西红花素与紫杉醇或西红花素与辐射协同作用对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的研究

摘要

背景。化疗、放疗和手术是乳腺癌的常规治疗方法。然而，这些方法只能提高生存能力。目前，包括藏红花素在内的综合疗法正在研究中，以改善乳腺癌的治疗。本研究旨在探讨西红花素、紫杉醇及放疗对MCF-7细胞的影响。方法。采用MTT法观察西红花素、紫杉醇及放疗对MCF-7细胞存活率的影响。采用pi -流式细胞术，western blot检测凋亡蛋白(caspase-7、caspase-9、PARP、p53)的表达。结果。本研究结果显示，0.01µmol/mL紫杉醇和2.5 mg/mL西红花苷对MCF-7细胞的IC50均有抑制作用。本研究表明，2gy γ射线联合藏红花素可使MCF-7细胞的凋亡率由单独使用2gy γ射线时的21%提高到46.6%。结论。西红花素与紫杉醇、西红花素与γ射线对MCF-7细胞具有协同作用，使细胞凋亡更明显。

1.介绍

乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤[1］．由于近年来全球不受控制的增长，它非常重要。在美国，每8名妇女中就有1名面临这种疾病。仅在2013年，大约23万名女性和2000名男性也加入了这个癌症协会[2］．虽然亚洲的癌症发病率较低，但死亡人数却高于西方国家。在伊朗，乳腺癌在女性恶性肿瘤中发病率最高。研究发现，伊朗的乳腺癌发病率低于发达国家。然而，这种疾病是伊朗妇女中最常见的癌症。这种恶性肿瘤的发病率在过去二十年中有所增加[3.］．

放疗、化疗和手术是乳腺癌常见的治疗方法。大多数手术都不能完全切除肿瘤。放射治疗和化疗也会损害健康组织，因此，考虑到健康组织，耐受性辐射和药物剂量必须保持在一个有限的水平。因此，只有存活数年才能提高。

藏红花具有多种药理作用。它可以用于治疗呕吐、牙和牙龈疼痛、失眠、抑郁、癫痫、认知障碍、发汗、消化、化痰和春药，也可以用于治疗肝病、气胀、痉挛、哮喘、咳嗽、支气管炎、感冒、发烧、心血管疾病、癌症和许多其他疾病。藏红花素是制造藏红花红色的类胡萝卜素色素[4］．一些研究报告了藏红花素的抗癌作用[5- - - - - -7］．西红花素是一种可以杀死癌细胞而不损害正常细胞的植物化学物质。因此，可与化疗药物联合使用，减少药物的毒性作用[8］．

紫杉醇是一种化疗药物。因为紫杉醇能够结合β微管蛋白亚基，它增加了微管的产生并阻止它们解聚。这一事件最终破坏了细胞有丝分裂并阻止细胞处于G2期，导致细胞凋亡[9］．紫杉醇最重要的副作用和剂量限制处方是造血系统的失活。表现为中性粒细胞减少(中性粒细胞减少)、白细胞减少(白细胞减少)和贫血[10］．紫杉醇可能导致一些心血管并发症，如低血压(低血压)、心率(心动过缓)和高血压(高血压)[11］．恶心和呕吐是紫杉醇的另一个副作用[12，13］．

DNA是电离辐射的重要靶点，因为它包含了编码生物分子的信息，因此其单链断裂(SSB)、双链断裂(DSB)和二聚化等损伤可能严重威胁细胞的生存能力[14，15］．

因此，电离辐射有可能引起DNA损伤和细胞凋亡[16］．

凋亡一词最早由Kerr于1972年提出，用于描述基于形态学改变的细胞生理死亡，并与坏死分化[17］．细胞凋亡是真核生物中一种常见的细胞死亡类型。这一过程在胚胎期和肿瘤抑制期进行[18］．

本研究针对乳腺癌发病率的增加以及化疗和放疗过程中对化疗药物的耐药和对健康组织的损伤等治疗方案的不良反应，分别评估藏红花素与紫杉醇、藏红花素与伽玛辐射的协同凋亡作用。MCF-7细胞系。

2.材料和方法

2．1．细胞系和试剂

MCF-7细胞系，无创雌激素受体(ER)阳性，由伊朗德黑兰巴斯德研究所制备。胰蛋白酶、西红花素、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯四唑(MTT)和碘化丙啶(PI)购自Sigma(德国)。含5%胎牛血清的Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM)高葡萄糖购自Gibco(美国)。紫杉醇购自Sobhan Darou(伊朗德黑兰)。兔caspase-7、caspase-9和PARP单克隆抗体和小鼠p53单克隆抗体均来自Cell Signaling(美国)。

