文摘

γ-Tocotrienol是天然维生素E显示有效的抗癌活性,先前的研究表明,这些影响包括PPAR的改变γ活动。0.5治疗6μ米γ-tocotrienol, 0.4 -50μM PPARγ受体激动剂(罗格列酮或troglitazone),或0.4 -25μM PPARγ拮抗剂(GW9662或T0070907)抑制细胞和细胞龛之间仅导致剂量反应关系MCF-7和mda - mb - 231乳腺癌扩散。然而,1 - 4的综合治疗μ米γ与PPAR -tocotrienolγ受体激动剂逆转生长的抑制效应γ1 - 4的-tocotrienol,而联合治疗μ米γ与PPAR -tocotrienolγ拮抗剂协同抑制MCF-7和mda - mb - 231细胞生长。联合治疗的γ-tocotrienol和PPARγ受体激动剂PPAR的转录活动的增加引起的γ随着增加PPAR的表达式γ和RXR PPAR下降γ辅活化因子,CBP p / 300, CBP C-20 SRC-1,在乳腺癌细胞系。相比之下,联合治疗γ与PPAR -tocotrienolγ拮抗剂导致PPAR转录活性的下降γ以及减少PPAR的表情γ和RXR PPAR的增加γ辅活化因子,相应减少PI3K / Akt在这些细胞促有丝分裂的信号。这些发现表明,在PPAR海拔γ与增加乳腺癌生长和存活,和治疗,降低PPAR吗γ表达式可以提供在乳腺癌的治疗中获益。

1。介绍

过氧物酶体扩散者激活受体γ(PPARγ)属于核受体超家族和功能配体依赖性转录因子作为形成异质二聚体复杂类维生素a X受体(RXR)。这个复杂的绑定到一个特定的DNA序列称为过氧物酶体扩散国的反应元素和启动招聘共激活剂的蛋白质如CBP p / 300, SRC-1, CBP C-20,进一步调节基因转录(1- - - - - -3]。研究表明,PPARγ在许多类型的乳腺癌细胞(4- - - - - -7]。在啮齿动物实验证据表明,PPAR的过度γ与乳腺肿瘤的发病率和增长,而PPAR击倒γ表达式被发现明显抑制(自发的乳腺肿瘤的生长8,9]。综合这些结果表明PPAR的抑制γ表达和/或活动可能在乳腺癌的治疗是有益的。然而,其他研究已经表明,与PPAR治疗γ与PPAR激动剂罗格列酮和troglitazone,或者相反γ拮抗剂GW9662 T0070907,都发现显著抑制多种癌细胞的生长线(10,11]。解释了这些矛盾的发现不是显而易见的,尤其是一些这些药物的抗癌作用可能是通过PPAR介导γ独立的机制。解释这些发现进一步复杂化PPAR的事实γ时可以调节转录活动由一种蛋白激酶和其他激酶磷酸化,从而发生从相声和其他促有丝分裂的信号通路12]。

γ-Tocotrienol是维生素E的家庭成员显示强有力的抗癌活性化合物(13,14]。机制(s)参与调停的抗癌活性γ-tocotrienol似乎涉及抑制growth-factor-dependent促有丝分裂的信号,尤其是PI3K / Akt信号通路(15- - - - - -18]。PI3K的脂质信号激酶激活PDK-1,随后磷酸化和Akt。激活一种蛋白激酶磷酸化各种与细胞增殖和生存相关的蛋白质(19]。PDK-1和Akt活动终止等磷酸酶PTEN [20.]。

最近的研究表明,tocotrienols激活特定PPARs记者化验(21),而其他研究已经表明,γ15-lipoxygenase-2 -tocotrienol增加细胞内水平,酶负责转换PPAR花生四烯酸γ激活配体,15-S-hydroxyeicosatrienooic酸,在前列腺癌细胞22]。因此,它是假设的抗癌效应γ-tocotrienol可能介导,通过PPAR至少部分γ端依赖机制。的影响研究进行了描述γ-tocotrienol单独治疗,结合特定的PPARγ受体激动剂和拮抗剂MCF-7生长和存活的人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。额外的研究评估治疗对PPAR的表达的影响γ和PPARγ辅活化因子,PI3K / Akt促有丝分裂的信号在这些乳腺癌细胞系。这些研究结果进一步描述抗癌的作用机制γ-tocotrienol以及PPARγ受体激动剂和拮抗剂,提供见解,这些治疗的潜在益处治疗乳腺癌。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

所有试剂都从σ化学公司购买(圣路易斯,密苏里州),除非另有说明。纯化γ-tocotrienol(纯度> 98%)慷慨地提供了作为礼物首先科技国际有限公司(香港)。的PPARγPPAR激动剂罗格列酮和troglitazone,γ拮抗剂,GW9662和T0070907从开曼群岛购买化学品(CA)圣地亚哥。胎牛血清是购自美国类型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。抗体的β肌动蛋白,PPARγ,Akt phospho-Akt PTEN、phospho-PTEN PDK-1, PI3K, caspase-3裂解,裂解PARP购买从细胞信号技术(贝弗利,MA)。RXR抗体,CBP C-20 SRC-1, CBP p / 300买来圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。山羊anti-rabbit和anti-mouse二级抗体购自PerkinElmer生物科学(波士顿)。

