CEACAM1, ECM,间充质干细胞在人类乳腺癌的一个原位模型

文摘

癌胚antigen-related细胞粘附molecule-1 (CEACAM1)是一个摆渡的在体外模型腔形成和发挥类似的作用在乳腺上皮细胞植入人性化NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫。尽管胞外基质单独能充分刺激腔形成CEACAM1转染MCF-7细胞生长在3 d的文化,有一个额外的要求基质或间充质细胞(msc)这些细胞形成异种移植腺体结构的原位网站。我们证明了最优在体外条件包括基底膜基质和msc和胶原蛋白的包容我抑制异种移植分化。此外,没有必要删除新生小鼠乳腺。以前观察到的差异在开发之间的长和短腺胞质域亚型CEACAM1不再是观察到的怀孕NOD / SCID小鼠暗示刺激乳腺脂肪垫的妊娠严重影响异种移植分化。

1。介绍

乳腺发展严重依赖于间充质组织(1,2]。在正确的上下文中,乳腺上皮细胞将开发分支腺组织牛奶产量的能力。为了研究人类乳腺癌动物模型,有必要移植乳腺癌细胞在原位站点以及人类ECM等基质细胞和其他组件。基本组件的识别适当的乳腺癌上皮细胞的生长是由比塞尔和同事在一个在体外模型中,乳腺上皮细胞生长在一个3 d的文化基底膜基质提供的细胞外基质(3,4]。然而,这个模型缺乏间充质细胞的贡献(msc)与正常乳腺发育和乳腺癌1,5]。最近,Kuperwasser et al。6)开发了一个在活的有机体内模型在NOD / SCID小鼠新生小鼠乳腺切除和永生的人类乳房纤维母细胞被引入人性化前腺的人类乳腺上皮细胞。模型的其他组件包括使用radiation-killed乳房纤维母细胞、基底膜基质,和胶原蛋白。在我们的研究中,我们发现,人类乳腺上皮细胞系MCF7缺乏CEACAM1未能形成腺腔在体外3 d模型,而转染CEACAM1 MCF7细胞恢复稍形成(7]。同样的,当野生型MCF7细胞生长在人性化NOD / SCID小鼠的乳腺脂肪垫,实体肿瘤形成,而CEACAM1转染MCF7细胞形成腺腔(8]。令人惊讶的是,我们发现腺形成差CEACAM1的两个主要的亚型,即短期(形式没有腺体)和长期(形式腺体)胞质域亚型。这种差异导致我们推测,短到长在人类乳腺癌亚型的比例可能会改变在乳腺癌导致改变的形态学特征导管原位癌(DCIS) [9]。这些结果也提示我们解剖的磷酸化状态长期和短期胞质域人性化乳腺脂肪垫在进一步的实验模型(8,10]。这些研究的过程中,我们开始质疑的角色的每个组件使用的人性化的小鼠乳腺脂肪垫和腺的生理状态。

在模型的综合分析,我们发现,不需要切除新生小鼠乳腺获得高分化腺形成异种移植为CEACAM1转染MCF7细胞。我们还表明,永生的人类可以使用msc的永生的乳房成纤维细胞和胶原蛋白我没有要求或radiation-killed乳房纤维母细胞。然而,包含人工基底膜和msc似乎是必不可少的,而包含胶原蛋白我抑制异种移植分化。有趣的是,上述短同种型CEACAM1 (CEACAM1-4S),未能形成腺体在原始模型中,形成腺体在怀孕NOD / SCID小鼠,表明腺的生理状态也很重要。

msc在乳腺癌发展中的作用最近探索温伯格集团(11],他们证明了msc可促进乳腺癌转移某些乳腺癌细胞系小鼠皮下注射。我们在这里展示,msc,在这种情况下不灭的msc、不一定是prometastatic所预测的Karnoub et al。11),而是可以促进分化和腺上皮细胞在异种移植的发展。

2。材料和方法

本研究通过的希望/贝克曼研究所机构动物保健和使用委员会(IACUC)和机构生物安全委员会(IBC)。所有动物实验动物资源中心,在正/砖AAALAC认可并符合动物福利法案和指导实验室动物保健和使用的。人类胎儿骨髓采集机构审查委员会批准(IRB)。