2．2．细胞培养与研究方法

MCF-7细胞在含10%热灭活胎牛血清、100单位/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中培养，并保持在37℃、5% CO的湿化气氛中₂．选取对数生长期的细胞进行实验研究。

2．3.MTT法测定MCF-7细胞存活率

25000个细胞用1ml培养基接种于24孔板24小时。不同浓度的西红花苷分别为1.5 mg/mL、2.5 mg/mL、3.5 mg/mL、4.5 mg/mL、6 mg/mLμ0.03米/毫升,μ0.05米/毫升,μ0.1米/毫升,μ0.5米/毫升,μ米/毫升,1μ分别检测紫杉醇对MCF-7在最短时间内的抑制浓度(IC50)。在此基础上，西红花苷的培养时间分别为24 h、48 h、72 h，紫杉醇的培养时间分别为48 h。然后取出培养基，用100孵育细胞μL (5 mg/mL溶解于PBS) MTT和900μL培养基37℃培养4 h。每孔弃上清500μ加入L DMSO，悬浮混合物。光吸收度()在570 nm波长下测定。最终存活率计算如下: 对西红花苷和紫杉醇分别进行上述处理。结果红花素浓度为2.5 mg/mL，红花素浓度为0.01μ以M/mL为最佳浓度。

选取4组MCF-7，研究3种处理方法:对照组、2 Gy γ射线(钴60源)照射组、2.5 mg/mL藏红花素0.01 mg/mL照射组μM/mL紫杉醇，最后以2.5 mg/mL藏红花素和2 Gy γ辐射联合研究第四组;同时，我们有几个对照组。

２.４.流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞术检测凋亡细胞，PI染色检测所谓的亚g1峰[19］．在本实验中，将MCF-7细胞培养在6孔板中(每孔70000细胞)，并用2.5 mg/mL藏红花素处理24 h、48 h和72 h。第二组细胞用0.01μM/mL紫杉醇，第三组照射剂量为2gy。第四组给予红花素2.5 mg/mL、红花素0.01 mg/mL的联合治疗μ第5组用2 Gy γ和2.5 mg/mL藏红花素孵育24 h。除对照组外，其余各组均进行流式细胞仪分析。

2.5。Western Blot检测MCF-7细胞中Caspase-7、Caspase-9、p53和PARP的表达

MCF-7细胞株的分类和处理方法与前两种方法相似。然后用胰蛋白酶分离处理后的细胞，PBS洗涤，4000 rpm离心5分钟，加入裂解缓冲液中。在接下来的步骤中，所有的样本都被放入冰中30分钟，每5分钟旋转一次，直到这些样本都被均匀化。4℃，13000 rpm离心20分钟。取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。蛋白样品分成较小的量，并保持在−80°C。

首先进行western blot，准备运行缓冲液和转移缓冲液，然后进行三个步骤:(a)通过凝胶电泳按分子量分离蛋白，(b)转移到硝化纤维素膜上，(c)用一抗指定所需蛋白，用二抗显示。最后在膜上与ECL形成抗体键。每个键的厚度与蛋白质的含量直接相关。

3.结果

3．1.MCF-7细胞存活率的变化

MTT结果显示，西红花苷随剂量的增加和时间的延长而降低MCF-7细胞活力。3.5 mg/mL西红花素处理48 h后，获得该细胞系的IC50 ()(图1）.当处理浓度为0.1时测定IC50μm/mL紫杉醇48小时后()(图1）.

本研究结果显示，0.01μmol/mL紫杉醇和2.5 mg/mL西红花苷对MCF-7细胞()(图2）.采用MTT法测定。2 Gy辐射与2.5 mg/mL藏红花素联合治疗，细胞死亡率为50% ()(图3.）.仅使用2 Gy辐射的细胞死亡就超过22%。

3．2．MCF-7细胞凋亡的变化

采用PI流式细胞术检测细胞凋亡。凋亡细胞的主要特征之一是DNA片段。因此，细胞核DNA含量低于正常细胞。在次二倍体细胞中，可以通过DNA结合荧光色素(如PI)来评估和指定含核性[20.］．凋亡细胞数量由SUBG1峰定义。

本研究发现，2.5 mg/mL西红花苷处理24、48、72小时可引起MCF-7细胞随时间的凋亡增加(图)4）.2.5 mg/mL西红花素与0.01μm/mL紫杉醇可明显增加细胞凋亡()(图4）.

本研究表明，2gy γ射线联合藏红花素治疗MCF-7细胞凋亡率由单独使用2gy γ射线的21%提高到46.6% ()(图4）.

3．3.Western Blot检测MCF-7细胞中Caspase-7、Caspase-9、p53、PARP的表达

Western blot检测显示，红花素与紫杉醇联合或红花素与辐射联合治疗MCF-7细胞株，均能较单药治疗增加caspase-7、caspase-9、p53、PARP等4种蛋白的表达()(图5）.

