纳米细胞外囊泡在阿尔茨海默病诊断和治疗分析

文摘

诊断化验,杠杆bloodborne neuron-derived(神经元)纳米细胞外囊泡(nsEVs)作为“窗口进入大脑”可以预测阿尔茨海默病(AD)的发病率在发病之前许多年。除了诊断,bloodborne神经元nsEVs分析可能会通过揭示大量转化影响AD病理机制;这样的知识启发新的药物靶点和可能导致新的治疗方法。潜力建立三维nsEV分析方法描述高纯度bloodborne nsEV种群的方法浓缩,细胞起源、和蛋白质或RNA丰富维能给熊带来这一承诺的收益率nsEV“组学”的数据集,发现新的广告生物标记,使广告治疗的发展。综述我们提供的调查的现状和新进展领域的地平线上的神经元nsEV分析。这个调查是辅以讨论潜在的翻译这些神经元nsEV分析广告临床诊断应用程序和药物开发。

1。介绍

Bloodborne neuron-derived(神经元)纳米细胞外囊泡(nsEVs)显示巨大的潜力,“窗户进入大脑”,启发中枢神经系统(CNS) disorder-associated大脑生物化学和细胞间通讯的变化(1- - - - - -7]。综述了当前状态的神经元nsEV分析也揭示了相对未开发的机会利用神经元的上下文中nsEV分析识别新方法治疗广告。这些机会可能会被进一步发展意识到现有的协议bloodborne nsEV隔离实现高纯度浓缩铀的神经元nsEVs,使“组学”分析nsEV蛋白质和RNA组分;这样的组学概要文件可以增加我们对大脑的变化的理解生物化学和细胞间信号基础和反映AD病理和提供一个三维(3 d) nsEV概要文件。这些知识可能会通过促进一个重要的临床影响小说广告药物靶点的识别和开发新的分子和/或广告预防和治疗模式。

2。定义特征的nsEVs

没有公认的标准分类nsEVs。缺乏标准的分类会产生模糊性在解释和沟通nsEV-related实验的结果。简单的分类系统将nsEVs定义为细胞衍生囊泡与亚微米直径和组分为两类:液和外皮层。

液中制造多泡体(多功能车辆总线),胞质囊泡的直径250 - 1000 nm范围(8,9),是由内在的萌芽的核内体(10]。外来体直径范围从50到200海里(11)及其表面富含tetraspanin标记蛋白质CD9、CD63,和研究,以及热休克蛋白质如Hsp70 (12,13]。液携带Tsg101室内水平高和阿历克斯,两种蛋白质组成的运输所需的Endosomal排序复合物(ESCRT)机械参与细胞内囊泡的形成过程11]。相反,外皮层与囊泡直径从100纳米到1微米,芽细胞从等离子体膜。

其他分类外皮层的数量有些模棱两可的子类:脱落囊泡、微泡,exosome-like囊泡,纳米粒子,微粒子,oncosomes [11]。虽然一直相信tetraspanin蛋白质是exosome-specific表面标记最近的分析显示,tetraspanins出现在两液的表面和外皮层;目前没有区分这两个类的表面标记蛋白质nsEVs [14- - - - - -16]。

nsEVs直径在100 nm和200 nm液或外皮层;给定的泡类别nsEV是分类是由nsEV是否形成在一个多功能车辆总线或出芽细胞的质膜。前面的句子框架在一个假设的意义上,因为如上建议的评论关于tetraspanins常见液和外皮层,没有现有的分析方法,允许一个确定一个给定nsEV隔绝血液内形成多功能车辆总线或从质膜而萌芽的产物。

nsEVs封装核酸,主要是小分子核糖核酸(microrna)和信使rna (mrna)。nsEVs也功能完整的膜蛋白,蛋白质共价结合nsEV膜,蛋白质共价与nsEV膜有关,和蛋白质,占领nsEV室内卷。nsEVs的主要功能是将信号从发送者到接收者的细胞。nsEVs来自发送方的细胞可以与细胞膜融合并释放其内容到受体细胞的细胞质(17)或其内容被贩卖后在不同的细胞内的隔间受体细胞吞噬作用[18]。nsEV-delivered信号是由膜蛋白、室内蛋白质,microrna抑制转录靶向受体细胞的基因,或mrna,提升翻译mRNA-encoded蛋白的受体细胞。

鉴于渴望利用bloodborne nsEV分析启蒙AD-associated变化和大脑的生物化学和细胞间信号传导过程,我们注意观察到神经元nsEVs从中枢神经系统迁移到血液在动物实验5]。类似的神经元nsEV迁徙现象的存在在人类血液样本广告支持的诊断试验结果(1- - - - - -5章节中讨论)4。

3所示。nsEV分析:现状和新进展

bloodborne神经元nsEV分析的预测能力说明了生物标志物验证葛佐和同事的研究,准确地预测广告开始前十年临床诊断(1- - - - - -4),产生了相当大的兴趣在广告研究社区。这里我们定义的状态艺术bloodborne nsEV分析方法通过描述的方法利用葛佐广告生物标志物的量化过程。除了我们讨论潜在的3 d nsEV分析进一步构建葛佐的方法,充分意识到的潜在影响nsEV特征在广告临床诊断和药物研发平台。

