Lymphangiogenesis和腋窝淋巴结转移与VEGF-C表达在两个免疫活性的鼠乳腺癌模型

文摘

Lymphangiogenesis和血管内皮细胞生长因子的表达C (VEGF-C)肿瘤被认为是有原因地促进淋巴转移。只有少数研究淋巴转移的免疫活性的同种异体移植物小鼠模型。研究之间的关系VEGF-C-mediated lymphangiogenesis和腋窝淋巴结转移,我们使用两个鼠标乳房癌细胞系;BJMC338低转移性倾向,而BJMC3879高转移性倾向虽然起源于前细胞系。每个细胞株分别注入两组雌性BALB /c老鼠创建在活的有机体内乳腺癌模型。的表达水平在BJMC3879高于BJMC338 VEGF-C。作为父细胞系,BJMC3879-derived肿瘤显示高表达VEGF-C BJMC338-derived相比肿瘤。这VEGF-C BJMC3879-derived肿瘤的高表达与浸润的巨噬细胞和增强表达显著增加,淋巴管内皮透明质酸receptor-1 (LYVE-1)反映增加tumoral淋巴管密度和随后的腋窝淋巴结转移的感应。我们鼠标乳房癌模型allotransplanted肿瘤显示相同的人类乳腺癌腋窝淋巴结转移光谱。因此,我们的鼠标模型是理想的探索各种癌症转移的分子机制。

1。介绍

根据临床和病理观察人类乳房癌、乳腺细胞癌的转移性传播负责大部分的癌症死亡(1- - - - - -5]。最初的癌症的共同途径传播是通过淋巴管内皮结构由于其特点blind-ending毛细血管(6]。此外,通过淋巴管转移到区域淋巴结的被认为是一种常见的一步的进展癌症和一个重要的预后因素在许多类型的癌症包括乳房癌。淋巴管密度(LVD)在许多类型的固体肿瘤淋巴结转移和预后不良有关,据报道在实验和临床研究(1- - - - - -5,7,8]。虽然乳房癌是众所周知的淋巴结转移的角色,只有少数小鼠乳腺癌模型显示淋巴结广泛转移。小鸡胚胎绒毛膜尿囊的膜(9)和免疫缺陷小鼠,SCID小鼠或裸体小鼠作为动物异种器官移植主机检查转移(10- - - - - -12]。最近的研究表明肿瘤相关巨噬细胞(tam)表达的重要角色CD68在cancer-mediated lymphangiogenesis [13- - - - - -15]。因此,老鼠免疫活性的模型似乎是研究lymphangiogenesis和淋巴结转移的必要条件。

血管内皮生长因子C (VEGF-C)是一个主要lymphangiogenic因素。有证据表明,VEGF-C促进lymphangiogenesis几个正常和病理条件下(16]。在VEGF-C-deficient小鼠胚胎,从静脉淋巴管无法发展17)导致产前死亡由于小鼠胚胎组织积液和水肿在成人(18]。另一方面,在VEGF-C转基因老鼠,增生的淋巴脉管系统据报道(19,20.]。

研究之间的关系lymphangiogenesis由VEGF-C和腋窝淋巴结转移,两个鼠标乳房癌细胞系具有不同转移性属性被用于这项研究。两个细胞系来自相同的BALB /c鼠标,其中之一,BJMC338细胞系,腺癌细胞系,具有低转移性倾向,而其他细胞系,BJMC3879,转移性倾向高,尤其是淋巴结和肺(21]。每个细胞株注入分别分成两组的成年雌性BALB /c老鼠创建在活的有机体内乳腺癌模型。接种在这个研究中,我们发现,增加表达tumor-derived VEGF-C LVD与腋窝淋巴结转移相关。

2。材料和方法

2.1。在体外研究

2.1.1。细胞培养和细胞准备

两个鼠标乳房癌细胞系被用于这项研究。BJMC338乳腺腺癌细胞株用于本研究来自雌性BALB /c老鼠感染小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)到腹股沟乳腺和显示低转移财产。BJMC3879乳腺腺癌细胞系是来自焦点的转移性淋巴结和肺内雌性BALB /c鼠标已经与BJMC338细胞系注入右腹股沟区。BJMC3879乳腺细胞行显示了一个高转移性倾向,尤其是淋巴结和肺(22]。细胞系都维护在RPMI 1640中含10%胎牛血清(的边后卫)与链霉素/青霉素在孵化器有限公司5%₂。细胞立即冲洗0.01磷酸缓冲盐(PBS),和2%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定在0.1 M磷酸盐缓冲剂(PB) (pH值7.4)1 h,透射电子显微镜(TEM)。细胞随后后缀OsO在1%₄45分钟在室温下,脱水在一系列的乙醇分级浓度,清除氧化丙烯,嵌入在环氧树脂混合物。在immunofluorescent研究中,细胞在PBS和1%多聚甲醛固定了10分钟。

