表型的表达星形胶质细胞标记增加转基因小鼠模型的阿尔茨海默氏症和年龄组:一个阶段发生前症状的研究

文摘

最近老鼠发生前症状的研究阶段,阿尔茨海默病(AD)表明,促炎的改变,如神经胶质细胞因子激活和感应,可能已经在这个早期阶段通过未知的机制。因为肿瘤坏死因子α有助于增加了β生产的β前体蛋白(APP),我们评估一个假定的APP /之间的相关性β和肿瘤坏死因子α在早期阶段发生前症状以及海马星形胶质细胞激活的三个APPswe / PS1dE9老鼠。而西方墨迹显示重要应用表达式,一种β不是由免疫印迹或ELISA检测证明,三个APPswe / PS1dE9小鼠发生前症状在广告病理阶段。西方的屁股也被用来显示增加GFAP表达转基因小鼠与肿瘤坏死因子呈正相关α和应用,这也是相互关联的。分区域免疫组织化学量化的表型(GFAP)和功能(TSPO)标记星形胶质细胞激活表示选择性和显著增加GFAP-immunoreactive (IR)细胞的齿状回APPswe / PS1dE9老鼠。我们的数据表明,微妙的形态和表型变化,兼容订婚的星形胶质细胞的激活途径,发生在海马体已经发生前症状的阶段的广告。

1。背景

阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄相关,无法治愈的神经退行性疾病(1]。广告的临床症状包括失去认知功能,干扰个人的能力执行日常任务,麻烦记住最近发生的事件,最终总内存损失,除了其他症状,比如风潮,偏执,睡眠障碍,侵略,和运动障碍(2]。广告的特点是通过胞外β淀粉样蛋白的沉积β)斑块和胞内积累过度磷酸化τ蛋白(神经原纤维缠结)。然而,AD发病机制仍不完全阐明。广告的盛行的理论原因是淀粉样蛋白级联假说,假设的生产过剩β淀粉样前体蛋白(APP)发起的一系列事件,包括突触功能障碍,hyperphosphorylationτ,neuroinflammation-related神经胶质激活,在广泛的神经元死亡的高潮1]。

神经炎症与沉重β斑块负担和积累神经原纤维缠结。各种GWAS研究涉及许多基因与免疫系统有关的零星的形式的广告,包括CR1,CD33的,俱乐部(3]。此外,俱乐部是一种急性期蛋白,因此是增加炎症反应的一个标志4]。特别是,基因组研究进一步揭示了重要的肿瘤坏死因子之间的联系α多态性和广告(5)和肿瘤坏死因子信号与转换有关痴呆患者的轻度认知障碍(MCI) [6]。

越来越多的数据支持作用的细胞因子和其他炎症介质在神经元活动中,包括学习、记忆和神经可塑性(7]。尽管肿瘤坏死因子α是一个著名的免疫介质,根据一个新兴概念,肿瘤坏死因子α也是一个突触功能的重要调节器和兴奋性8- - - - - -10]。由于突触功能障碍是最终负责广告的认知障碍,肿瘤坏死因子的影响α对突触完整了解疾病的发病机理是至关重要的。此外,免疫介质,包括肿瘤坏死因子α,并不局限于经典的免疫功能和之间有明显的交叉系统。例如,线粒体蛋白转运蛋白(TSPO),配体目前用作标记的反应性胶质增生和大脑炎症在AD患者明显的病理11),最初是在类固醇合成为其特征的角色把胆固醇从外到内线粒体膜(12]。TSPO确实可能超过一个标记的炎症由于干预和治疗TSPO配体证明减少神经病理学和行为障碍的小鼠模型广告,至少在疾病的晚期(13]。然而,目前还没有一致的精确类型的神经胶质细胞对促炎侮辱通过TSPO upregulation。一些研究报道的增加TSPO表达小胶质细胞和星形胶质细胞(14,15),而其他的研究指出,选择性小胶质细胞表达(16]。