的第一步葛佐nsEV广告生物指标量化过程的化学沉淀(CP)隔离nsEVs从等离子体。nsEV降水后,神经元nsEVs从散装nsEV丰富人口使用streptavidin-coated琼脂糖珠含有生物素化的anti-neuronal标记蛋白质(CD171) Abs。最后,nsEVs受到溶解条件和生物标志物蛋白nsEV溶解产物被ELISA量化。图的笛卡儿坐标系统1作为一个有用的援助在定义的概念3 d nsEV分析;下面我们提供这样一个定义通过进一步讨论的步骤组成葛佐生物指标量化过程的示意图。

如图1,每个nsEV分析维度轴功能可以定义多个点给定nsEV表征实验。nsEV浓缩方法的选择,CP,尺寸排阻色谱(SEC)、超速离心法(加州大学),或免疫沉淀反应(IP) (20.- - - - - -23),确定隔离轴坐标的方法。葛佐的作品中,CP标志着点隔离轴坐标的方法。Ab用于IP的特异性nsEVs源自一个感兴趣的细胞类型,例如,神经元,定义了细胞类型轴坐标。葛佐的实验中,利用琼脂糖珠装满anti-CD171 Abs nsEV IP将细胞类型轴坐标定义为神经元。

第三nsEV分析维度、生物丰度与其他两个维度的不同之处在于,生物标志物,因此生物丰度轴位置,是由nsEV组成。研究者选择的生物标志物(s)量化,从而定义了生物标志物丰富轴标签(s)。作为讨论的部分4蛋白质,葛佐和同事量化一组十提出与发病有关和/或广告的发展。无论研究者量化几个生物标记,如葛佐et al。”验证研究,或量化数百名候选人在组学分析,生物标记的数量nsEV表型坐标系统将匹配量化生物物种的数量。

4所示。转化潜在nsEVs分析广告诊断和药物开发

领域的勘探机会利用bloodborne神经元nsEV组学分析广告对药物分子生物标志物的发现和治疗方法的发展框架,讨论现有的神经元nsEV广告生物标记验证和服务发现文学;后者尤其相关利用神经元nsEV分析小说的药物靶点的识别和建立新的治疗模式。在这个讨论中我们定义nsEV生物标记蛋白质或核酸nsEV组分丰度不同病变相对于正常的受试者。这个定义包含nsEV-associated分子相对丰度变化之前,临床表现疾病症状,从而可以预测疾病的发病以及分子的丰度变化的函数疾病进展或降级由于积极的治疗反应。

我们开始我们的讨论的文献nsEV广告相关的生物标志物验证的回顾葛佐等人的作品。1- - - - - -4),注意的是,除了准确预测广告出现,葛佐等人发现一个令人印象深刻的是各种各样的蛋白质,也就是说,转录因子(3),分子伴侣’(2),β-淀粉样蛋白1-42 (Aβ₄₂)[1],磷酸化τ[1),而磷酸化胰岛素受体底物(4),可以作为预测生物标志物。也值得注意的验证成果的伞下神经元nsEV成分作为中枢神经系统疾病生物标志物,α-突触核蛋白(水平αsyn)由bloodborne神经元nsEVs已经观察到与PD严重程度(5]。综上所述,上述的结果表明,神经元nsEV bloodborne分析可以作为临床诊断的基础分析,可以预测和/或监控的发生中枢神经系统疾病的进展或降级。

bloodborne神经元nsEV隔离和分析方法用于葛佐等的工作需要更多的样品处理步骤比通常与临床诊断化验。然而,可能适应这些方法或使用其他nsEV生物测量技术可能导致临床适用的广告诊断化验。这样的一个替代方法是ExoScreen [19),一个发光AlphaLISA assay-based方法量化nsEV生物标志物在血浆(数字2和3)。ExoScreen化验有吸引力对临床诊断应用程序,因为他们只需要个位数微升的血液,兼容平行量化的多个生物标志物在多个等离子体样品,并且可以在几个小时内完成。

如图2,ExoScreen化验可以允许量化生物标志物的兴趣,例如,一个β₄₂表面上的总人口bloodborne nsEVs或者只bloodborne神经元nsEVs;这方面的数据读出由Abs决定装上相应的供体和受体AlphaLISA珠子用于给定的试验。我们发现,ExoScreen可以用来量化总量的相对水平和神经nsEVs等离子(图3)。这个结果进一步表明,ExoScreen方法开发能够量化的广告生物标志物蛋白bloodborne神经元nsEVs的表面。