2.1.2。TEM

准备后,超薄部分准备和染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。60 nm部分检查通过TEM使用h - 7100和h - 7650(日立、东京、日本)。

2.1.3。Immunofluorescent研究

固定后,细胞被转移到PBS 15分钟,其次是暴露于1%块Ace(日本住友制药有限公司,东京,日本)20分钟阻止非特异性抗体绑定。细胞培养主要兔子anti-VEGF-C抗体(兔多克隆;美国加州圣克鲁斯生物技术,Santa Cruz)在室温下1 h (RT)。在PBS 15分钟,冲洗后细胞与二次孵化异硫氰酸荧光素(FITC)——共轭anti-rabbit抗体(美国加州Dako, Carpenteria) 30分钟在rt,样本复染色propidium碘(π)15分钟,观察模型下光辉2000议员共焦激光扫描显微镜(美国加州Bio-Rad,大力神)。

2.1.4。免疫印迹分析VEGF-C蛋白质

样品中含有20个μ克蛋白质从培养细胞和肿瘤分级在10% Tris-glycine减少条件下凝胶和转移到硝化纤维膜。Anti-VEGF-C抗体(圣克鲁斯生物技术)应用于膜,与适当的辣根peroxidase-conjugated二级抗体孵化,可视化在x射线电影使用增强化学发光(珀金埃尔默生命科学公司,波士顿,质量,美国)。

2.1.5节讨论。RNA制备和逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

总RNA分离培养BJMC338 BJMC3879细胞使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)和互补脱氧核糖核酸合成装备(罗氏诊断工具包、希尔登,德国)制造商的协议后,总信使RNA浓度调整到5μ克/μL在每个样本。引物序列VEGF-C 5′-CCTTCTTTAAACCTCCATGTGT-3′, 5′-GCAAAACTGATTGTGACTGGT-3′;glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内部控制5′-TGCACGGGAAGCTCACTGG-3′, 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(日本基因研究实验室、仙台、日本)。产品放大GeneAmp PCR系统9700(美国应用生物系统公司,加州福斯特城)在98°C与预培养3分钟紧随其后30 94°C的周期30年代,58°C 30年代,60年代和72°C。放大与single-3分钟完成了孵化在72°C。PCR产品1.5%琼脂糖凝胶上分离,沾染了溴化乙锭0.1毫克/毫升、可视化通过紫外线透照法,对黑人和白人即时电影和记录。

2.2。在活的有机体内研究

2.2.1。动物和肿瘤的准备

共有40名女性流行BALB /c老鼠(日本SLC Inc .、滨松、日本)被用于这项研究。所有操作按照程序执行的老鼠中概述的保健指南和使用实验动物在大阪医科大学。老鼠老鼠分成两组(20),和BJMC338 BJMC3879细胞(5×10⁶细胞在PBS / 0.3毫升)接种皮下注射进右腹股沟区,分别。老鼠牺牲4,6,8,接种在乙醚麻醉后10周。肿瘤样本冷冻免疫印迹试验和rt - pcr。另一个是与4或10%多聚甲醛固定的组织病理学和免疫组织化学、电镜在一个相同的固定剂在体外研究。肺和右腋窝淋巴结的老鼠被移除,然后固定一样肿瘤。样品处理与多聚甲醛固定石蜡包埋。

2.2.2。组织病理学和免疫组织化学

检查组织病理学和转移、肿瘤、肺、光和腋窝淋巴结被苏木精和伊红染色())。透射电镜下检查肿瘤的超微结构特征。avidin-biotin复杂方法用于免疫组织化学。可视化淋巴管,肿瘤染色主要lymphatic-specific标记抗体,淋巴管内皮透明质酸receptor-1 (LYVE-1)(兔多克隆,阿克利抗体GmbH, Hiddenhausen,德国)。VEGF-C (Santa Cruz)标记的肿瘤部分,并激活巨噬细胞被证明CD68抗体(鼠anti-mouse CD68, AbD Serotec,牛津大学,英国)。

2.2.3。淋巴管密度(LVD)和巨噬细胞的计数

淋巴管数量immunolabeled anti-LYVE-1抗体在肿瘤的部分在4到10周postinoculation以及CD68-positive细胞的数量在4周postinoculation肿瘤部分光学显微镜下计数在较高放大(×200)。