2.2。细胞系和文化条件

雌性激素受体阴性mda - mb - 231,和雌性激素受体阳性MCF-7乳腺癌细胞系从美国购买类型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。mda - mb - 231和MCF-7杜尔贝科的乳腺癌细胞培养在修改修改鹰介质DMEM / F12补充10%胎牛血清,10μg / mL胰岛素,100 U /毫升青霉素,链霉素0.1毫克/毫升在37°C的环境中95%的空气和5%的有限公司2在湿润孵化器。对接种细胞与无菌Ca冲洗两次2 +- - - Mg2 +无磷酸盐(PBS)和孵化0.05%胰蛋白酶含有0.025% EDTA在PBS 5分钟37°C。释放细胞离心,resuspended血清包含媒体,使用血细胞计数器计数。

2.3。实验治疗

高度亲脂性的γ-tocotrienol悬浮在无菌的溶液10% BSA如前所述[13,14]。简单地说,一个适当的数量的γ-tocotrienol最早于100年解散μL 100%的乙醇,然后添加到一个体积小的无菌10% BSA在一夜之间水和孵化37°C连续震动。这只股票的解决方案是使用媒体准备各种浓度的治疗。股票的解决方案的罗格列酮、troglitazone GW9662在DMSO和T0070907准备。乙醇和/或DMSO溶液添加到所有处理媒体,这样最后的浓度是相同的所有治疗组在任何给定的实验,总是不到0.1%。

2.4。经济增长研究

MCF-7镀和mda - mb - 231细胞的密度 细胞/好(6复制/组)24好盘子和文化 细胞培养板/在96,分别和一夜之间可以遵循。第二天,细胞被分成不同的治疗组,培养基被移除,用无菌PBS洗净,然后美联储新媒体包含各自的治疗,然后返回到孵化器。包含0-50细胞治疗与媒体μ罗格列酮,troglitazone、GW9662 T0070907或主μ米γ-tocotrienol单独或组合进行为期4天的文化时期。在每个治疗组细胞被喂新鲜的媒体在整个实验期间每隔一天。对细胞凋亡实验,MCF-7镀和mda - mb - 231细胞如上所述。细胞被允许生长控制媒体3天,之后,他们暴露在各种治疗24小时内。治疗20μ米γ-tocotrienol之前一直在乳腺癌细胞诱导凋亡[13,14),被用作积极控制在这个研究。

2.5。测量的活细胞数

MCF-7和mda - mb - 231活细胞数量决定使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)比色测定如前所述[13,14]。最终治疗期间,媒体被删除,所有细胞都暴露3 h(96孔板)或4 h(24 /板)新鲜控制媒体含0.41毫克/毫升MTT 37°C。之后,媒体被和MTT晶体被溶解在1毫升100年24培养板或异丙醇μL 96年DMSO的培养板化验。每个样品的光密度测量在570 nm标(Spectracount;帕卡德生物科学公司,梅里登,CT) 0对空白颗粒介质的准备的。细胞的数量每口井的计算与标准曲线由镀已知的细胞密度,由血细胞计数器,一式三份,每个实验的开始。

2.6。免疫印迹分析

MCF-7镀和mda - mb - 231细胞的密度 细胞/ 100毫米培养皿和暴露于控制或治疗媒体进行为期4天的文化时期。与PBS之后,细胞被洗,用胰蛋白酶孤立,也准备了完整的细胞溶解产物Laemmli缓冲区(23如前所述(24]。每个样本的蛋白质浓度是决定使用Bio-Rad蛋白质分析工具包(Bio-Rad大力神,CA)。等量的蛋白质从每个样品在给定实验装上SDS-polyacrylamide minigels并通过5% - -15%解决凝胶电泳。蛋白质分离每12 - 16 h凝胶在30 V transblotted在4°C到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(PerkinElmer Lifesciences,韦尔斯利,MA) Trans-Blot细胞(Bio-Rad大力神,CA)根据Towbin等的方法。25]。膜被屏蔽2% BSA在10毫米三HCl包含50 mM氯化钠和0.1%渐变20 pH值7.4 (TBST),然后孵化与特定的主PPAR抗体γ,Akt phospho-Akt PTEN、phospho-PTEN PDK-1, PI3K, RXR, CBP C-20, SRC-1, CBP p / 300, capase-3裂解,裂解PARP或β肌动蛋白,稀释1:500 - 1:5000年TBST / 2% BSA 2 h。膜清洗5次与TBST其次是孵化与各自的辣根peroxide-conjugated二级抗体稀释1:3000 - 1:5000年TBST / 2% BSA 1 h与TBST冲洗紧随其后。蛋白质乐队绑定到抗体被化学发光可视化(皮尔斯,罗克福德,IL)根据制造商的说明和图片是使用柯达获得凝胶成像系统逻辑1500 (Carestream健康公司,罗彻斯特,纽约)。的可视化β肌动蛋白进行确认每车道等于样本加载。蛋白质乐队在这部电影获得的图像和扫描光密度分析与柯达分子成像软件4.5版本(Carestream健康公司,罗彻斯特,纽约)。所有实验至少重复三次和免疫印迹图像代表实验数据所示。

2.7。瞬时转染和荧光素酶记者分析

MCF-7镀和mda - mb - 231细胞的密度 每口井96 -孔板和一夜之间可以遵循。细胞转染后的32 ng PPRE X3-TK-luc (Addgene质粒。1015)(26每口井的)和3.2 ng renilla荧光素酶质粒(Promega,麦迪逊,WI)使用0.8μL lipofectamine 2000转染试剂为每个(表达载体,宏伟的岛,纽约)。6 h转染后,媒体就被撤掉了;这些细胞被洗一次,暴露于100年μL为期4天的控制或治疗媒体文化时期。与75年之后,细胞细胞溶解μL(被动裂解缓冲和治疗根据制造商的指示使用dual-glo荧光素酶检测系统(Promega,麦迪逊,WI)。荧光素酶活性的每个样本被renilla活动水平正常化。数据表示为意味着褶皱处理细胞相比,控制细胞的变化。