虽然已取得相当大的进展在验证神经nsEV生物标志物对AD的诊断应用(1- - - - - -4脚本的),发现神经元nsEV广告领域的生物标记药物目标识别和治疗发展仍是不成文的。这样的发现可能是通过组学方法描述神经元nsEV种群丰富血浆或血清。蛋白质组学方法,比如串联质谱分析(MS / MS) [24),生成abundance-ranked nsEV-associated蛋白质存在于列表数量超过蛋白质组学分析方法检测极限,通常个位数的皮摩尔。比较等级次序正常蛋白质列表和广告主题nsEVs使新的nsEV蛋白质广告生物标记的识别。同样,下一代核糖核酸测序技术,如Illumina公司(6),产生全球,排序大量资料对bloodborne神经元nsEV microrna和/或mrna。使用这些资料来比较在广告和正常神经元nsEVs rna水平,分别可以帮助阐明小说广告生物标志物。

对的途径omics-based nsEV生物标志物的发现可以发现新的药物靶点和治疗方法治疗广告,我们首先注意的是蛋白质和核酸中包含nsEVs,以及与nsEV膜相关蛋白共价和共价,反映的内容细胞质和/或nsEV母细胞的质膜(11]。因此,AD-associated神经分子组成的变化可以反映在广告神经元nsEV组成和成分差异nsEVs正常的话题。推而广之,神经元之间的相关性nsEV组成和开发和/或临床测量的倾向严重的广告可以告诉AD-associated神经生物化学的变化。

神经生物化学的变化可能在广告中发挥决定性作用或者是疾病进展的反思。无论哪种情况下,这样的知识AD-associated细胞成分的改变可以加强一个人的见解关于如何改变细胞内分子环境爆发之前或之后的广告;这种增强洞察力可能会增加一个广告的理解机制,因此可以启发小说药物靶点或广告的方法治疗。

的说明如何使用知识,以上提到的过程获得通过分子水平分析bloodborne神经元nsEVs,关于AD-associated神经分子组成的变化可以应用在发展新的治疗策略的广告可以来自葛佐et al。ubiquitinylated蛋白质水平的研究进行内部bloodborne神经元nsEVs [2]。葛佐等人发现ubiquitinylated蛋白质,泛素通常用来标记蛋白溶酶体的降解,在bloodborne更丰富的神经nsEVs比nsEVs孤立隔绝的广告主题从正常的人。这个观察意味着ubiquitinylated蛋白质可能出现在高位中枢神经系统神经元内的广告主题和也表明神经溶酶体或溶酶体的功能障碍贩运过程可能导致AD病理。这个断定病因作用广告带来了调制的特异表达蛋白质降解溶酶体功能和ubiquitinylated贩卖蛋白质在中枢神经系统内作为潜在的治疗策略的广告。

神经元nsEV分析也可以照亮AD病理的基础由于nsEVs扮演主持人的细胞间的沟通。改变神经元nsEV信号分子水平,特别是rna,对应的广告可以揭示改变细胞间通信所引起或导致AD发病和/或发展。因此,识别分子内或nsEV表面与丰度变化广告主题促进制定有关假设的细胞间信号和AD病理改变之间的联系。了解这些差异有助于阐明广告病理发病机制和进展;这样的见解可以启用新药物靶点的识别和福斯特小说的发展广告治疗方案。

刘和他的同事们的工作25提供上下文有关的知识如何AD-associated nsEV信号分子水平变化可以启发新的治疗策略。刘等人发现mir - 193 b的水平,这被认为是降低淀粉样前体蛋白(APP)表达,减少在bloodborne nsEVs隔绝广告对象相对于正常的人。这一发现激励考虑药物carrier-encapsulated CNS-targeted [26mir - 193 b)作为候选人代理广告疗法。

蛋白质组和转录组分析的可行性bloodborne nsEV中枢神经系统障碍已经建立了生物标志物的发现。汤姆林森et al。24)执行MS / MS分析总nsEV人口从血清池由多个标本来自各自的正常,PD,肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)科目。八十二的1000多nsEV PD主题池中蛋白质正常话题池中的缺席而PD池的54个蛋白质ALS池中的缺席。虽然广告标本不在,这项工作提供了先例的效用bloodborne nsEV蛋白质组学分析广告生物标志物的发现。

类似地,两个独立bloodborne nsEV候选人广告microrna发现努力已经取得了令人鼓舞的结果。程等。6]孤立总nsEVs公元十六个人,36个正常血清标本。深度测序的个人标本确认了超过1400个microrna microrna的提取;16都显著增加或减少广告nsEVs相对正常。这个microrna的面板预测广告的敏感性为77%。Lugli和同事(7)执行microrna的深度测序nsEVs隔绝35正常血浆样品和广告主题,分别。这一分析确定465独特的microrna;这个数字的区别和超过1400个microrna报道的结果数据集包含microrna的丰度阈值的差异。机器学习算法确定了七个microrna中差异表达广告主题nsEVs;这个小组预测主题疾病状态的敏感性大于80%。

只有一个microrna, mir - 342 - 3 - p,是上面的microrna的面板之间共享。很可能使用不同的nsEV隔离协议导致缺乏重叠的两个预测microrna的面板。不管这些差异,这些研究的结果证明利用转录组神经元的合理性nsEV广告生物标志物的发现;这两个nsEV microrna的研究和上面的蛋白质组学研究建立基础开发3 d神经元nsEV组学分析方法,产生高度可翻译bloodborne神经元nsEV蛋白质和RNA的概要文件。