4.讨论

如前所述，乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤。尽管癌症患者采用手术、化疗和放疗等常规治疗方法，但死亡率仍然很高。这意味着这些治疗方式需要修改。此外，化疗和放疗对正常细胞的破坏性影响也是另一个重要问题[11］．现在的趋势集中在天然产品，如藏红花的抗癌特性，以获得更好的治疗癌症。

Chryssanthi等研究表明藏红花的成分(藏红花素、藏红花素和藏红花醛)能够阻止MCF-7细胞系的增殖[12］．我们的研究证实了藏红花素的这种抗增殖作用。其他科学家已经证实藏红花素、藏红花类胡萝卜素对HEPG2细胞和结直肠癌细胞具有抗增殖作用，对正常细胞也没有有害影响[13- - - - - -15］．本研究评估了紫杉醇、西红花素、放疗和MTT法对MCF-7细胞存活率的影响。我们的研究表明藏红花素能抑制MCF-7细胞的增殖，且呈剂量和时间依赖性。如红花素浓度从1.5 mg/mL增加到6 mg/mL, 48h后MCF-7细胞存活率从75%降低到23%，紫杉醇处理后MCF-7细胞存活率从80%降低到17%μ米/ 1毫升μM/mL, 48 h。紫杉醇呈剂量依赖性降低生存率。与我们的研究结果相似，Hoshyar等人发现藏红花素具有剂量依赖性和时间依赖性效应。

Sun等发现藏红花素对Tca8113的凋亡作用[16］．我们的研究证实了这种作用对MCF-7细胞系的影响。Li等发现藏红花素和顺铂对OS732、MG63细胞的协同作用。他们表明，西红花素和顺铂的结合具有强大的杀伤和抑制入侵细胞的作用，这可能更归因于caspase -8和-3的表达[17］．细胞凋亡的机制是复杂的，是由一系列的分子事件组成的。这取决于能量。诱导细胞凋亡一般有两种途径:外源性途径和内源性途径。这两条路线是相互关联的。此外，T淋巴细胞诱导靶细胞的细胞毒活性[18］．它可以被称为第三种方法。Caspases切断天门冬氨酸单位。这个过程激活了蛋白酶原。级联激活的Caspases可以通过连锁反应激活另一个caspase，加强和强化细胞凋亡和快速死亡的途径。这些酶分为三组:启动酶(caspase -2， -8， -9，和-10)，broker (caspase -3， -6，和-7)和炎性酶(caspase -1， -4，和-5)[19- - - - - -21］．

PUMA基因是P53直接诱导DNA损伤的[22］．PUMA的表达引起线粒体细胞色素c的释放，刺激细胞死亡[23，24］．在细胞凋亡的内部或线粒体途径中，细胞色素c、Apaf-1和procaspase-9相互作用产生凋亡[25］．凋亡小细胞激活caspase-9激活执行caspase，如3,6,7 [26］．

细胞压力如DNA损伤、辐射或化学致癌物激活p53。根据毒性的类型和严重程度，p53可引起细胞周期阻滞或凋亡导致细胞死亡。前者允许DNA修复，后者导致细胞丢失[27，28］．

PARP作为细胞蛋白，在细胞凋亡过程中被特异性切割。PARP的特殊蛋白水解发生在DNA结合区域。Caspase-3和caspase-7是切割PARP最有效的蛋白酶。结果，PARP分裂成两个89和24 kDa亚基。这些亚基表示细胞凋亡。因此，本研究采用PI流式细胞术评价MCF-7细胞系的凋亡情况，采用western blot方法研究凋亡相关蛋白的表达[29］．

Saunders等人用0-20 ng/mL紫杉醇证明了MCF-7细胞的凋亡。本研究评价紫杉醇西红花素和紫杉醇辐射联合治疗MCF-7细胞系的疗效，发现两者的协同作用。2.5毫克/毫升藏红花素，0.01μM/mL紫杉醇作用48小时可使54.01%的细胞处于g1期。2.5 mg/mL藏红花素和2 Gy γ射线联合治疗时，该值为46.6%。结果显示，联合组凋亡蛋白的表达明显高于单独组[30.］．

5.结论

西红花苷与紫杉醇或西红花苷与γ射线联合治疗对MCF-7细胞凋亡增加、存活率降低具有协同作用。因此，建议对新的乳腺癌治疗方法进行更多的研究。在此联合治疗中，西红花素浓度、药物浓度和治疗时间是影响MCF-7细胞凋亡率和存活率的重要因素。

利益冲突

没有利益冲突。

承认

这项研究得到了德黑兰医学科学大学的支持。25323.

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