2.1。细胞培养

MCF-7,乳腺癌细胞株mda - mb - 468 (MEM培养基谷酰胺,10%的边后卫,1%碳酸氢钠,丙酮酸钠1%和1% antibacterial-anti-mycotic解决方案),和DU4475 (rpmi - 1640中补充谷酰胺,10%的边后卫,和1% antibacterial-anti-mycotic解决方案),得到从美国式的文化收集和SUM1315 cellline (F-12中补充谷酰胺,10%的边后卫,5g / mL胰岛素和10 ng / mL表皮生长因子,和1% antibacterial-anti-mycotic解决方案)是Michael Rosenblatt博士的礼物,塔夫茨大学医学院的。选择稳定的细胞系:MCF-7细胞转染和选择与CEACAM1-4S或向量描述以前12]。

2.1.1。基质细胞系

不灭的乳房成纤维细胞(RMF / EG) Kuperwasser博士的礼物,塔夫茨大学(牛血清DMEM培养基补充谷酰胺,10%,和1%的抗菌和抗真菌的解决方案)和MSC细胞系(alpha-MEM中补充谷酰胺,15%的边后卫,和1% antibacterial-anti-mycotic解决方案)。生成MSC细胞系,骨髓细胞(MSC)是来自人类胎儿长骨和细胞尼龙网过滤和60毫米文化培养皿中的鹰中α(MEM -修改α)补充15%胎牛血清和25毫克/毫升庆大霉素(喂养介质)。主要msc是不灭的人类端粒酶(hTERT) pBABE-neo-hTERTretroviral向量(addgene Inc .)。多克隆的数量不灭的MSC (hTert MSC)是通过串行通道选择含有新霉素的媒体。hTERT msc被以流式细胞仪分析细胞表面标记和CD44阳性,CD90、CD105, CD146, CD166高山,STRO-1。这些细胞可以在体外分化成脂肪细胞,软骨细胞,细胞,成骨细胞分化取决于媒体(数据未显示)。

2.2。体内研究

乳腺癌细胞(020万细胞)和/或基质细胞(0.2或005万细胞)细胞外基质(50L-Matrigel或基底膜基质+ 1型胶原蛋白或PBS)注入原位网站(网站人性化原位乳腺脂肪垫或鼠乳腺间质(没有清算的脂肪垫和人性化))NOD / SCID小鼠。每组动物的数量是8和每只动物有两个异种移植,总共16异种移植。结果显示结果的代表。

2.2.1。删除和人性化的乳腺脂肪垫

人性化的原位乳腺脂肪垫鼠标模型由Kuperwasser et al。6)是使用除了mammospheres替换单个细胞悬液,msc而不是人类成纤维细胞永生化。简单地说,三见面点头/ SCID小鼠与异氟烷麻醉,放在背躺着。腹部和腹股沟区刮和清洁betadine和70%的酒精。皮肤消毒后,小中线切口(1厘米)接近第四乳头小剪刀。出腹股沟乳腺脂肪垫虹膜切除使用剪刀很仔细(鼠乳腺脂肪垫的间隙),切口封闭的强力胶。动物收到止痛剂(丁丙诺啡南卡罗来纳州)和抗生素(甲氧苄氨嘧啶磺胺类水)手术。两周后,210⁵unirradiated MSC细胞+ 210⁵辐照msc (50L在盐水)被注入了乳腺脂肪垫(人性化的脂肪垫)。人类乳腺癌细胞(210⁵细胞)+ 210⁵msc在50L胶原蛋白I型和基底膜基质混合物(3:1)注入人性化的区域。然后,老鼠可以观察肿瘤生长4 - 12周,小鼠安乐死和肿瘤形态和表达CEACAM1收集和检查。