5。Bloodborne神经元nsEVs隔离

修改总bloodborne nsEV组学分析协议上面使用,使bloodborne神经元nsEV剖析广告生物标志物发现需要解决的几个技术挑战。在这和随后的部分我们确定这些挑战并讨论进展和新方法解决它们。

我们开始讨论这些挑战通过回顾bloodborne nsEV隔离程序。nsEVs可以丰富从血浆或血清使用上面提到的任何方法:秒,加州大学,CP或IP (20.- - - - - -23]。证交会、加州大学和CP收益率nsEV制剂,含有高水平的污染物包括免疫球蛋白g,白蛋白,脂蛋白复合物,蛋白质聚集或低聚物,和细胞碎片20.,21]。这种污染物的存在可能会导致组学分析来识别假阳性神经元nsEV广告生物标志物由于AD-related差异蛋白质或microrna的丰度被归因于蛋白质的水平或microrna与污染相关bloodborne实体而不是那些神经元nsEVs对应。另外,如果给定的蛋白质或microrna的绝对数量由bloodborne污染物的数量远远大于相同的蛋白质或microrna由神经元nsEVs由此产生的高signal-to-background比率可能导致神经nsEV AD-associated差异蛋白质或microrna的丰度去未被发现。

可能会发现上面的概念,一个假阳性神经元nsEV广告有点自相矛盾的生物标志物;如果方法量化等离子体生物标志物准确区分AD和正常人那么看起来,该方法识别真正的优点。指出,这是一个显而易见的悖论解决的“假”形容词适用于分类器前的“神经nsEV广告生物标志物。“如果一个bloodborne生物标记区分广告和正常人由于丰度差异与污染相关bloodborne实体,而不是神经nsEVs,那么生物标志物是假阳性的上下文中准确地反映bloodborne神经细胞的分子组成nsEVs广告相对于正常人。虽然假阳性nsEV广告生物标志物诊断应用程序可能是有用的,他们的AD-associated神经分子成分或细胞间信号的变化过程可能不存在使他们不适合作为确定药物靶点或发展战略基地广告疗法。

我们返回到之前的讨论bloodborne nsEV浓缩方法和注意,在寻求改进的纯度nsEV人群孤立使用上述指出浓缩过程我们发现nsEV IP方法采用three-micron磁性粒子直径(Dynabeads,生活技术)含有抗体(Abs)特定蛋白质nsEV表面产生高纯度(图nsEV准备4)。这些IP方法是极其多才多艺;streptavidin-coated Dynabeads可以加载任何nsEV表面蛋白与生物素化的Abs特定的兴趣。这种多功能性,加上丰富的高纯度nsEV人口,地方Dynabeads-based nsEV IP的核心我们的方法对3 d bloodborne神经元nsEV分析。

人口的高纯度Dynabeads-enriched nsEV启用的活动性影响因各自的nsEV和Dynabeads外壳表面蛋白的多个副本和nsEV表面此种Abs。这种热望效应导致near-covalent nsEV-Dynabeads交互,允许一个严格执行多个高,例如,pH值低于3,清洗步骤Dynabeads-plasma孵化后不会引起nsEV-Dynabeads离解。获得高纯度nsEV清洗条件废除弱得多的美德Dynabeads和污染物之间的相互作用是非吸附在孵化Dynabeads表面等离子体。Dynabeads IP被温和的离心之前,例如,12000 rcf 20分钟,和通过血浆或血清通过离心或注射器过滤器定义的孔隙大小,如0.5微米polyethersulfone (PES)。这些上游步骤确保只有等离子体成分呈现nsEV感兴趣的表面蛋白,具有直径低于过滤期间丰富孔隙大小的IP。这样Dynabeads浓缩nsEVs可能是有用的在未来的3 d nsEV分析。

有机溶剂沉淀蛋白质(PROSPR)是一个额外的外来体浓缩方法,能找到未来的效用在3 d nsEV分析(27]。PROSPR方法采用蛋白质沉淀步骤中血浆被离心去除全细胞和其他大型机构与冰冷的丙酮混合。这个沉淀步骤结果形成的固体颗粒,包含一个可观的白蛋白和其他污染的蛋白质存在于初始等离子体。蛋白质沉淀后,等离子nsEVs留在丙酮/等离子体混合物上层清液,可以交换到一个水缓冲使用离心microconcentrator单位促进组织的后续Dynabeads浓缩浆nsEV亚种。

PROSPR方法最终证明产量总等离子体nsEV制剂含有低水平的血浆蛋白质污染物比总nsEV种群丰富通过加州大学(27]。相比之下,新兴市场的分析使用PROSPR nsEV种群丰富,迄今已报告离开歧义对分数的丰富nsEVs携带tetraspanin标记(27]。PROSPR丙酮沉淀步骤的效率在去除细胞碎片和大从血浆脂蛋白复合物上层清液可能比方法的去除效率较低的等离子体污染物,如白蛋白、免疫球蛋白g nsEVs相比小得多。更确切量化tetraspanin-positive囊泡的分数PROSPR-isolated nsEV人口,可能使用EM-based方法部分中描述的类似7,将提供一个增加的自信程度的同质性PROSPR-enriched nsEV人口,从而成为一个有价值的引入的上下文中使用PROSPR方法3 d nsEV分析。