2.2.4。统计分析

通过学生的上述数据进行了分析t以及。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。在体外研究

3.1.1。VEGF-C的超微结构和表达

BJMC338和BJMC3879细胞超微结构的差异使用TEM研究了。两个细胞系表现出相同的形态在TEM(数字1(一)和1 (b))。他们杰出的核仁和分散的小核染色质浓缩。immunofluorescent研究,VEGF-C几乎BJMC338细胞中表达,而适度表达BJMC3879细胞(数字1 (c)和1 (d))。VEGF-C蛋白质的水平在两个细胞系是由免疫印迹;乐队的强度是衡量和纠正β肌动蛋白强度。适度增加VEGF-C BJMC3879细胞中蛋白质含量检测(图1 (e))。rt - pcr分析显示高VEGF-C mRNA表达BJMC3879细胞比BJMC338细胞(图1 (f))。

3.2。在活的有机体内研究

3.2.1之上。组织病理学和转移

组织病理学,这两种类型的接种乳房癌(BJMC338和BJMC3879肿瘤)被证明是中度分化腺癌。肿瘤都伴随着一个可行的地区,一个中央坏死,炎症区域(数据2(一个)和2 (b))。肿瘤细胞的形态是可行的地区一样培养细胞系(数字2 (c)和2 (d))。腋窝淋巴结转移或肺8和10周postinoculation染色观察验证的部分)。postinoculation 8点和10周,没有观察到淋巴结和肺转移的小鼠注射BJMC338细胞(数字3(一个)和3 (c))。相比之下,所有的小鼠接种BJMC3879腋窝淋巴结和肺细胞出现远处转移8点和10周postinoculation(表1,数据3 (b)和3 (d))。

3.2.2。Lymphangiogenesis肿瘤小鼠模型

通过免疫组织化学方法观察肿瘤的淋巴管使用特定于淋巴管的抗体,LYVE-1。在4周postinoculation,很少有淋巴管是BJMC338肿瘤(图中发现的4(一))。在6周postinoculation,几个淋巴管被观察到在瘤内结缔组织和/或周围的结缔组织(数字4 (c),4 (e),4 (g))。相反,大量的扩张淋巴管有或没有肿瘤细胞中观察到,在4到10周postinoculation BJMC3879肿瘤(数字4 (b),4 (d),4 (f),4 (h))。

3.2.3。淋巴管密度(LVD)

BJMC3879肿瘤的LVD总是显著高于BJMC338肿瘤(图5)。在BJMC338肿瘤,LVD在6周postinoculation明显高于4周postinoculation (),在那之后,没有显著差异在LVD观察(图5)。然而,BJMC3879肿瘤,不同LVD 8至10周postinoculation不显著;一个显著差异是发现6 - 8周postinoculation (),即在8周postinoculation LVD显著增加(图5)。

3.2.4。TEM对淋巴管

的地位和淋巴管的超微结构特征在接种肿瘤透射电镜下检查。淋巴毛细血管内观察周围的结缔组织和肿瘤。他们区别于毛细血管。考试的淋巴毛细血管透露,薄内皮,abluminal内皮细胞突出,没有周皮细胞,没有薄densa,重叠连接(数字6(一)- - - - - -6 (d))。管腔内的肿瘤细胞腔(图中观察到6(一))。有趣的是,白细胞被证明进入和/或从淋巴腔(图6(一))。此外,吸收caseinlike滴观察到淋巴腔(图6 (c))。

3.2.5。VEGF-C表达的肿瘤

VEGF-C-positive细胞局部主要在肿瘤的可行的外围区域。免疫组织化学研究和免疫印迹分析清楚地证明了弱表达VEGF-C BJMC338肿瘤(数字7(一)和7 (c)),相对于强大的表达式BJMC3879肿瘤(数字7 (b)和7 (c))。

3.2.6。CD68-Positive巨噬细胞在肿瘤的分布

CD68-positive巨噬细胞被发现主要在可行区域的肿瘤(图8)。CD68-positve巨噬细胞含有液泡的细胞质聚合的肿瘤。巨噬细胞在BJMC3879肿瘤的密度明显高于BJMC338肿瘤()(图8)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现,小鼠乳腺肿瘤细胞(BJMC3879)有高转移性倾向更高层次的表达比鼠标VEGF-C乳腺肿瘤细胞(BJMC338)和低转移性倾向,和接种BJMC3879肿瘤表达VEGF-C相当于肿瘤细胞系。在高转移性小鼠乳腺肿瘤(BJMC3879)、LVD与VEGF-C表达水平都高于低转移性小鼠乳腺肿瘤(BJMC338)。BJMC3879肿瘤细胞接种导致腋窝淋巴结和肺转移,而BJMC338肿瘤细胞接种后没有发生转移。