2.3。人类乳腺癌组织植入

人类乳腺肿瘤组织对这些实验是采购符合国家卫生研究院的规定和审查和批准的机构审查委员会(IRB # 05091),希望之城医疗中心。Deindentified组织受到酶消化(胶原酶和hyalurondinase,干细胞技术)分离上皮细胞瀑样根据制造商的建议或切成小块(0.1厘米)植入到原位NOD / SCID小鼠的网站。瀑样,20 - 25人类乳腺上皮瀑样和210⁵hTert MSC在50L人工基底膜和注入到原位的NOD / SCID小鼠(每四个动物标本)。乳腺癌组织植入,三,见面点头/ SCID小鼠麻醉,手术准备和照顾表示2。短暂,小中线切口接近第四乳头了,一小块(0.1厘米)的乳腺肿瘤组织都沉浸在基底膜基质包含hTert MSC (110⁶/毫升)和放置在乳腺脂肪垫(原位网站)和皮肤切口封闭了强力胶。

2.4。组织学

异种移植收集和固定在10%磷酸缓冲福尔马林和苏木精和xyline (H和E)染色。

2.5。统计分析

组之间的统计意义分析了单向方差分析(图基的多重比较检验)。

3所示。结果

3.1。异种移植的比较增长一个原位站点有或没有新生的腺体

在模型中被Kuperwasser et al。6),新生的乳腺脂肪垫被的NOD / SCID小鼠植入前首先不灭的基质细胞植入的基质细胞和上皮mammospheres紧随其后。由于许多组织植入肿瘤在乳房脂肪垫没有之前删除的新生的乳腺13,14),我们首先调查要求新生腺切除。在我们的模型系统,我们利用野生型或CEACAM1-4S转染MCF7细胞MCF7 / CEACAM1植入作为单个细胞悬液而不是mammospheres因为我们觉得进化论mammospheres可能已经像腺形成。因此,我们感兴趣的问,在正确的环境中,单个细胞可以自己组织到稍结构没有mammosphere形成的先决条件。除了这一变化,我们跟着Kuperwasser模型在一组小鼠新生小鼠乳腺切除,接种与可行的+辐照基质细胞hTert MSC)其次是接种细胞MCF7或MCF7 / CEACAM1加上基质细胞的混合物(hTert MSC) +胶原蛋白和基底膜基质混合物(3:1)(见表1实验详细信息)。其他的动物,新生小鼠乳腺没有删除。因此,这些老鼠直接收到MCF7细胞MCF7 / CEACAM1 +的混合基质细胞+胶原蛋白我和基底膜基质(3:1)。

人类从人性化的乳腺脂肪垫异种移植模型明显的10 - 12周左右MCF7和MCF7 / CEACAM1异种移植。小鼠安乐死和皮肤解剖时,我们观察到异种移植的密切联系和新生的乳腺脂肪垫。然而,异种移植组织不同于小鼠乳腺脂肪垫,表明这两个组织都没有交集。组织学检查MCF7异种移植了实体肿瘤(低分化癌),没有任何证据表明更高的组织或分化和细胞外基质(图的小公司1(一))。相比之下,MCF7 / CEACAM1异种移植组织和分化成一个有条纹的epithelium-like结构丰富的细胞之间的细胞外基质,类似中度分化癌(图1 (b))。这些结果与以前发表的人在这个模型(8]的区别hTert /使用MSC细胞系的永生的人类乳房成纤维细胞(RMF / EG)。在异种移植的情况下,新生的乳腺没有删除,异种移植变得更加迅速,在8周内明显(数字1 (c)和1 (d))。MCF7和MCF7 / CEACAM1异种移植是相似的大小和有相同的组织学特性从人性化的乳腺脂肪垫异种移植模型。确认异种移植是起源于人类细胞,而不是汇合时用鼠标乳腺组织,我们在组织切片进行免疫组织化学与人类细胞角蛋白抗体和人类CEACAM1抗体如前所述在我们的论文8),所有异种移植人类细胞角蛋白染色阳性而只有MCF7 / CEACAM1异种移植人类CECAM1呈阳性(数据没有显示)。这些结果表明,MCF7细胞(有或没有CEACAM1)增长同样原位网站人性化乳腺脂肪垫和NOD / SCID小鼠的新生鼠乳腺垫和有相同的组织学特性。因此,至少在这个模型中,没有必要把新生的乳腺。人性化的乳腺脂肪垫模型,不仅是手术切除的乳腺所需随后两周的恢复,人性化与人类基质细胞也需要两周后10 - 12周异种移植的增长。因此,共16周需要每动物实验。相比之下,异种移植生长在原位的姑息性鼠乳腺脂肪垫只需要6 - 8周的异种移植的集合。