6。两步浓缩的Bloodborne nsEVs组学分析

蛋白质组学(5和转录组6,7]bloodborne nsEV中枢神经系统疾病生物标志物发现努力迄今报告采用单步执行程序,例如,加州大学或IP,丰富nsEVs后续蛋白质或RNA提取和组学分析。组学分析,采用串行Dynabeads IP过程可能会增加一个人的能力来确定神经元nsEV广告相对于生物标记物组学特征基于单步nsEV浓缩。内的低表示神经元nsEVs总bloodborne nsEV人口(1)可能导致神经nsEV AD-associated差异组成丰度蒙面如果nonneuronal bloodborne nsEV水平的这些成分高和不变的广告和正常人。Dynabeads浓缩nsEVs基于神经元表面标记蛋白质,如CD56 CD171,可以防止外围nsEV(注意,CD56——或者CD171-based IP丰富nsEVs来源于周边和中枢神经系统神经元)和non-nsEV选民施加这掩蔽效应。

浓缩的神经元nsEVs组学分析需要隔离与Abs识别不同的IP nsEV表面标记蛋白质如anti-CD9 anti-CD63或anti-CD81。Ab-loaded Dynabeads或ExoCap nsEV IP包(JSR微,Inc .),包括一个洗脱缓冲,这些色nsEV-binding Abs装上装备的磁性粒子,类似于Dynabeads,可用于IP。三分钟的孵化的磁性粒子洗脱缓冲之后,与磷酸缓冲盐溶液稀释,降低蛋白质变性率从磁性粒子的能级nsEVs不会引发裂解。

串行Dynabeads IP也可以通过淋洗anti-nsEV Abs磁性粒子。CELLection Dynabeads表面共价链接到anti-mouse或基于dna的间隔臂anti-biotin Abs。Murine-derived或生物素化的anti-nsEV表面标记蛋白质Abs可以加载到CELLection Dynabeads由于关联与Abs耦合CELLection Dynabeads。等离子体孵化和洗涤后,添加DNAse-containing反应缓冲释放Ab-nsEV Dynabeads复合物。Ab-nsEV复杂洗脱也可以通过使用机油包裹连接器(28)共价夫妇Dynabeads anti-nsEV Abs表面标记蛋白质。

7所示。量化的同质性nsEV准备

开展神经nsEVs使用的IP Dynabeads装满anti-neuronal表面标记Abs并不构成elution-associated挑战[5];结合神经nsEVs细胞溶解可以隔离的蛋白质和/或RNA为下游组学分析。这些蛋白质和/或RNA的隔离池应辅以评估分数的丰富nsEVs neuron-derived;这样的评估是必要的,以确保蛋白质和/或RNA池特征在组学研究实际上是完全或主要来自神经nsEVs。

准确地评估分数的丰富nsEVs neuron-derived是一个有点复杂的追求。理想的评估方法将允许一个同时确认nsEV和细胞类型个人nsEVs IP表面标记蛋白质。intraexosomal标记蛋白的免疫印迹量化和神经细胞表面标记蛋白质被用来评估“神经外来体”的同质性人群孤立的IP (5)但不启发nsEV和神经元标记蛋白是否与相同的囊泡;验证这种colocalization需要nsEV成像。

高nsEV同质性对nsEV和细胞类型标记蛋白质预计Dynabeads IP。因此,平行电子显微镜(EM)实验特色nanogold-conjugated Ab标签(5各自的nsEV和细胞表面标记允许精确估计的百分比积极nsEVs两倍。考虑示例场景,在该场景中,90%的成像nsEVs CD9 (nsEV标记)积极和75%是CD56(神经元标记)阳性。在这种情况下,在67.5%和75%之间的孤立nsEVs双是积极的。相对范围,上限/下限,估计双积极nsEV百分比显著增加与减少nsEV同质性。因此,这种估计方法独特启用的高纯度铀浓缩技术,如通过Dynabeads IP。

8。nsEV组学分析需求和技术因素

有几个重要的技术因素生成nsEV组学数据集,使3 d nsEV分析如图1,作为一个扩张获得总等离子体nsEV组学数据;标本量需求这个列表的顶部。据报道,神经nsEVs占大约15%的总bloodborne nsEV人口(1]。在此基础上估计,标本量用于组学研究之前,确保足够的神经nsEVs低丰度候选生物标志物检测需要多为个人标本30毫升血浆蛋白质组分析(18)和至少3毫升的等离子体的转录组分析(6,7]。很难获得30毫升血浆从单一主题可能需要使用混合标本3 d进行蛋白质组学分析。考虑到等离子体nsEV浓度在不同样品(29日),使用nsEV量化方法,比如NanoSight计数或商业nsEV表面标记ELISA,可以帮助确保平等代表权的样本包括样品池。我们也注意到Abs必须共价耦合神经元nsEV浓缩Dynabeads避免离解的生物素化的Abs streptavidin-coated Dynabeads在蛋白质提取分离Abs污染nsEV蛋白质提取,从而获得妥协的质量数据在MS / MS组学分析nsEV蛋白质成分。