最近的功能性磁共振成像(fMRI)研究指出hyperactivation海马神经元网络和功能相关的皮质轻度认知障碍患者(17,18),这可能被视为一种前驱期的广告。除了hyperactivation在功能磁共振成像研究中,有明显的痫性活动和广告之间的联系,在零星的癫痫患病率增加以及在家族性广告情况下(19]。改变网络活动由于癫痫发作也明显的增加各种小鼠模型的广告。发生前症状例如,preplaque () TgCRND8老鼠显示增加易感性pentylenetetrazole-induced癫痫控制老鼠相比(20.]。因此,APPswe / PS1dE9老鼠有无缘无故的发病率增加癫痫的发作β沉积(21]。进一步的证据表明,可溶性的积累β导致自发,nonconvulsive痫性活动,补偿重构gaba ergic抑制性神经递质系统不同,在突触可塑性和赤字22]。

我们最近报道,小胶质订婚的迹象在激活过程与肿瘤坏死因子增加α表达式的海马体preplaque TgCRND8小鼠模型的广告(23]。此外,这些早期的改变似乎伴随与海马神经元网络的同步改变活动(24),符合当前视图在肿瘤坏死因子的作用α在神经元活动的监管25]。本研究的目的是评估是否类似的早期改变神经胶质活动发生前症状时,可能导致preplaque阶段之前报道海马神经元的兴奋过度在另一个鼠标广告模式,APPswe / PS1dE9 [21]。我们使用APPswe / PS1dE9老鼠相同的年龄(三)与前面的研究(21)具体地址星形胶质细胞参与突触功能的控制基于神经胶质细胞,突触前和突触后神经元,是一种内在的“三方”突触的一部分26]。为此,我们比较了海马TNF水平α与表型(GFAP)的表达和功能(TSPO)星形胶质细胞标记。

2。材料和方法

2.1。化学品和抗体

氟化钠(氟化钠),phenylmethylsulfonyl (PMSF),蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒,乙二胺triacetic酸(EDTA),多聚甲醛(PFA),特里同x - 100和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)购买的σ(Saint-Quentin-Fallavier、法国)。正常的马血清(NHS)和荧光安装介质(Fluoromount)来自Dako (Les乌、法国)。

Anti-glial原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体购自突触系统(ab173004、哥廷根、德国)和anti-TSPO 18 kDa罗福斯生物制剂(nbp1 - 95674, Interchim分销商、Montlucon、法国)。驴anti-Guinea猪共轭与Alexa萤石647和驴anti-rabbit共轭Alexa萤石546人购买了从细胞信号(微孔、Fontenay-sous-Bois、法国)。免疫印迹,以下额外的多克隆抗体主要被使用:anti-GFAP (Z0334;Dako, Les乌里,法国),anti-TNFα(AB2148P;微孔,Chemicon Fontenay-sous-Bois、法国),CT20-anti应用抗体(171610;微孔,Chemicon Fontenay-sous-Bois、法国)。下面是二级抗体结合辣根过氧化物酶(合):goat-anti兔子IgG-HRP (sc - 2004;圣克鲁斯生物技术、CliniSciences、南特、法国)和horse-anti山羊IgG-HRP(向量π- 9500,Malakoff,法国)。反β(I-19) -actin-HRP (sc1616-HRP)也从圣克鲁斯生物技术、购买CliniSciences、南特、法国)。免疫印迹实验中使用的所有其他抗体免疫组织化学使用的相同。

2.2。动物

双APPswe / PS1dE9转基因和WT老鼠岁3个月被用于这项研究。这些转基因小鼠表达嵌合小鼠/人类应用DNA序列包含K595N / M596L瑞典突变与人类PS1变体携带外显子9删除由仓鼠朊病毒启动子元素指挥中枢神经系统神经元的表达(27]。