2.8。统计分析

PPAR之间的相互作用γ配体和γ-tocotrienol被isobologram评估方法(27]。一条直线是由策划IC50剂量的γ-tocotrienol和个人PPARγ配体的 相互重合, 相互重合,分别由非线性回归曲线拟合分析使用GraphPad棱镜4 (GraphPad软件有限公司拉霍亚,CA)。isobologram中的数据点对应于实际的集成电路50剂量的组合γ-tocotrienol和PPARγ配体的治疗。如果一个数据点或线附近,这代表一个添加剂治疗效果,而一个数据点,是在以上行表示合作或对抗,分别。增长各治疗组的差异研究和免疫印迹研究由方差分析Dunnett紧随其后的多个测试范围。差异被认为是显著的价值 。

3所示。结果

3.1。抗增殖的影响γ-Tocotrienol, PPARγ受体激动剂(罗格列酮和Troglitazone), PPARγ拮抗剂(GW9662和T0070907)

治疗3 - 6μ米γ-tocotrienol, 1.6 -12μ罗格列酮,6.4 -25人μM troglitazone, 1.6 - -6.4μ-25 M GW9662,或6.4μM T0070907被发现显著抑制增长方式相比,细胞和细胞龛之间MCF-7细胞的剂量反应关系vehicle-treated对照组细胞(图1(一))。同样,治疗4 - 8μ米γ-tocotrienol, 6.4 -25μ罗格列酮,3.2 -50人μ3.2 M troglitazone, -12μM GW9662,就是每人日薪12到50μM T0070907显著抑制mda - mb - 231细胞生长方式相比细胞细胞和细胞龛之间的剂量反应关系vehicle-treated对照组(图1 (b))。

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图1
抗增殖的影响γ-tocotrienol, PPARγ受体激动剂(罗格列酮和troglitazone), PPARγ拮抗剂(GW9662和T0070907) MCF-7 (a)和(b)人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。镀MCF-7细胞密度 每组)(6井24-well文化板块和暴露治疗媒体为期4天时间。后来活细胞数量决定使用MTT比色测定。镀mda - mb - 231细胞的密度 (6井/组)在96年文化板块和暴露治疗媒体为期4天时间。后来活细胞数量决定使用MTT比色测定。竖线表示的意思是在每个治疗组细胞计数±SEM。 与vehicle-treated控制。
3.2。敌对的PPAR的影响γ受体激动剂罗格列酮和Troglitazone抗增殖的影响γ-Tocotrienol

治疗1 - 6μ米γ-tocotrienol显著地抑制MCF-7的增长(图2(一个)(图)和mda - mb - 2312 (b)在为期4天的治疗期后)乳腺癌细胞。然而,1 - 4的生长抑制作用μ米γ-tocotrienol MCF-7细胞逆转时一定结合3.2μM罗格列酮或troglitazone(图2(一个)顶部和底部)。类似的,但不明显,逆转3 - 6μ米γ-tocotrienol-induced生长抑制性影响乳腺癌mda - mb - 231细胞结合使用时观察到6.4μM罗格列酮或troglitazone(图2 (b)顶部和底部)。

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图2
的影响γ-tocotrienol, PPARγ受体激动剂罗格列酮和troglitazone治疗单独或结合增长MCF-7 (a)和(b)的人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。镀MCF-7细胞最初的密度 每组)(6井24-well盘子和mda - mb - 231 (b)最初被镀的密度 (6井/组)在96年文化板块和暴露治疗媒体为期4天时间。后来,用MTT比色测定活细胞数量决定。垂直条指示的意思是在每个治疗组细胞计数±SEM。 而vehicle-treated控制和 与相应的控制处理γ-tocotrienol孤单。
3.3。增强的γ当考虑到结合PPAR -Tocotrienol-Induced抗增殖效果γ拮抗剂GW9662或T0070907

1 - 4的生长抑制作用μ米γ-tocotrienol时显著增强结合subeffective剂量(3.2μPPAR的M)γ拮抗剂,GW9662 MCF-7乳腺癌细胞(图3(一个),最高)。轻微,但微不足道的增强生长抑制效果1 - 4μ米γ观察-tocotrienol结合subeffective剂量(3.2μPPAR的M)γ拮抗剂,T0070907 MCF-7乳腺癌细胞(图3(一个),底部)。0.5在mda - mb - 231细胞,3μ米γ6.4 -tocotrienol结合使用μ米的PPARγ拮抗剂,GW9662(图3 (b),顶部)或T0070907(图3 (b),底部)和被发现显著增强这些代理的生长抑制作用。高剂量的范围γ这些相同剂量的PPAR -tocotrienol结合γ拮抗剂导致完全抑制乳腺癌细胞的生长,这样活细胞数量无法使用MTT试验(数据未显示)。

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图3
的影响γ-tocotrienol, PPARγ拮抗剂GW9662 T0070907治疗单独或结合发展MCF-7 (a)和(b)人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。镀MCF-7细胞最初的密度 每组)(6井24-well盘子和mda - mb - 231 (b)最初被镀的密度 (6井/组)在96年文化板块和暴露治疗媒体为期4天时间。后来,用MTT比色测定活细胞数量决定。垂直条指示的意思是在每个治疗组细胞计数±SEM。 而vehicle-treated控制和 与相应的控制处理γ-tocotrienol孤单。
3.4。Isobologram联合治疗效果的分析γ与PPAR -Tocotrienolγ受体激动剂和拮抗剂

