(7天),治疗开始干扰素-组成γ(10μg /剂量),舒尼替(1毫克/剂量),同时和两个代理,或者,老鼠不及时治疗控制。肿瘤是使用卡尺测量周期性,32天,老鼠牺牲,都经过了精心和肿瘤切除,修剪多余的组织,并且称重。增长动力学显示小干扰素-抑制的影响γ,舒尼替温和抑制增长,和几乎完全迟钝的进步增长dual-treatment组(图7 (b)左面板)。每组的平均肿块显示相同的模式,与统计分析揭示,唯一的治疗明显不同于未经处理的控制是双重治疗组(IFN -γ加上舒尼替, );单一治疗与控制(图没有显著不同7 (b)右面板)。

4所示。讨论

Th1细胞因子干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α已经知道诱导细胞凋亡和衰老在各种癌症细胞系(4,5,16]而抑制许多生长因子受体的表达her - 2和她的3个(4]。同样,舒尼替抑制多个rtk的活动(17]。因此,我们预期,Th1细胞因子的结合与舒尼替合作抢劫癌细胞的多个重要的生长和存活的信号,同时提供proapoptotic信号,从而提高乳腺癌细胞死亡。这些研究中,我们检测her - 2^pos/嗯^pos(MCF-7)、her - 2^pos/嗯^负的(SKBR-3和hcc - 1419),三阴性(mda - mb - 468和mda - mb - 231)细胞系。在所有的细胞系,舒尼替和Th1细胞因子有效地抑制代谢活动(图1(图中)和诱导细胞凋亡2(数据),通过一个明显的凋亡机制3和4)。我们进一步研究了生长因子受体的表达水平her - 2在SKBR-3细胞系,发现舒尼替和Th1细胞因子的结合导致显著抑制表面表达( )。

最初我们也遇到了一个意想不到的困难在这些研究带来的药物舒尼替似乎具有荧光性能足够持久,即使清洗处理,提取细胞,干扰我们的许多常用的荧光化验,依靠激发波长488纳米的激光和检测在某些渠道如用于荧光染料FITC和TMRE染料,后者就是我们经常用来衡量线粒体膜极化(一个属性通常失去了在凋亡细胞死亡)。然而,在最近的文献回顾,我们发现,这一现象舒尼替荧光之前已经事实上被观察到的18]。在某些情况下,我们能够解决这个限制用荧光染料。例如,我们交换FITC-labeled膜联蛋白V APC共轭兴奋的642 nm激光和一个通道中发现远离舒尼替的发射光谱。TMRE,然而,没有替代品,因此我们不能执行线粒体膜极化化验舒尼替时使用。

然而,我们做了检查线粒体功能的不同方面与细胞凋亡有关。凋亡细胞死亡的特点之一就是从线粒体细胞色素C的损失14]。我们测量SKBR-3细胞系细胞色素C含量,流式细胞术使用适当的fluorochrome-labeled抗体,以免药物干扰的问题。正如所料,细胞色素C是最低的细胞治疗Th1细胞因子和舒尼替(图4)。我们有些惊讶,不过,观察Th1细胞因子治疗并没有导致一个可观察到的细胞色素C含量减少,考虑到这种治疗显示所有其他温和的细胞死亡的证据标准检查在这些研究中。重要的是,肿瘤坏死因子-α使用的Th1细胞因子之一,被直接绑定到受体参与发起外在凋亡通路(19]。肿瘤坏死因子-α结合肿瘤坏死因子受体超家族,适配器蛋白质如TRADD(肿瘤坏死因子受体类型1-associated死域蛋白质)和FADD (Fas-associated蛋白质与死亡域)与受体(20.]。这相互作用导致的形成death-inducing信号复杂,劈开procaspase 8,导致激活(proapoptotic信号),会导致从线粒体细胞色素C的释放。然而,尽管意想不到的弱点Th1细胞因子诱导细胞色素C损失,结合舒尼替时,细胞色素C损失显著增加药物。

因为每个恶性肿瘤是独一无二的,有自己的一套突变和特异表达基因,大多数癌症细胞系建立可以预期行为与个体治疗有点不同;尽管如此,我们发现舒尼替工作很好结合Th1细胞因子在一组表型不同的线路包括激素受体阳性,HER-2-positive,三阴性细胞。这可能是部分原因是一般缺乏选择性舒尼替的能力对抗多个酪氨酸激酶的活性。尽管舒尼替的活动被归因于目标以外的其他恶性肿瘤细胞本身(例如,肿瘤脉管系统(21)和myeloid-derived抑制细胞(22]),直接影响也被观察到。例如,在肾细胞癌,舒尼替可以抑制STAT3的激活(23),核转录因子被认为是关键的促进增殖,抗细胞凋亡,肿瘤发生[24]。有趣的是,干扰素,γ众所周知,促进STAT1的激活,在反对STAT3通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡25]。似乎Th1细胞因子和舒尼替涉及的合作影响STAT1和抑制STAT3的同时激活。