创建鼠标殖民地,男半合子B6C3-Tg (APPswe PS1dE9) 85 dbo(# 004462)和女性野生型小鼠(B6C3F1,股票# 10010)获得杰克逊实验室(巴尔港,我美国)是在标准条件下饲养的。标准丰富的环境下的老鼠单独住在一个房间里有12 h / 12 h光/暗周期(灯从7点到19点)在稳定的温度(21±1°C)和湿度(55±5%)提供食物和水随意。只有雌性老鼠被包括在这项研究中,因为它是公认,在小鼠和人类,女性风险更高的广告(28),特征可能相关的识别最早的改变在发生前症状研究阶段的广告。

动物治疗依欧洲共同体理事会指令2010/63 /欧盟实验室动物保健和实验验证了协议区域伦理委员会(授权号码:2013-01-23)。

2.3。组织处理

本研究实验中执行上运行两个独立的群老鼠。总共= 4 WT和= 5 APPswe / PS1dE9老鼠使用在第一组,而第二组包括在内= 5 WT和= 6 APPswe / PS1dE9老鼠。老鼠从第一组被用于原位实验(放射自显影法和免疫荧光),而第二组的小鼠被用于原位(放射自显影法)和生化(免疫印迹和ELISA)分析。

老鼠被斩首光异氟烷麻醉下,牺牲了,他们的大脑被小心地删除在冰上。原位研究全脑或右半球立即被冻结在异戊烷冷却−35°C在第一和第二实验分组,分别。大脑被切矢状使用冷冻低温恒温器(CM 3050年代、徕卡、德国)16µm和安装在糊化Super-Frost幻灯片(CML,穆尔,法国)。部分存储在−80°C至少4天,直到使用。池两个组别的数据后,小鼠评估放射自显影法的总数= 9 WT和= 11 APPswe / PS1dE9。

免疫组织化学实验进行部分毗邻那些用于放射自显影法,他们都从第一个实验群(= 4 WT和= 5 APPswe / PS1dE9)。然而,相邻部分从672 WT鼠标标识部分受损,无法处理。因此,WT鼠标ID 672被撤回,老鼠的数量评估免疫荧光,因此用于统计分析WT, = 3APPswe / PS1dE9 = 5。

生化实验对老鼠进行完全牺牲在第二实验群体。海马提取的左脑半球来自共有= 5 WT和= 6 APPswe / PS1dE9老鼠。他们立即在10卷均质裂解缓冲(25更易/ L Tris-HCl 150更易与L氯化钠和1更易与L EDTA, pH值7.5)补充50 L更易与氟化钠,1更易/ L PMSF和蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(50μL / g的组织和10μL /毫升的裂解缓冲,职责)。溶菌产物用和离心机在15000 g×15分钟在4°C。得到的上层清液(稀释1:4)收集测量布拉德福德的总蛋白量的方法。样本整除和存储在−80°C到免疫印迹分析和ELISA试验中描述的部分2。6和2。7。

2.4。Autoradiographic TSPO结合位点的研究

autoradiographic研究在整个队列在这项研究中使用的动物来自实验军团(总计= 9 WT和= 11 APPswe / PS1dE9老鼠)。扫描海马区域,4套幻灯片治疗。每组2幻灯片被用来确定总绑定和1张用于非特异性结合。共有48×3(4套幻灯片幻灯片/每张幻灯片设置×4部分)矢状部分/鼠标被用于每个鼠标。

TSPO结合位点的密度是衡量体外放射自显影法使用[³H] pk - 11195 (3.06 GBq /特定活动μ摩尔,优秀的)在50更易与1 nmol / L / L Tris-HCl缓冲区,pH值7.4。大脑部分被允许在室温下平衡(RT) 3个小时,然后用1 nmol / L[孵化³L H] pk - 11195 50更易Tris-HCl缓冲区,pH值7.4,在RT 60分钟。非特异性结合评估的1μmol / L pk - 11195 (Sigma-Aldrich、Les Abresles、法国)。幻灯片在冰冷的冲洗两次缓冲区(4°C) 5分钟,然后简要蒸馏水在4°C和干rt,干幻灯片应用程序是导电的金属电磁带(3 M、Euromedex法国斯特拉斯堡)在自由端,然后放置的毒气室β-imagerTM 2000 (Biospace实验室、巴黎、法国)。期间收集的数据从大脑部分是2小时。在协议甲苯基紫染色(数据未显示)和艾伦大脑图集(http://mouse.brain-map.org/static/atlas;从横向1.725毫米),矢状海马部分手动选择。使用β视觉软件(Biospace实验室、巴黎、法国),结合放射性水平直接决定了计数的数量β粒子发出划定区域。感兴趣的信号在该地区放射性配体测量至少八个部分每个鼠标和表示为每分钟计数每平方毫米(cpm /毫米²)。特定的绑定是由非特异性结合减去总绑定。