联合治疗的γ与PPAR -tocotrienolγ受体激动剂罗格列酮,troglitazone被发现统计上敌对的MCF-7(图4(一)(图)和mda - mb - 2314 (b))乳腺癌细胞生长,就是明证数据点的位置在isobologram远高于线定义累加效应。相比之下,联合治疗的生长抑制作用γ与PPAR -tocotrienolγ拮抗剂,GW9662 T0070907被发现统计上协同MCF-7(图所示4(一)(图)和mda - mb - 2314 (b)乳腺癌细胞,就是明证数据点的位置在isobologram远低于行定义累加效应。

(一)
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图4
Isobologram分析的综合治疗γ-tocotrienol和PPARγ配体在MCF-7 (a)和(b)人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。单个集成电路50剂量为γ-tocotrienol, PPARγ受体激动剂(罗格列酮和troglitazone), PPARγ拮抗剂(GW9662和T0070907)计算,然后绘制的 相互重合, 分别相互重合。上的数据点isobologram代表的实际剂量的总和γ-tocotrienol和PPARγ配体。联合治疗的PPARγ受体激动剂罗格列酮和troglitazoneγ-tocotrienol被发现是敌对的,数据点的位置在isobologram远高于线定义累加效应。相比之下,联合治疗的生长抑制作用γ与PPAR -tocotrienolγ拮抗剂GW9662 T0070907被发现协同,就是明证数据点的位置在isobologram远低于行定义两个细胞系的累加效应。
3.5。的影响γ-Tocotrienol和PPARγ受体激动剂罗格列酮和Troglitazone PPAR单独或结合在一起γ和RXR水平

免疫印迹分析表明,治疗2μM (MCF-7细胞)或3μ(mda - mb - 231细胞)γ独自-tocotrienol诱导PPAR的表达下降γ和RXR vehicle-treated控件(数据相比5(一个)和5 (b))。3.2治疗μM罗格列酮或独自troglitazone MCF-7细胞或6.4μM罗格列酮或troglitazone独自在mda - mb - 231细胞对PPAR很少或没有影响γ或RXR水平(数据5(一个)和5 (b))。然而,联合治疗剂量的相似γ-tocotrienol和罗格列酮或PPAR troglitazone导致显著增加γ和RXR表达MCF-7和乳腺癌mda - mb - 231细胞系(数字5(一个)和5 (b))。

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图5
免疫印迹分析γ-tocotrienol和PPARγ受体激动剂(罗格列酮和troglitazone)单独或结合PPAR的水平γ为期四天的潜伏期后,RXR MCF-7 (a)和(b)人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。MCF-7细胞最初镀 细胞/ 100毫米培养皿和处理控制或治疗媒体包含2μ米γ-tocotrienol, 3.2μM罗格列酮或troglitazone单独或组合。mda - mb - 231细胞被镀在类似的方式和处理控制或治疗媒体包含3μ米γ-tocotrienol, 6.4μM罗格列酮,或6.4μM troglitazone单独或结合在一起。所有的细胞都被喂以新鲜治疗媒体每隔一天为期4天的潜伏期。之后,整个细胞溶解产物被准备后续通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(50μg / lane)其次是免疫印迹分析。扫描光密度分析所有墨迹图一式三份,每个乐队的集成光学密度与相应的规范化β肌动蛋白,酒吧图表所示各自免疫印迹图像。图中垂直条指出的标准化集成光密度乐队每车道可视化±SEM。 与vehicle-treated控制。
3.6。的影响γ-Tocotrienol和PPARγ拮抗剂GW9662和T0070907 PPAR单独或结合在一起γ和RXR水平

免疫印迹分析表明,治疗2μM (MCF-7细胞)或3μ(mda - mb - 231细胞)γ-tocotrienol单独诱导减少PPAR的表情γ和RXR vehicle-treated控件(数据相比6(一)和6 (b))。3.2治疗μM (MCF-7细胞)或6.4μ(mda - mb - 231细胞)的PPARγ拮抗剂,GW9662或T0070907仅对PPAR只有轻微的影响γ和RXR表达式(数据6(一)和6 (b))。然而,与这些相同剂量的联合治疗γ-tocotrienol GW9662或T0070907导致PPAR显著减少γ及其异质二聚体合作伙伴、RXR MCF-7和mda - mb - 231细胞与车辆处理控件(数字6(一)和6 (b))。

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图6
免疫印迹分析γ-tocotrienol和PPARγ拮抗剂(GW9662和T0070907)单独或结合PPAR的水平γ为期四天的潜伏期后,RXR MCF-7 (a)和(b) mda - mb - 231细胞。MCF-7细胞最初镀 细胞/ 100毫米培养皿和处理控制或治疗媒体包含2μ米γ-tocotrienol, 3.2μM GW9662或T0070907单独或组合。mda - mb - 231细胞被镀在类似的方式和处理控制或治疗媒体包含3μ米γ-tocotrienol, 6.4μM GW9662,或6.4μM T0070907单独或结合在一起。所有的细胞都被喂以新鲜治疗媒体每隔一天为期4天的潜伏期。之后,整个细胞溶解产物从每个治疗组准备了后续分离通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(50μg / lane)其次是免疫印迹分析。扫描光密度分析所有墨迹图一式三份,每个乐队的集成光学密度与相应的规范化β肌动蛋白,酒吧图表所示各自免疫印迹图像。图中垂直条指出的标准化集成光密度乐队每车道可视化±SEM。 与vehicle-treated控制。
3.7。的影响γ-Tocotrienol和PPARγ受体激动剂罗格列酮和Troglitazone PPRE介导记者活动单独或结合在一起