有一些人类乳腺癌的临床调查证明LVD与恶性肿瘤之间的因果关系,VEGF-C表达式、淋巴结转移和预后[1,4,5]。LVD增加乳腺癌与淋巴结转移和VEGF-C表达式。这是得出结论,高LVD可能是一个重要的不利预后因素乳腺癌患者的长期生存。我们的结果与报告。相反这些LVDs的临床重要性的基础上,临床病理的研究包括乳腺癌,这是推测,瘤内淋巴管没有功能。没有乳腺癌被发现含有ki - 67积极分淋巴管内皮细胞(23),通过实验microlymphangiography试验,没有发现功能排水intratumoural淋巴管(24]。他们还发现,功能性淋巴管肿瘤边缘就有充分的理由的淋巴转移(24,25]。据报道,腋窝淋巴结转移程度的增加与增加LVD、高患者肿瘤前期LVD遥远5年无病生存率只有58%,相比之下,74%在这些肿瘤前期LVD低。此外,瘤内淋巴管的存在与腋窝淋巴结状态和生存(24]。此外,不仅LVD瘤旁淋巴血管的大小可能是一个重要的考虑淋巴结转移(7]。因为淋巴肿大可能收集组织液和癌症细胞从肿瘤表面渗出,这是建议使用老鼠杂种瘤细胞及其syngenic小鼠瘤旁和瘤内淋巴管转移中可能发挥着至关重要的作用[26]。

VEGF-C表达在乳腺癌已被视为临床病理的预后因子(8,27- - - - - -29日]。然而,单变量也免不了等人的研究表明,高VEGF-C表达水平与良好的预后显著相关无病生存期和总生存期(例如,高VEGF-C水平与低度恶性肿瘤和一个较小的大小)。此外,多变量分析证实VEGF-C[的独立的预后价值30.]。渡边等人相比,CD44的表达变异和VEGF-C长期预后相关因素,他们得出的结论是,没有VEGF-C表达和临床病理的预后因子之间的联系(31日]。临床病理的研究使用rt - pcr表明VEGF-C和VEGF-D参与淋巴管侵犯淋巴结转移之前,和他们的表达水平下降后淋巴结转移的发生(32]。在61例病例的回顾性研究,据报道,LVD可以作为预测淋巴结转移和预后的因素,而VEGF-C和VEGF-D在lymphangiogenesis可能扮演重要角色,使癌更激进,导致乳腺癌的预后不良(8]。因为有争议的结果显示,高VEGF-C水平与低度相关肿瘤和更小的尺寸,也免不了等人认为,在人类癌症VEGF-C蛋白处理的机制需要进一步研究[30.]。因为瘤内VEGF-C蛋白质水平变化对瘤内微环境,VEGF-C的表达式和VEGF-D可能不足临床病理的预后因素。

评估VEGF-C lymphangiogenesis和淋巴结转移的影响,一些人类乳腺癌细胞系在活的有机体内SCID小鼠,异种器官移植到免疫缺陷小鼠或裸体小鼠11,12]。用人类MCF-7乳腺癌细胞,这是糟糕的入侵和雌激素依赖的,马提拉等人表明,刺激肿瘤的生长在活的有机体内在VEGF-C overexpressing MCF-7细胞裸鼠异种移植。此外,LVD在内部和瘤旁淋巴血管的肿瘤促进增加了VEGF-C来自异种器官移植MCF-7细胞。虽然这些报道,即使在异种移植小鼠,支持我们的结果tumoral VEGF-C表达中发挥着重要作用lymphangiogenesis鼠标乳房癌的淋巴结转移,免疫细胞的作用必须考虑包括巨噬细胞在肿瘤转移。最近的研究表明,VEGF-C分泌tam (13- - - - - -15]。我们的免疫活性的小鼠模型显示的存在CD68-positive tam在接种肿瘤,和tam的密度high-metastatic小鼠模型是高于low-metastatic小鼠模型。

5。结论

乳房癌的LVD强烈表达VEGF-C高于癌表达VEGF-C偏低的前腋淋巴结转移。在这项研究中我们接种小鼠乳腺癌模型allotransplanted和免疫活性的肿瘤显示人类乳腺癌淋巴结转移光谱一样。因此,我们研究小鼠模型是最理想的淋巴结转移。

承认

这项工作是由格兰特19591519从日本教育科学。

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