9。下一代nsEV分析的工具

获得神经nsEV组学数据集使用上面描述的方法将为组学分析提供更大的转化潜力。下一代分析可以通过两个新兴的发展领域:微流控设备那种bloodborne神经元nsEV直接从等离子体基于亚种群丰度的多个nsEV表面标记和工程Abs或寡核苷酸适配子结合的抗原表位的独家广告神经元nsEV外观。

有两个主要的障碍,这源于nsEV 10卷⁶倍低于细胞数量,个人nsEVs流仪排序。首先,nsEV流量必须严格控制,防止“群集”,这种现象导致组nsEVs作为单一荧光检测事件,导致封装内的多个nsEVs排序液体滴(30.]。第二,荧光Ab-labeled nsEV荧光相对较低的自发荧光标记nsEVs和血浆成分如细胞碎片和蛋白质聚合。由此产生的低信噪比和群集的影响结合排除排序nsEVs直接使用当代从等离子体流血细胞计数器;最先进的plasma-borne nsEV流式细胞术协议迄今报告只启用nsEV分析(31日]。这些血细胞计数方法的效用是进一步限制他们不允许nsEVs有直径的检测不到100海里,他们不符合荧光Ab的标签plasma-borne nsEVs;分析了nsEVs基于只有大小和形态特征。

进一步发展现有标准流血细胞计数器可以让群集和自发荧光问题被克服。关于群集,脉冲激光激活细胞分选仪(温馨的)微流体设备(32实现粒子流量精确控制和可以封装排序粒子在液体量少于100 picoliters(图5)。Time-gated流血细胞计数器(33,34],它探测到长寿光子lanthanide-conjugated Abs的排放,可以通过量化的长期改善nsEV检测信噪比镧系元素排放,同时过滤掉短暂的自发荧光的排放。混合工具集成温馨的流体和time-gated光学个人nsEVs可以有效的分拣设备。

与转译后的修改,如糖化蛋白质,糖基化,硝化(35- - - - - -37可以去未被发现或被误认为MS / MS蛋白质组学分析。此外,MS / MS蛋白质组学不能区分不同的蛋白质构象亚型或低聚物。这些限制激励增加面板的候选人的广告使用MS / MS蛋白质组学的生物标志物识别执行nsEV探针(Abs和/或寡核苷酸适配子)图书馆屏幕孤立探针结合抗原表位独特或高纯度广告bloodborne神经元nsEVs表面。这种探针可用于免疫沉淀反应的蛋白质携带AD-specific的抗原表位序列反褶积(38,39]。

Antigen-loaded Dynabeads通常用于探测库筛选[40]。因此,执行多次交替正面和负面的调查图书馆屏幕(39,41)与各自的正常和广告bloodborne神经元nsEV-loaded Dynabeads应该产量调查,免疫沉淀反应nsEV表面蛋白生物标记抗原表位,现在广告。

多色nsEV血细胞计数与广告的各种组合nsEV-specific探测器和/或商业Abs对广告nsEV生物标志物表面蛋白被蛋白质组分析可以解决重要的问题是否整体bloodborne神经元nsEV人口是由不同的亚种群的不同组合AD-specific表面蛋白和/或抗原表位。排序nsEV亚种群将有利于下游组学和/或个人广告生物标志物分析可能启发AD-associated改变神经元的细胞间异质性存在的分子组成和神经元nsEVs携带不同的组的信号分子。这种异质性的知识和不同的细胞间通讯方式可以启发不同广告病理机制之间的相互作用,从而成为一个有价值的广告药物目标识别和治疗发展的促进者。

对即将到来的发展领域的神经nsEV诊断临床应用,硬件复杂的实验室操作小型化的最新进展表明,未来可能将实质性的进步条件构建便携式设备的医疗点量化神经nsEV的生物标记。关于最近进展的细节,蛋白质芯片多路复用荧光ELISA检测(42)和准确的针刺量血液样本艾滋病毒诊断(43)现在都可以使用手持兼容智能手机的周边设备。考虑到这些令人印象深刻的成就,上述设想开发的便携式仪器量化bloodborne神经元nsEV生物标记似乎是一个现实的目标。

10。结论

神经元nsEV隔离和分析方法的进步,利用神经元nsEVs可以提供“windows进入大脑“使用非侵入性诊断化验,只需要每毫升血液在医生办公室的常规检查,获得量化的阿尔茨海默病(AD)在nsEVs生物标志物的蛋白质。这样的分析可以使快速诊断中枢神经系统疾病和促进发展的个性化治疗方案。持续增加的公共和私人资金nsEV-focused研究应该使这一目标实现后,及时和加速发展的下一代nsEV分析提供一个更准确的分析广告在等离子体生物标志物。虽然需要时间,人类基因组序列的情况下,翻译omics-derived广告从实验到临床生物标志物的发现,很明显,生物医学研究的日益趋同将增加翻译的相对速率。因此,预计我们只是几年,而不是数十年,远离看到药物和/或治疗模式灵感来自3 d bloodborne神经元nsEV分析影响临床治疗这种毁灭性的疾病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