荧光素酶分析显示治疗2μM (MCF-7细胞)或3μ(mda - mb - 231细胞)γ-tocotrienol单独诱导只有轻微影响PPRE介导记者活动车辆处理控件(数据相比7(一)和7 (b)顶部和底部)。3.2治疗μM (MCF-7细胞)或6.4μ(mda - mb - 231细胞)PPARγ受体激动剂罗格列酮,troglitazone或PPARγ拮抗剂,GW9662 T0070907,孤独,造成轻微,但微不足道PPRE介导记者活动(减少数据7(一)和7 (b)顶部和底部)。然而,与这些相同剂量的联合治疗γ-tocotrienol和罗格列酮或troglitazone PPAR的转录活动的增加引起的γMCF-7和mda - mb - 231细胞相比vehicle-treated控件(数字7(一)和7 (b),最高)。相比之下,与这些相同剂量的联合治疗γ-tocotrienol GW9662或T0070907造成明显降低PPRE介导记者活动MCF-7和mda - mb - 231细胞相比vehicle-treated控件(数字7(一)和7 (b),底部)。

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图7
荧光素酶分析进行MCF-7 (a)和(b)人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。镀最初的细胞密度 在96孔板细胞/好。然后转染细胞通过添加32 ng PPRE X3-TK-luc renilla荧光素酶质粒在0.8和3.2 ngμL lipofectamine 2000转染试剂。后6小时的潜伏期,MCF-7细胞治疗与控制或治疗媒体包含0 - 2μ米γ-tocotrienol, 0 - 3.2μ罗格列酮,0 - 3.2μM troglitazone, 0 - 3.2μM GW9662,或0 - 6.4μM T0070907单独或结合在一起。mda - mb - 231细胞最初镀以类似的方式和处理控制或治疗包含0 - 3的媒体μ米γ-tocotrienol, 0 - 6.4μ罗格列酮,0 - 6.4μM troglitazone, 0 - 6.4μM GW9662,或0 - 6.4μM T0070907单独或结合在一起。所有的细胞都被喂以新鲜治疗媒体每隔一天为期4天的潜伏期。与75年之后,细胞细胞溶解μL(被动裂解缓冲和治疗根据制造商的指示使用dual-glo荧光素酶检测系统。计算结果作为原始荧光素酶单位除以原始renilla单位。垂直条指示PPRE介导记者活动±SEM(任意单位)在每个治疗组。 与vehicle-treated控制。
3.8。的影响γ-Tocotrienol和PPARγ受体激动剂罗格列酮和Troglitazone对言论共激活剂单独或结合在一起

免疫印迹分析表明,治疗2μM (MCF-7细胞)或3μ(mda - mb - 231细胞)γ-tocotrienol单独诱导只有轻微,但微不足道的影响在CBP p / 300的表达,CBP C-20或SRC-1 vehicle-treated控件(数据相比8(一个)和8 (b))。3.2治疗μM (MCF-7细胞)或6.4μ(mda - mb - 231细胞)PPARγ受体激动剂罗格列酮和troglitazone仅引起轻微下降,CBP p / 300和SRC-1,但不是CBP C-20,表达式(数字8(一个)和8 (b))。然而,与这些相同剂量的联合治疗γ-tocotrienol罗格列酮和troglitazone导致显著降低CBP p / 300, CBP C-20或SRC-1表达式MCF-7和mda - mb - 231细胞与车辆处理控件(数字8(一个)和8 (b))。

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图8
免疫印迹分析γ-tocotrienol和PPARγ受体激动剂(罗格列酮和troglitazone)当单独使用或结合CBP p / 300的水平,CBP C-20, SRC-1 MCF-7 (a)和(b)人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。MCF-7细胞最初镀 细胞/ 100毫米培养皿和处理控制或治疗媒体包含2μ米γ-tocotrienol, 3.2μM罗格列酮,或3.2μM troglitazone单独或结合在一起。mda - mb - 231细胞被镀在类似的方式和处理控制或治疗媒体包含3μ米γ-tocotrienol或6.4μ罗格列酮或6.4米μM troglitazone单独或结合在一起。所有的细胞都被喂以新鲜治疗媒体每隔一天进行为期4天的潜伏期。后来,整个细胞溶解产物来自细胞在每个治疗组和准备后续通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(50μg / lane)其次是免疫印迹分析。扫描光密度分析所有墨迹图一式三份,每个乐队的集成光学密度与相应的规范化β肌动蛋白,酒吧图表所示各自免疫印迹图像。图中垂直条指出的标准化集成光密度乐队每车道可视化±SEM。 与vehicle-treated控制。
3.9。的影响γ-Tocotrienol和PPARγ拮抗剂GW9662和T0070907对言论共激活剂单独或结合在一起

免疫印迹分析表明,治疗2μM (MCF-7细胞)或3μ(mda - mb - 231细胞)γ-tocotrienol单独诱导表达的只有轻微影响CBP p / 300, CBP C-20或SRC-1 vehicle-treated控件(数据相比9(一个)和9 (b))。3.2治疗μM (MCF-7细胞)或6.4μ(mda - mb - 231细胞)的PPARγ拮抗剂,GW9662 T0070907,仅只有轻微影响CBP p / 300, CBP C-20或SRC-1表达式(数字9(一个)和9 (b))。然而,与这些相同剂量的联合治疗γ-tocotrienol罗格列酮和troglitazone导致显著增加CBP p / 300, CBP C-20或SRC-1表达式MCF-7和mda - mb - 231细胞相比vehicle-treated控件(数字9(一个)和9 (b))。