虽然这些体外研究非常令人鼓舞的,这类药物结合Th1-polarizing疫苗必须考虑潜在的局限性,因为许多信号通路在肿瘤细胞可能抑制受体酪氨酸激酶的抑制剂也免疫系统细胞的关键。因此,免疫系统功能可能被修改以意想不到的方式。例如,由他人的研究表明舒尼替患者治疗肾细胞癌与频率的增加T细胞产生干扰素-γ(即。,Th1 cells) and a decrease in T cells producing IL-4 (i.e., Th2 cells), which reverses the unfavorable Th1/Th2 ratio characteristic in this disease state. This shift is critical for generating an effective antitumor immune response [26]。在这些肾癌细胞,T调节细胞(有利于肿瘤生长)升高,被证明是减少与舒尼替治疗。此外,肾细胞癌患者舒尼替证明减少myeloid-derived抑制细胞(22),这也被认为是促进肿瘤的生存和生长。另一方面,转移性肾透明细胞癌患者,接受舒尼替显示CD3的整体低迷的水平^pos和CD4^posT细胞(27]。而这些之前研究存在好坏参半的改变可能会在某些情况下推广,和其他减弱抗肿瘤免疫力,应该注意的是,所有这些代表变化,观察在免疫系统细胞的药物体内提供。他们没有实际测量细胞活性而直接影响下的药物。相比之下,相对很少有研究观察T细胞功能的酪氨酸激酶抑制剂药物。最近的一项研究[28)并比较几种酪氨酸激酶抑制剂药物的面板T细胞抑制活性和发现药物axitinib nonsuppressive相对于舒尼替。我们自己的体外研究似乎表明,舒尼替在相同浓度促进肿瘤细胞凋亡与细胞因子,重组也表现出强大的能力几乎脱落抗原干扰素-γ的分泌外源的高钙和特定蛋白质抗原(图6)。这一观点提出了有趣的问题关于未知的限制不仅舒尼替还其他靶向药物的开发作为抗癌药物。这些可能深刻地抑制免疫力的定义方面存在时的身体治疗主题和实际上可能破坏大量的潜在有效性依赖于完整的免疫功能。

之间复杂关系的最后一个例子舒尼替的抗癌和免疫调节特性被Jaini和同事展示了在一个小鼠模型(29日]。这里,老鼠轴承4 t1乳房癌肿瘤细胞接种疫苗与重组抗原,乳白蛋白,在CFA佐剂。舒尼替的实验性疗法还包括政府。有趣的是,当舒尼替管理结合有针对性的免疫治疗疫苗,它影响启动的抗原递呈细胞(CD11b下降^pos和CD11c^pos),导致疫苗接种失败29日]。另一方面,当舒尼替管理疫苗接种的启动阶段后,有一个增加vaccination-mediated免疫反应(29日]。这些后者研究清楚地表明,相对时间的药物和免疫治疗也是一个重要的问题。然而,Th1细胞因子的作用是主要的抗肿瘤免疫效应物在这个系统是未知的。如果他们,很难想象如何惊人的疫苗和药物管理局可以以这样一种方式管理,Th1浸润淋巴细胞分泌的细胞因子和治疗药物浓度可能同时实现肿瘤的床位。

我们目前的研究,而不是试图错开政府主动免疫疗法和舒尼替我们尝试规避潜在的药物干扰免疫反应通过直接提供重组干扰素-γ并发与舒尼替政府。我们省略了TNF -α完全,因为虽然这种细胞因子在免疫疗法包括使用一些成功孤立肢体灌注(30.),有已知的毒性,限制其使用系统(31日,32),因此,我们没有考虑系统性管理TNF -α几乎是可译的。干扰素-γ,另一方面,有一个更好的系统安全性,目前临床批准和用于治疗慢性肉芽肿性疾病(33]。我们发现,只有结合,而不是单药治疗,抑制肿瘤的生长在统计上显著的水平比未经处理的控制,表明这种方法作为临床上可翻译策略增强舒尼替的活动,和其他small-molecule-targeted代理。因为舒尼替目前fda批准的治疗肾细胞癌,我们相信测试重组干扰素-γ与这种药物将是值得的,增加反应率的目标额外风险较低的毒性。

有趣的是,利用靶向药物疗法结合的影响干扰素-γ是一个方法,我们已经测试飞行员临床试验(NCT03112590设置本地先进的her - 2)^pos乳腺癌。对于这些对象,标准治疗通常包括两种anti-HER-2抗体的结合(曲妥珠单抗和pertuzumab) +紫杉烷与紫杉醇,卡铂等以及细胞毒性剂。这个试验替代干扰素-γ卡铂。虽然没有完成,但是midtrial结果出现有前途,受试者经历近两倍的病理完全缓解率与历史控制接受标准治疗相比,即使最difficult-to-tolerate组件(即消除。卡铂)。

这个手稿的研究证明了理论水平,有针对性的多种受体蛋白酪氨酸激酶小分子抑制剂可以结合Th1细胞因子在体外和体内强烈增强细胞凋亡在乳腺癌细胞系的不同表型和抑制体内肿瘤生长her - 2的小鼠模型^pos乳腺癌。这表明特定的靶向药物在理论上可以结合有前途的抗癌疫苗工作主要通过诱导强烈Th1-dominated免疫机制,期望添加剂或协同效应可以实现。然而,他们也公开警告,这些药物可以在免疫系统细胞有很强的抑制效应,这可能会使模拟药物和细胞因子之间的协调,这至少在某些情况下可能会绕过政府的重组细胞因子代替疫苗或其他细胞治疗。进一步发展的总体战略将理想情况下涉及的识别选择性药物也会配合Th1细胞因子增强肿瘤细胞杀死,同时避免强烈抑制T细胞的活动。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

补充材料

补充图1:isobole分析。(补充材料)

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