2.5。与GFAP免疫荧光研究TSPO表达:Colocalization

八个矢状部分(16µ米厚的)每只老鼠被用于免疫荧光实验。这些8部分相邻的2幻灯片用于确定的总结合放射自显影法实验从一个(4用于放射自显影法)的幻灯片,这是所有小鼠解剖匹配。总共8 (= 3 WT和= 5 APPswe / PS1dE9)小鼠,来自第一个实验中,都使用。

10分钟后在RT,部分使用载玻片上的铅笔Dakopen划定和固定在PFA 4% RT 30分钟。部分被洗3次在PBS 0.1 mol / L 5分钟在RT和组织部分孵化2小时在RT缓冲提高细胞渗透性和屏蔽的网站(PBS 0.1 mol / L / 0.3% Triton X-100/5% NHS)在孵化前一夜之间在4°C与1:500稀释多克隆豚鼠anti-GFAP (173 004;突触系统、哥廷根、德国)和1:1000稀释单克隆兔子anti-TSPO(克隆EPR5384 nbp1 - 95674;罗福斯生物制剂,阿宾顿、英国)。主要抗体在PBS稀释0.1 mol / L / 0.3% Triton X-100/1% NHS。4洗后PBS 0.1 mol / L RT 5分钟,矢状部分在RT孵化2小时在黑暗中与二次抗体,每个1:400稀释在PBS 0.1 mol / L / Triton X-100/1% NHS:驴anti-Guinea猪Alexa萤石647或驴anti-rabbit Alexa萤石546。片洗5 * 5分钟在PBS 0.1 mol / L和两次蒸馏水和孵化1:000稀释DAPI 15分钟在蒸馏水rt, 3洗后,安装了切片荧光安装介质和保存在一个黑盒在4°C到观察和分析。

图像从immunolabeled海马部分被俘AxioVision Rel 4.8软件(卡尔蔡司、从德国)使用荧光激光扫描显微镜20 x客观(奥林巴斯BX51、Rungis快递、法国)。总海马的图片得到使用MosaiX模块和多个荧光信号顺序是避免图像通道之间的串扰。分析的图像合并,然后使用ImageJ软件(WS,赢得32,Rasband ImageJ,美国国家卫生研究所的贝塞斯达,医学博士,美国)。海马区域被确定为每富兰克林Paxinos阿特拉斯(2007):CA1和CA2组合(CA1-2)由于相对非晶边界分离这两个地区。CA3及齿状回(DG)也进行了分析。

细胞被认为是积极的只有当其核探测(DAPI积极)。为每个子区域的海马体,GFAP-immunoreactive (IR)和双GFAP / TSPO-IR细胞,分别计算通过ImageJ插件细胞计数器。为每个子区域的海马体(CA1-2、CA3、DG),总细胞计数每平方毫米计算从每组4节/鼠标,然后平均获得单位面积上的平均细胞计数。