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(b)
图9
免疫印迹分析γ-tocotrienol和PPARγ拮抗剂(GW9662和T0070907)当单独使用或结合彼此确定蛋白质水平的CBP p / H300, CBP C-20, SRC-1 MCF-7 (a)和(b) mda - mb - 231细胞。MCF-7细胞最初镀 细胞培养板/ 100毫米和处理控制或治疗媒体包含2μ米γ-tocotrienol, 3.2μM GW9662,或3.2μM T0070907单独和组合。mda - mb - 231细胞被镀以类似方式和细胞治疗与控制或治疗媒体包含3μ米γ-tocotrienol, 6.4μM GW9662,或6.4μM T0070907单独或结合在一起。所有的细胞都被喂以新鲜治疗媒体每隔一天进行为期4天的潜伏期。之后,整个细胞溶解产物被从每个治疗组细胞准备后续通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(50μg / lane)其次是免疫印迹分析。扫描光密度分析所有墨迹图一式三份,每个乐队的集成光学密度与相应的规范化β肌动蛋白,酒吧图表所示各自免疫印迹图像。图中垂直条指出的标准化集成光密度乐队每车道可视化±SEM。 与vehicle-treated控制。
3.10。的影响γ-Tocotrienol和PPARγ拮抗剂GW9662和T0070907单独或结合在PI3K / Akt促有丝分裂的信号

治疗2μ米γ-tocotrienol 3.2μ米的PPARγ拮抗剂GW9662或独自T0070907有很少或没有影响细胞内的一种蛋白激酶水平,phospho-Akt, PTEN、phospho-PTEN, PI3K和PDK-1 MCF-7细胞在为期4天的治疗期之后(图10 ())。然而,联合治疗具有相同剂量的这些药物导致phospho-Akt水平明显降低,PDK-1, PI3K,但很少或根本没有影响总Akt、PTEN和phospho-PTEN水平相比vehicle-treated MCF-7细胞对照组(图10 ())。同样,治疗3μ米γ-tocotrienol, 6.4μM GW9662或6.4μM T0070907单独有很少或没有影响细胞内水平phospho-Akt(激活),PDK-1, PI3K, Akt, PTEN、和phospho-PTEN乳腺癌mda - mb - 231细胞,比vehicle-treated控制(图10 (b))。综合治疗具有相同剂量的这些代理phospho-Akt导致明显降低,PDK-1和PI3K的水平相比,乳腺癌mda - mb - 231细胞vehicle-treated对照组(图10 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图10
免疫印迹分析γ-tocotrienol和PPARγ拮抗剂(GW9662或T0070907)单独或结合一种蛋白激酶,phospho-Akt, PTEN、phospho-PTEN, PI3K和PDK-1水平MCF-7 (a)和(b) mda - mb - 231细胞。MCF-7细胞最初镀 细胞/ 100毫米培养皿和处理控制或治疗媒体包含2μ米γ-tocotrienol, 3.2μM GW9662,或3.2μM T0070907单独或结合在一起。镀mda - mb - 231细胞也以类似的方式和细胞治疗与控制或治疗媒体包含3μ米γ-tocotrienol, 6.4μM GW9662,或6.4μM T0070907单独或结合在一起。所有的细胞都被喂以新鲜治疗媒体每隔一天进行为期4天的潜伏期。之后,整个细胞溶解产物被从每个治疗组细胞准备后续通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(50μg / lane)其次是免疫印迹分析。扫描光密度分析所有墨迹图一式三份,每个乐队的集成光学密度与相应的规范化β肌动蛋白,酒吧图表所示各自免疫印迹图像。图中垂直条指出的标准化集成光密度乐队每车道可视化±SEM。 与vehicle-treated控制。

进行了类似的研究来确定组合的影响γ-tocotrienol PPAR治疗γ受体激动剂罗格列酮和troglitazone PI3K / Akt促有丝分裂的信号在MCF-7和乳腺癌细胞mda - mb - 231。然而,很少或根本没有这些促有丝分裂的蛋白质的相对水平的差异观察在不同治疗组(数据未显示),显然是因为各种治疗组积极增殖细胞在一个附近的最大增长率。

3.11。凋亡的影响γ-Tocotrienol和PPARγ拮抗剂GW9662和T0070907单独或结合在一起

为了确定生长抑制效应造成subeffective剂量的治疗相结合γ-tocotrienol和PPARγ拮抗剂可能源于活细胞数量的减少,研究确定进行了急性效应(24小时)和慢性效应(96 - h)这些治疗的起始细胞凋亡和细胞生存能力。免疫印迹分析表明,治疗2μM (MCF-7细胞)或3μ(mda - mb - 231细胞)γ-tocotrienol独自没有影响的表达PARP裂解,裂解caspase-3或活细胞数量后24小时和96 - h治疗曝光(图(11日)和11 (b))。3.2治疗μM (MCF-7细胞)或6.4μ(mda - mb - 231细胞)的PPARγ拮抗剂,GW9662 T0070907、单独或结合各自的治疗剂量γ-tocotrienol也发现没有影响的表达PARP裂解,裂解caspase-3或活细胞治疗后24小时接触(数字(11日)和11 (b))。然而,治疗20μ米γ-tocotrienol,为了诱导乳腺癌细胞凋亡(13,14)和用作凋亡诱导积极控制在这个实验发现诱导大量增加裂解和裂解PARP caspase-3水平,和相应的活细胞数减少MCF-7和乳腺癌mda - mb - 231细胞治疗后24小时接触(数字(11日)和11 (b))。积极的凋亡控制治疗20μ米γ-tocotrienol并不包含在96 h治疗暴露实验,因为年底这个实验没有可行的剩余细胞治疗组。