3.2。异种移植使用其他乳腺癌细胞系和人类乳腺癌组织

检查乳腺癌细胞系除了MCF-7是否生长在姑息性乳腺脂肪垫,我们建立了异种移植使用mda - mb - 468 (15],SUM1315 [16],DU4475 [17乳腺癌细胞系。收集异种移植8周或观察到的产物。我们发现这三个乳腺癌细胞系在4 - 6周内形成明显的肿瘤,而有趣的是,DU4475细胞系肿瘤结果只花了3 - 4周(10毫米)。这些肿瘤的组织学检查显示,DU4475和mda - mb - 468肿瘤细胞外基质和一定程度的组织(数据2 (b)和2 (c))。特别是DU4475肿瘤细胞被组织成的小集群内斯蒂模式由细胞外基质(图2 (c))。类似于DU4475异种移植,mda - mb - 468异种移植是明显的6周左右没有肿瘤细胞与细胞外基质的组织。相比之下,从SUM1315异种移植细胞增长实体肿瘤(低分化癌),而不将细胞外基质和具有良好的血管化(图2(一个))。当人类乳腺癌异种移植是孤立的植入后8周上皮瀑样或小片的乳腺肿瘤组织在NOD / SCID小鼠乳腺脂肪垫,异种移植观察发展结果。异种移植从上皮瀑样小(1 - 2毫米),高度血管化,持续产生肿瘤扩展导管原位癌(图的功能2 (d))。在乳腺肿瘤组织切片注入的情况下,异种移植大(4 - 5毫米)浸润性癌(图的功能2 (e))。这些观察表明,人类乳房组织与适当的基质环境或人类乳腺癌细胞系可以生长在一个原位NOD / SCID小鼠。

3.3。ECM和基质细胞在异种移植的影响经济增长

不明原因的一个特性的人性化乳腺脂肪垫基底膜基质和胶原蛋白模型是要求我在乳腺癌上皮细胞的移植。应该注意的是,乳房形态发生的3 d模型由李et al。3)包含基底膜基质和胶原蛋白I .事实上,胶原蛋白,我不是一个正常的细胞外基质成分(胶原IV)及其包含的移植协议是意想不到的。此外,要求基质细胞和ECM是原因不明的;如果基质细胞可以产生自己的ECM,为什么需要外源性ECM吗?来确定人工基底膜+胶原蛋白I的混合影响乳腺上皮细胞的组织和分化成腺体结构,MCF7细胞(或MCF7 / CEACAM1)没有ECM,基底膜基质单独或胶原蛋白I +人工基底膜(3:1)接种到新生的乳腺脂肪垫和基质细胞(见下表2实验详细信息)。首先,我们发现植入的细胞系没有ECM导致低的异种移植嫁接,那里只有三8个发达和异种移植肿瘤小动物(1 - 2毫米)相比,异种移植的小鼠收到ECM(图3(一个))。这些异种移植的组织学检查显示,没有高水平的组织或分化细胞MCF7 / CEACAM1很少ECM之间的细胞,而异种移植,包括ECM被组织成有条纹的上皮和ECM丰富。这些结果说明ECM异种移植的移植和分化是必要的。

接下来,我们解决问题的基质细胞的要求。MCF7 / CEACAM1异种移植的ECM包括胶原蛋白我没有基质细胞的道;然而,异种移植很小,没有分化上皮细胞或组织成有条纹的上皮细胞(图3 (c))。此外,仅在基底膜基质细胞MCF7 / CEACAM1(无基质细胞)也道,尽管异种移植的规模很小(1 - 2毫米),胶原蛋白的疏忽我从ECM混合物促进乳腺上皮细胞分化成固体腺泡的形成缺乏腔,类似正常乳腺增生性(图3 (b))。这些结果表明,夹杂物的基质细胞异种移植的扩大增长是必要的,ECM需要移植和初始分化的上皮细胞。此外,ECM的合成影响的组织和程度上皮细胞的分化,但我的包含胶原蛋白抑制上皮细胞进一步分化成腺泡腔。因此,基质细胞和ECM是人类异种移植的最佳生长和分化所必需的。基于这些结果,我们使用人工基底膜没有胶原蛋白我进行进一步的实验。