2.6。免疫印迹的研究

样品(20µ海马体的g蛋白溶菌产物)完全来自第二个实验群体和对应= 5 WT和= 6 APPswe / PS1dE9老鼠通过添加Laemmli样品电泳缓冲和处理变性沸腾5分钟在100°C。被隔开的蛋白质sds - page, Tris-Glycine 4 - 20%梯度凝胶(表达载体,费舍尔科学分销商、Illkirch、法国),在130 V 2小时。蛋白质被转移到硝酸纤维素(0.45µm;Velizy-Villacoublay Amersham,通用电气医疗集团生命科学,法国)在80 V 35分钟在4°C,激动之下。屁股被封锁在RT 1小时Tris-buffered脱脂牛奶稀释5%生理盐水(TBS)含0.05%渐变(TBS-T)然后孵化主要抗体在一夜之间在4°C TBS-T乳液稀释1%。使用的抗体是CT20(1: 5000)或6 e10 (1: 1000) anti-APP认识人类和小鼠(CT20)或专门人(6 e10) immunopositive蛋白质112 kDa, anti-TSPO(1: 3000)检测15 kDa蛋白质,anti-TNFα(1:1000),检测到一个51 kDa免疫反应性的蛋白质,和anti-GFAP(1: 5000),具体检测到一个55 kDa的蛋白质。

在TBS-T 3洗5分钟后,膜与二次孵化抗体1小时在RT TBS-T 1%牛奶。相应的HRP-conjugated anti-IgG应用作为第二抗体(1:5000)并行HRP-conjugated反β肌动蛋白免疫球蛋白g(1: 2000),作为内部标准等于加载。

免疫反应性的蛋白质被发现使用西方闪电化学发光试剂+工具包(美国优秀的绘画纸,MA)其次是光密度分析ImageJ软件(WS,赢得32,Rasband ImageJ,美国国家卫生研究所的贝塞斯达,医学博士,美国)。光密度(OD)测量每个免疫反应性的乐队被规范化β肌动蛋白。结果表示为相对光密度(杆)。

2.7。ELISA

一个商业化酶联免疫试剂盒用于肿瘤坏死因子α(灵敏度1 pg / mL)量化根据制造商的指示(Biosensis、Thebarton、澳大利亚)。分析的范围是15.6 - 1000 pg / mL。组织匀浆从海马(10毫克/ 100µL)来自第二个实验群体和对应= 5 WT和= 6 APPswe / PS1dE9老鼠添加到预镀在沿井和孵化酶反应停止后5-20-minute孵化在黑暗中与tetramethylbenzidine衬底和OD在450海里内读30分钟,使用基准+光谱分光光度计(Bio-Rad)。细胞因子水平然后通过绘制计算每个样本的OD对的标准曲线。

人类一β灵敏度(1-42)ELISA (< 10 pg / mL;浓度范围:15.6 - 1000 pg / mL)被用来量化一个β在海马匀浆按照制造商的表达式(热费希尔科学、圣奥宾,法国)指令。

2.8。统计分析

GraphPad棱镜5 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)是用于所有统计分析除了尺度效应,计算了科罗拉多斯普林斯的网络效应大小计算器,科罗拉多大学(http://www.uccs.edu/ ~ lbecker /Cohen)的和权力。科恩的和计算估计能力检测组和相关性之间的显著差异,分别。效果评估是根据以下约定:小= 0.2,为中等= 0.5,对于大型和= 0.8小= 0.1,为中等= 0.3,= 0.5为大。结果表示为意味着±标准平均误差(SEM)。确认正常后使用Shapiro-Wilk测试正常,双尾,未配对学生的测试被用来比较两组的老鼠(WT与APPswe / PS1dE9)。生化数据的相关分析是由线性回归。在所有情况下,意义是说(),()。图蒙太奇创建使用免费的图像编辑软件,GNU图像处理程序(GIMP)。

3所示。结果

3.1。海马应用,肿瘤坏死因子α表达发生前症状表明广告病理阶段三个APPswe / PS1dE9老鼠

免疫印迹分析研究应用表达式的年轻,三个APPswe / PS1dE9和WT老鼠表示显著(;)增加表达式APPswe / PS1dE9老鼠,有一个非常大的科恩影响大小,1.981(图1(一))。没有一个β可以发现在这个年龄段使用CT20或6 e10抗体(免疫印迹)或ELISA(数据没有显示)。此外,在这个时代,βc航站楼片段(β周大福),病原的前兆β也几乎检测不到APPswe / PS1dE9小鼠的海马CT20或6 e10抗体在免疫印迹分析(数据没有显示)。这些数据表明,广告病理学的研究三个APPswe / PS1dE9老鼠可能对应于前一阶段的人类疾病发生前症状临床症状清单(29日]。