(一)
(一)
(b)
(b)
图11
凋亡的影响γ-tocotrienol和PPARγ拮抗剂(GW9662或T0070907)单独或结合caspase-3和裂解PARP水平MCF-7 (a)和(b)人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。免疫印迹研究MCF-7和mda - mb - 231细胞最初镀 细胞/ 100毫米培养皿和维护控制媒体进行为期3天的文化时期。之后,细胞被分成不同的治疗组,媒体被免职,细胞暴露在媒体24小时处理一段各自的治疗。此外,细胞暴露在各自治疗96 - h治疗期间媒体,新媒体在哪里添加每隔一天。MCF-7细胞暴露在媒体包含0 - 2治疗μ米γ-tocotrienol, 0 - 3.2μM GW9662,或0 - 3.2μM T0070907单独或结合在一起,而mda - mb - 231细胞暴露于治疗包含0 - 3的媒体μ米γ-tocotrienol, 0 - 6.4μM GW9662,或0 - 6.4μM T0070907单独或结合在一起。之后,整个细胞溶解产物被从每个治疗组细胞准备后续通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(50μg / lane)其次是免疫印迹分析。在平行研究中,(a)镀MCF-7细胞密度 每组)(6井24-well文化板块,而(b)镀mda - mb - 231细胞的密度 (6井/组)在96年文化板块和暴露于相同的治疗方法如上所述。24小时处理曝光后,活细胞数量在所有治疗组使用MTT试验确定。垂直条指示的意思是在每个治疗组细胞计数±SEM。 与vehicle-treated控制。

4所示。讨论

这些研究结果表明,当独自一人时,给予治疗γ-tocotrienol, PPARγ受体激动剂(罗格列酮和troglitazone)或PPARγ拮抗剂(GW9662和T0070907),诱导的抑制细胞和细胞龛之间明显的剂量反应关系MCF-7的增长和人类乳腺癌mda - mb - 231细胞文化。然而,当结合在一起使用时,使用低剂量的PPAR进行治疗γ受体激动剂被发现反向,而使用低剂量的PPAR进行治疗γ对手被发现协同提高的抗增殖作用γ-tocotrienol。进一步的研究确定协同抑制MCF-7和mda - mb - 231肿瘤细胞生长产生的低剂量治疗相结合γ与PPAR -tocotrienolγ拮抗剂与PPAR的减少γPPRE介导记者活动,RXR PPAR的增加γ共激活剂表达式和相应的抑制PI3K / Akt mitogenic-signaling。相反,在MCF-7增强,mda - mb - 231肿瘤细胞生长产生的低剂量治疗相结合γ与PPAR -tocotrienolγ受体激动剂与PPAR的增加有关γPPRE介导记者活动,RXR PPAR下降γ共激活剂表达式和相应的恢复EGF-dependent PI3K / Akt mitogenic-signaling vehicle-treated对照组相比。总的来说,这些发现表明联合治疗γ与PPAR -tocotrienolγ拮抗剂显示协同抗癌活性,可能提供了一些在人类乳腺癌的治疗中获益。这些发现还表明匹配的重要性免费抗癌剂用于联合治疗,因为不匹配可能会导致在敌对的和不受欢迎的治疗反应。

之前的调查表明,PPARγ受体激动剂和拮抗剂作为有效的抗癌药物(28,29日]。PPAR的作用γ受体激动剂作为抗癌药物在治疗结肠癌已经研究的很透彻,胃,和肺癌3,11),然而,PPARγ拮抗剂已被证明产生强有力的抗增殖作用在许多造血和上皮肿瘤细胞系(11,28]。在目前的研究结果证实并扩展这些先前的结果。剂量反应研究表明,PPAR治疗γ受体激动剂或拮抗剂显著抑制增长的人类MCF-7和乳腺癌mda - mb - 231细胞文化。此外,treatment-induced抗增殖作用被发现更多的发音在mda - mb - 231 MCF-7乳腺癌细胞相比,这些结果与之前报道(28]。

许多调查证实γ-tocotrienol作为一种有效的抗癌剂,抑制小鼠的生长16,30.和人类31日,32乳腺癌细胞。此外,研究也显示,联合治疗γ-tocotrienol与其他传统化疗往往导致一个添加剂或协同抑制癌症细胞的生长和生存能力16,30.]。使用结合tocotrienols疗法的基本原理是基于电阻一个代理的原则是可以克服使用多个代理显示免费抗癌机制的行动。初步研究显示混合tocotrienols和它莫西芬的添加剂抗癌效应对经济增长的雌激素受体阳性MCF-7和雌激素受体阴性mda - mb - 435细胞(33),这些发现后来被证实在其他报告34]。最近的研究也表明协同抗癌作用的结合使用γ-tocotrienol与他汀类药物(35- - - - - -37),酪氨酸激酶抑制剂(18,38),cox - 2抑制剂(39,40),和之外抑制剂(41]。这些研究得出的结论是,联合治疗是最有效的抗癌的作用机制γ-tocotrienol赞美其他药物的作用机制,并可能提供重要的有益健康的预防和/或治疗乳腺癌的女性,同时避免抗肿瘤或毒性作用,通常与大剂量单药治疗有关。