3.4。基质细胞类型对模型系统的影响

在最初的研究Kuperwasser et al。6),一个不灭的人类乳房纤维母细胞细胞系(RMF / EG)被用作基质细胞的来源。在以后的研究中,温伯格和同事(11)的影响研究骨髓间充质干细胞(msc)派生的增长和转移性乳腺癌细胞系的行为。要求和基质细胞的来源,包括他们最终对模型系统的影响,相对未开发。为了解决这个问题,我们开发了一个人类骨髓衍生MSC细胞系(hTert / MSC)和测试它能够代替的RMF / EG细胞用于原始模型。hTert / MSC细胞系的形态是典型的基质细胞(图4 )。替换的一个主要推动力hTert MSC细胞RMF / EG细胞是,他们不需要添加辐照基质细胞,模型的要求是无法解释Kuperwsser et al。6]。

hTert / MSC (hTert / MSC MCF7 / CEACAM1比例:1:4 - 1:1)或不灭的人类乳房成纤维细胞(RMF /如MCF-7或MCF7 / CEACAM1比例:1:1)在人工基底膜(没有胶原蛋白我)植入乳腺脂肪垫(之前不人性化)(见表4实验条件)。hTert msc(比率)促进上皮细胞在异种移植的增长;然而,异种移植从1:1 hTert MSC: MCF7 / CEACAM1细胞比有更多的细胞外基质之间导管增生的腺体结构,外观(数字5(一个)和5 (b))。值得注意的是,异种移植MSC / hTert:上皮的比例1:4降低了ECM和上皮细胞分化成导管上皮细胞,这表明的比率应该使用1。尽管人类乳房纤维母细胞(RMF / EG)含有异种移植增长速度(明显的在4周内)和比异种移植hTert / msc(10毫米和5毫米),组织学检查发现成纤维细胞的增生和缺少上皮细胞的增殖,MCF7和MCF7 / CEACAM1(数字5 (c)和5 (d))。重要的是,植入RMF /如永生的人类乳房纤维母细胞本身也导致纤维肉瘤的形成,但这并没有发生hTert / msc(数据未显示)。

3.5。乳腺的生理状态对异种移植的影响

小鼠乳腺保持生理的状态,直到怀孕。一旦动物怀孕腺迅速扩大规模,增加管道的数量和肺泡结构(18]。在人类中,乳房比老鼠更发达的后青春期,提高的可能性,主要功能之间的差异很可能小鼠和人类青春期后的乳腺。自腺的生理状态将影响移植异种移植的发展(19,20.),它是重要的怀孕的老鼠来测试我们的最终模型作为人类乳腺青春期后的代理。了解怀孕对异种移植的影响形成和分化,细胞MCF7 / CEACAM1连同hTert MSC在基底膜基质移植到腹股沟乳腺八周大的NOD / SCID小鼠;老鼠立即交配,然后收集异种移植后断奶的小狗。这些异种移植血管和组织学检查发现形成分化良好型的腺腔中部(数字6(一)和6 (b))。这些结果表明体内的生理状态系统的重要性异种移植的分化。

总之,我们考察了基质细胞的作用和ECM在人类异种移植生长和乳腺癌上皮细胞分化。我们发现新生的乳腺切除和人性化是没有必要为人类异种移植的生长和分化,MSC和ECM所需的生长和移植异种移植。ECM成分也是很重要的乳腺上皮细胞的分化和组织我的胶原蛋白抑制分化的上皮细胞(总结表3)。