所有作者都促成了本文的写作和编辑,支持出版的内容包含在其中。流式细胞仪由皮特Heinzelman收集的数据;ExoScreen收集的数据是蒂娜Bilousova耶稣平原。

确认

这项工作得到了加州大学洛杉矶分校神经学部门,玛丽·s·伊斯顿阿尔茨海默氏症研究中心和国家卫生研究院格兰特AG041456。作者感谢博士孝宏Ochiya研究所、国家癌症中心的东京,日本,在ExoScreen分析上的合作。

引用

1. m . s . Fiandaca d . Kapogiannis m . Mapstone et al .,“识别的临床前阿尔茨海默病致病蛋白的神经得到血液:病例对照研究,“阿尔茨海默氏症和老年痴呆症,11卷,不。6,600 - 607年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. e . j .葛佐a拳击手,j·b·施瓦茨et al .,“改变溶酶体蛋白在临床前阿尔茨海默病neural-derived等离子液中,“神经学,卷85,不。1,40-47,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. e . j .葛佐a拳击手,j·b·施瓦茨et al .,”神经exosomal低水平的细胞生存因子在阿尔茨海默氏症,”《神经病学临床和转化,卷2,不。7,769 - 773年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. d . Kapogiannis a拳击手,j·b·施瓦茨et al .,“机能失调磷酸化1型neural-derived血液中胰岛素受体底物液的临床前阿尔茨海默氏症,”美国实验生物学学会联合会杂志卷,29号2、589 - 596年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. t·j·m·施c . Liu库克et al .,“等离子exosomalα-核蛋白可能CNS-derived和增加在帕金森病,”Acta Neuropathologica,卷128,不。5,639 - 650年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. j·d·l . Cheng Doecke r . a Sharples et al .,“预后与阿尔茨海默病相关血清microrna标志物显示一致性与神经心理学和神经影像学评估,”《分子精神病学》,20卷,不。10日,1188 - 1196年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. g . Lugli a . m .科恩d·a·贝内特et al .,“等离子exosomal microrna在残疾人和没有阿尔茨海默病:改变表达式和生物标志物的前景,”《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。10篇文章ID e0139233 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 美国长岛,s . Jirintai m .高桥et al .,”E型肝炎病毒出口取决于exosomal通路,与分泌液来自多泡体,“普通病毒学杂志卷,95年,第2175 - 2166页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c·s·冯·Bartheld和a . l . Altick”神经元多泡体:分布、蛋白质含量、和交易功能,“神经生物学的进展,卷93,不。3、313 - 340年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. l . Urbanelli a . Magini s Buratta et al .,“信号通路在液生物起源、分泌和命运,”基因,4卷,不。2、152 - 170年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 大肠Cocucci和j . Meldolesi”外皮层和液:脱落细胞外囊泡之间的混乱,“细胞生物学的趋势,25卷,不。6,364 - 372年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. g . Multhoff和l . e .高塔”区分积分receptor-bound热休克蛋白70 (Hsp70)在细胞表面Hsp70-specific抗体,”细胞压力和陪伴,16卷,不。3、251 - 255年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. a . Ghosh m·戴维i c槽et al .,“快速隔离细胞外囊泡的细胞培养和生物液体使用热休克蛋白质合成肽与特定的亲和力,”《公共科学图书馆•综合》,9卷,不。10篇文章ID e110443 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. z安德鲁和m . Yanez-Mo Tetraspanins在细胞外囊泡的形成和功能”,免疫学前沿5卷,第442条,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. r . Crescitelli c·拉瑟·t·g·萨博et al .,“不同的RNA在细胞外囊泡的亚种群:凋亡的身体,微泡液,”《细胞外囊泡,2卷,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. j·h·赫尔利,“ESCRTs无处不在”,在EMBO杂志,34卷,不。19日,2398 - 2407年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. j·g·范Boorn, m . Schlee c . Coch g·哈特曼,“与外来体纳米粒子核交付”,自然生物技术卷,29号4、325 - 326年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. d·冯w l。赵,y y。你们et al .,“通过吞噬细胞内化的液发生,”交通,11卷,不。5,675 - 687年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 吉冈y:小坂,y Konishi et al .,“敏感液体活检的细胞外循环使用ExoScreen囊泡,”自然通讯5卷,第3591条,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. k . m . Kanninen:深褐色,j . Koistinaho和t .白垩土,“液为中枢神经系统疾病新的诊断工具”,Biochimica et Biophysica学报(BBA)疾病的分子基础,卷1862,不。3、403 - 410年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j . Caradec g . Kharmate大肠hosseini beheshti说,h . Adomat m . Gleave和大肠枪支,“再现性和效率的serum-derived外来体提取方法,”临床生物化学卷,47号13 - 14日,第1292 - 1286页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. r . j .洛布·m·贝克尔,s .温家宝温家宝et al .,“外来体隔离协议优化细胞培养上清液和人血浆,”《细胞外囊泡ID 27031条,卷。4日,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. c .延伸美国Amigorena、g . Raposo和a·克莱顿”隔离和表征细胞培养上清液和生物液体的液”当前的细胞生物学技术第三章:3.22单位,2006年。视图:谷歌学术搜索