然后我们问,通过类比我们之前发现TgCRND8老鼠(23),APPswe / PS1dE9小鼠显示肿瘤坏死因子增加α没有检测到一个表达式β。我们的数据表明,三个APPswe / PS1dE9和WT老鼠表达类似的TNF水平α、独立的试验用于检测(数字1 (b)和1 (d)免疫印迹和ELISA,职责)。然而,科恩的大效果,1.022,表明TNF的差异α团体之间可能有意义。有趣的是,数据的线性回归分析从APPswe / PS1dE9老鼠表示,增加应用积极与肿瘤坏死因子相关α(= 0.9261;;图1 (c)),这导致了一个非常大的效应大小:= 0.93。综上所述,这些数据表明,尽管事实上意味着肿瘤坏死因子α值之间基因型相似,APPswe / PS1dE9老鼠表达更多的应用也表达肿瘤坏死因子α。

3.2。诱导的星形胶质细胞表型标记、GFAP点胶质激活海马的三个APPswe / PS1dE9老鼠

假定的订婚的星形胶质细胞的激活途径探讨了量化GFAP表型标记的免疫印迹。显著增加GFAP表达被发现在APPswe / PS1dE9老鼠比WT(图2(一个);;Cohen)和一个非常大的影响大小,1.525。APPswe / PS1dE9老鼠,GFAP的增加与应用此外呈正相关(= 0.8917;;图2 (b))。此外,GFAP和肿瘤坏死因子α表达式也相互关联(= 0.8351;;图2 (c))。都产生了巨大的影响大小的相关性,= 0.84和0.89,分别。

一致,共焦显微镜的形态分析表明,星形胶质细胞显示一些激活在这个阶段的迹象。事实上,GFAP-IR电池厚度与紧凑细胞体和海马的细胞过程被认为,更确切地说在CA1-2次区域(图2 (d))。总的来说,这些数据表明,星形胶质细胞的小鼠具有较高应用超表达更先进的激活过程(根据GFAP表达越高),产生更多的肿瘤坏死因子α。这些相关性可能代表增量变化发生前症状在这个阶段的广告,广告病理学进展认出。

3.3。海马的水平TSPO及其结合位点之间的差别并不是APPswe / PS1dE9和WT老鼠

TSPO感应已被建议作为一个标记的神经胶质激活(30.]。期间我们也因此被问及这个标记是调节神经胶质的第一阶段参与激活过程,提出了共焦显微镜(图2 (d))。免疫印迹TSPO水平的评估指出异构表达式APPswe / PS1dE9和WT与媒介科恩的老鼠影响大小,0.467(图3(一个))。然而,没有观察到的基因型之间统计上的显著差异。TSPO之间的相关性和GFAP表达APPswe / PS1dE9组不显著(= 0.3762;;图3 (b))和TSPO感应不是与肿瘤坏死因子相关α(= 0.3608;;图3 (c))。

我们认为,组织均匀化在免疫印迹实验可能掩盖了一个小TSPO感应和决定进一步评估的原位分布TSPO通过放射自显影法。的密度TSPO结合位点被[因此量化对大脑的部分³H] pk - 11195放射自显影法的三个的老鼠的海马基因型(数字3 (d)和3 (e))。pk - 11195中添加多余的(1μmol / L)几乎完全抑制了放射性配体(1 nmol / L)绑定。在全球范围内,总(³H] pk - 11195绑定是相对较低的大脑,虽然海马体和室周的区域显示密度的增加(³H] pk - 11195绑定。没有观察到显著差异WT和APPswe / PS1dE9组之间(6.04±0.49和6.75±0.52 cpm /毫米²、职责),与免疫印迹结果一致。完全,结合生化和autoradiographic证据表明海马星形胶质细胞的三个APPswe / PS1dE9老鼠可能没有达到一个完全激活状态(如没有证实的TSPO标记感应)。尽管如此,据GFAP感应数据和形态学改变,他们显然是已经订婚的激活过程。