4所示。讨论

尽管已经取得了相当大的进展的发展在体外人类乳腺形态发生的三维模型,三维模型缺乏活体动物的生理环境,包括功能,如细胞免疫系统和血管生成的组件,或从内分泌腺激素影响,卵巢和乳腺本身。最近开发模型的Kuperwasser NOD / SCID小鼠的乳腺“人性化”是一个重要的一步允许人类mammospheres在更多的生理环境的增长(6]。然而,这个模型需要完整的新生的乳腺,需要很长时间建立“人性化”腺radiation-killed和live-immortalized基质细胞,包括基底膜基质和I型胶原蛋白,并利用mammospheres而不是单细胞悬浮体建立新的腺。我们已经检查了这些特性,开发出一种更简化的模型,大大异种移植的发展速度(4 - 8周和16周)。我们的改进模型的其他特性包括新生小鼠乳腺的保留,无需等待重新乳腺脂肪垫的人工基质细胞。我们发现没有证据的异种移植成长为实体肿瘤comingling新生小鼠乳腺。当皮肤剥离增长4 - 8周结束时,我们发现异种移植坚持内表面,而组织学分析显示不同程度的组织组织的存在与否取决于基质细胞和基底膜基质。重要的是,尽管包含矩阵出现抑制的I型胶原蛋白增生的RMF /如基质细胞,使用MSC细胞系极其需要胶原蛋白我和导致主要由上皮细胞异种移植。尽管如此,基质细胞和基底膜基质都需要适当的建立异种移植,强调ECM的关键作用乳腺腺体组织的发展。

MCF7细胞弱致瘤的,不生长在皮下移植除非老鼠用雌激素治疗(21]。然而,这个细胞株可以一个有吸引力的模型为研究乳腺癌基因如CEACAM1因为补充可能会导致回归更为正常的表型(7,8]。例如,乳腺腺体上皮分化的程度取决于CEACAM1等关键形态因子的表达(8]。MCF产生实体肿瘤细胞缺乏CEACAM1总是在最初的“人性化”乳腺脂肪垫Kuperwasser et al。6或者在这里描述的改进模型。相比之下,MCF7细胞转染CEACAM1产生有条纹的或单层上皮表,根据生理环境。戏剧性的多层上皮表转换成单层乳腺需要怀孕,强调在发展中乳腺激素状态的作用。结果乳腺周围ECM表明ECM生产由基质细胞也依赖于组织的生理状态。妊娠的老鼠,减少ECM是生产和多层乳腺上皮细胞,这表明一个通信项目之间存在的上皮细胞和基质细胞是依赖于上下文的。上下文可能包括其他激素、垂体催乳激素的生产的怀孕的老鼠。值得注意的是,垂体提取是一个重要的组成部分在体外三维模型乳房形态发生的3,4]。

模型的扩展到其他乳腺癌细胞系以及新鲜的乳腺癌组织也证明。在每种情况下,异种移植发达neo-vascularization,表明他们保留血管生成编程。因此,模型具有一般实用程序产生大量的组织进行进一步分析。

总之,改善在活的有机体内模型允许单细胞悬浮体的扩张的乳腺上皮细胞新生小鼠乳腺成4 - 8周内明显的异种移植。这个模型使用更少的上皮细胞数(020万/异种移植)和允许他们建立、增殖,并分化的原位网站,模仿乳腺发育和形态发生。模型需要人工基底膜和msc移植,但不需要radiation-killed基质细胞和胶原蛋白,从而防止不良生长的基质细胞纤维肉瘤。改进的模型允许观察异种移植的进一步增长在怀孕的存在与否,从而提供额外的洞察荷尔蒙变化对异种移植发展的影响。值得注意的是,我们的模型优化研究乳腺肿瘤和乳腺形态发生。这个模型将允许我们评估的影响增加淋巴细胞在炎症条件下模拟慢性炎症的效果对人类乳腺细胞分化或测试各种肿瘤治疗发展的影响。

确认

这项研究是由国立卫生研究院资助。CA84202。作者要感谢Richard Ermel博士对他的支持,博士Deepti Chadalavada左治亚对他们的帮助和特蕾西达布斯教授采集在动物实验中,克里斯汀•陈细胞系,索非亚Loera博士沙龙Wilczynski组织病理学,乔治博士Somlo提供新鲜的乳房外植体。

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