24. p·r·汤姆林森y郑,r·菲舍尔et al .,“识别不同的循环液在帕金森病,”《神经病学临床和转化,卷2,不。4、353 - 361年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. C.-G。刘,j .歌曲Y.-Q。张,P.-C。王”,微rna - 193 b是一个监管机构的淀粉样前体蛋白血液和脑脊液派生exosomal微rna - 193 b是一个生物标志物的阿尔茨海默氏症,”分子医学报告,10卷,不。5,2395 - 2400年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. 王y, z, r . a . Gemeinhart“microRNA交付,进展”《控释,卷172,不。3、962 - 974年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. x Gallart-Palau,塞拉,a . s . w . Wong et al .,“细胞外囊泡正在快速纯化从人血浆蛋白有机溶剂沉淀(PROSPR)”科学报告卷,5篇文章ID 14664, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. m . Lim和k·j·罗斯柴尔德Photocleavage-based胞外表达蛋白质的亲和纯化和印刷:应用蛋白质微阵列,”分析生物化学,卷383,不。1,第115 - 103页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. l·穆勒,c。香港,d . b . Stolz s c·沃特金斯和t·l·怀特塞德,“从人血浆分离生物活性液囊。”《免疫学方法卷。411年,55 - 65、2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. t . g . Kormelink g . j . a . Arkesteijn f . a . Nauwelaers e·n·m·g . van den恩格诺尔特- t霍恩,m . h . m . Wauben“先决条件的分析和排序由高分辨率的流式细胞术细胞外囊泡的亚种,”血细胞计数部分,卷89,不。2、135 - 147年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. k . m .能源部j . Estanislau j . tigg et al .,“昼夜循环细胞外囊泡的变化来衡量纳米流式细胞术,”《公共科学图书馆•综合》,11卷,不。1,文章ID e0144678, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. a . j . y . Chen涌,郭宏源。吴,m . a . Teitell d·迪卡洛,P.-Y。邱”,脉冲激光激活细胞分类与三维sheathless惯性聚焦,“小,10卷,不。9日,第1751 - 1746页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. d·金j . a . Piper r·c·列夫et al .,“Time-gated流式细胞术:一个超高选择性方法恢复ultra-rare-event mu-targets在高背景biosamples,”《生物医学光学,14卷,不。2、文章ID 024023, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. d·金·r·康奈利,j .风笛手,“实际time-gated发光流式细胞术我:概念,“血细胞计数部分,卷71,不。10日,783 - 796年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. j . m .小鸡,d . Kolippakkam d . p . Nusinow et al .,“mass-tolerant数据库搜索识别大部分未赋值的光谱的猎枪蛋白质组学作为修改后的肽,”自然生物技术,33卷,不。7,743 - 749年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. x Gallart-Palau, a·塞拉和s . k .苏”章Four-uncovering神经退行性蛋白质通过蛋白质组学分析修改,“国际的神经生物学卷,121年,第116 - 87页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. s·m·史蒂文斯、k . Prokai-Tatrai和l . Prokai”因素导致酪氨酸硝化的误认猎枪蛋白质组学,”分子和细胞蛋白质组学,7卷,不。12日,第2451 - 2442页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. 沙玛,j . Tammela x王et al .,“假定的卵巢癌基因的特性,延长因子1α,孤立的平移合成噬菌体展示单链可变片段库与人类卵巢癌细胞培养,“临床癌症研究13卷,第5896 - 5889页,2007年。视图:谷歌学术搜索
39. d . Van Simaeys d·图雷克c Champanhac et al .,“识别压力诱导细胞膜蛋白质磷蛋白质1作为一个潜在的卵巢癌生物标记使用寡核苷酸适配子细胞系统的进化选择的指数富集配体,“分析化学,卷86,不。9日,第4527 - 4521页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. m·曹美国秀哦,j .聂et al .,“定量选择和寡核苷酸适配子的并行特性,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷110,不。46岁,18460 - 18465年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. a·r·琼斯,c . c . Stutz y, j . d .标志和e . v . Shusta“识别选择性单链抗体片段,血脑屏障”生物技术杂志,9卷,不。5,664 - 674年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. s . k . j .路德维希·c . Tokarski s . n . Lang et al .,“叫生物标志物在牛奶在你的智能手机使用一种蛋白质微阵列,”《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。8篇文章ID e0134360 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. t . Laksanasopin t·w·郭s Nayak et al .,“智能手机软件狗传染病的诊断治疗,”科学转化医学,7卷,不。273年,文章ID 273 re1, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2016年皮特Heinzelman et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。