PPAR的确切作用γ在乳腺癌细胞增殖和生存并不清楚。先前的研究已经表明PPARγ激活导致大量脂质积累和乳腺上皮细胞基因表达的变化,促进了更多的分化和更少的恶性表型,并减弱乳腺癌细胞生长和发展42,43]。其他研究已经表明,γ-tocotrienol增强了表达的多种形式的PPARs选择性地调节PPAR目标基因(21]。抗增殖的影响γ-tocotrienol之前假设由的作用γ-tocotrienol刺激PPARγ激活PPAR的通过增加生产γ配体,15-lipoxygenase-2人类前列腺癌细胞(22]。然而,发现目前研究中使用两种不同类型的人类乳腺癌细胞系表明低剂量治疗γ-tocotrienol PPAR下降γ的水平,而联合治疗γ与PPAR -tocotrienolγ受体激动剂导致PPAR的高程γ水平和增加相应的乳腺癌细胞的生长。这些矛盾的结果可能解释为不同的癌症细胞类型和实验模型用于检查联合治疗效果在这些不同的研究。然而,目前发现清楚地展示在敌对的对乳腺癌细胞增殖的影响,当处理的组合γ-tocotrienol和PPARγ受体激动剂,并提供了强有力的证据表明,增加PPAR的表达式γ是一个负面指标抗癌治疗乳腺癌的响应性。这个假说是发现PPAR的进一步证据γ乳腺癌细胞表达水平升高与正常乳腺上皮细胞(9,44),和老鼠基因倾向于发展中PPAR乳腺肿瘤持续表达高水平的激活γ控制老鼠(相比9,44]。也有可能大剂量治疗与PPAR的抗癌效果γ受体激动剂可能通过PPAR介导γ独立的机制。

本研究也证实,扩展了以前的研究结果表明,PPAR治疗γ拮抗剂显著抑制乳腺癌细胞的生长。实验结果表明,PPARγ拮抗剂下调PPARγ激活和表达和这些影响与增强的响应有关抗癌疗法(45,46]。然而,目前的研究还显示,联合治疗的γ与PPAR -tocotrienolγ拮抗剂诱导一个相对大的PPAR转录活性的下降γ。这种治疗也导致PPAR的表达下降γ和RXR,这些影响是显著降低乳腺癌细胞生长。PPARγ函数作为异质二聚体专partner-RXR异质二聚体。像其他核激素受体,PPARγrxr异质二聚体新兵辅因子复合物,辅活化因子或辅阻遏物来调节他们的转录活动45]。在绑定的配体异质二聚体复杂,辅阻遏物背井离乡,受体然后同事共激活剂分子。这些辅活化因子包括SRC-1, CBP C-20, CBP同系物p / 300 (47,48]。联合治疗的γ-tocotrienol和PPARγPPAR antagonists-induced抑制转录γ,似乎也减少共激活剂分子的招聘PPAR可用γrxr易位到细胞核形成,最终导致海拔免费共激活剂水平在细胞质中。综合这些结果表明,乳腺癌细胞需要PPARγ激活生存,PPAR的治疗旨在减少或抑制γ水平和/或激活和可能在乳腺癌的治疗提供了一种有效的策略。

PPARγ活动可以被磷酸化调制在多个站点49]。此外,PPARγ配体可以降低PI3K和其下游目标Akt的活动(50]。联合治疗的γ与PPAR -tocotrienolγ拮抗剂发现减少PI3K,磷酸化PDK-1(积极的),和phosphorylated-Akt MCF-7(主动)水平和乳腺癌mda - mb - 231细胞。此外,这些影响并不与PTEN的增加相关活动,磷酸酶参与科索沃民主党和Akt的失活。这些发现表明,抗增殖效果的总和γ-tocotrienol和PPARγ拮抗剂治疗是通过抑制PI3K / Akt介导的促有丝分裂的信号。这些影响被发现细胞抑制剂在大自然中,而不是与细胞生存能力下降导致细胞凋亡的起始。以前的研究结果也表明,PPAR治疗γ拮抗剂可以导致减少PI3K / Akt促有丝分裂的信号(51]。

5。结论

导致这些研究表明低剂量治疗相结合γ-tocotrienol和PPARγ拮抗剂协同作用抑制人类乳腺癌细胞增殖,这效果似乎是由一个大型的PPAR的减少γ表达式和相应的减少PI3K / Akt促有丝分裂的信号。与PPAR虽然高剂量治疗γ受体激动剂也还发现人类乳腺癌细胞生长抑制,这是最有可能的,这些影响是通过PPAR介导γ独立的机制,因为多数PPAR的实验证据有力地表明,海拔γ表达式是健壮的乳腺癌细胞生长的指标和抗抗癌疗法,而PPAR的减少γ表达式是降低乳腺癌细胞增殖的指标,增加了化疗药物的反应。这些发现还表明,结合抗癌疗法并不总是导致添加剂或协同抗癌响应,但会导致矛盾的观察/敌对的反应的综合治疗γ与PPAR -tocotrienolγ受体激动剂在MCF-7和人类乳腺癌细胞mda - mb - 231。的重要性理解细胞内抗癌药物的作用机制是至关重要的优化治疗的反应。显然这也是明显,使用γ-tocotrienol结合PPARγ对手可能有潜在的治疗价值女性乳腺癌的治疗。

确认

这项工作是支持部分由第一Tec国际有限公司(香港),马来西亚棕榈油理事会(MPOC)和路易斯安那州癌症基金会。作者要感谢第一科技国际有限公司慷慨地提供γ-tocotrienol在这些研究中使用。