3.4。海马体的评估GFAP / TSPO Colocalization APPswe / PS1dE9与WT老鼠

相对强劲的方法,如免疫印迹和放射自显影法,允许评估变化较大的地区。然而,可能存在细微的差别在海马条件对学习和记忆很重要。因此,我们进行了分区域免疫组织化学研究海马部分用于放射自显影法(图相邻4)。分析GFAP-IR分布以及双GFAP / TSPO标签指出选择性GFAP-IR细胞的数量增加(图5(一个)DG) (;)。GFAP的数量/ TSPO double-IR细胞(图5 (b)DG)也明显增加(;在CA1-2)以及(;)条件的海马体APPswe / PS1dE9老鼠(图5 (b))。因此原位分析表明,在一个更坚决,星形胶质细胞也显示调节GFAP表达检测在海马体APPswe / PS1dE9老鼠subregion-specific的方式。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,微妙,activation-related变化检测在海马体的广告已经在发生前症状的阶段研究APPswe / PS1dE9小鼠模型。这些改变包括增强星形胶质细胞表型标记的表达水平,GFAP、以及海马subregion-selective GFAP-IR细胞的数量增加。结合形态学标志(增厚细胞体和过程)和GFAP和肿瘤坏死因子之间存在显著的正相关α表达,我们的数据点在海马星形胶质细胞激活状态的改变APPswe / PS1dE9发生前症状的老鼠,这是兼容订婚的激活途径。考虑到缺乏显著TSPO感应生化免疫印迹,autoradiographic ([³H] pk - 11195绑定),免疫组织化学(TSPO-IR)化验,双GFAP的数量显著增加/ TSPO-IR细胞中发现的DG和CA1-2地区可能是由于观察到显著的GFAP感应。推论,星形胶质细胞激活状态,改变广告的报道这里发生前症状的阶段,将完全不同于星形胶质细胞的激活状态的特点是一个调节TSPO表达式(30.]。

唯一的先前的研究,考察了早期肿瘤坏死因子之间的关系α归纳和APP /βAPPswe / PS1dE9老鼠大一点,3.5月大的动物,这显示低,但可检测,可溶性β(31日]。为了更具体评估应用超表达的影响没有检测到其解理产品,因此,我们使用三个老鼠。与我们的研究相比,之前的报告没有具体评估海马体,然而它确实显示肿瘤坏死因子的显著增加α表达3.5月大的大脑APPswe / PS1dE9老鼠[31日]。综上所述,之前的研究,我们目前的数据表明,低的存在β可能是充分必要引发肿瘤坏死因子显著增加α。此外,我们先前已经表明,不同年龄阶段是发生前症状在2周没有和AD-related的存在改变海马网络同步,分别为(24]。我们的确发现,在另一个广告小鼠模型(TgCRND8) gamma-theta振荡耦合存在(和类似发现在WT老鼠),而两周后(即。在出生的老鼠),theta-gamma振荡耦合丢失(24]。此外,在TgCRND8,广告病理学发展快得多(32比APPswe / PS1dE9 []33老鼠,TNF的显著增加α海马的水平检测已经在1个月的年龄23]。3 xtg-ad小鼠肿瘤坏死因子增加α内嗅皮层中也被观察到在广告病理学的早期阶段,它发生以及单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)感应34]。我们的研究之间的区别,后者的两个研究可能与使用不同的小鼠模型:APPswe / PS1dE9(本研究)与TgCRND8 [23)和3 xtg-ad (34]。

在这个阶段,TNF的假定的触发器α在三个APPswe / PS1dE9老鼠仍然未知。事实上,无论是β也不β清洁技术基金,此前建议尽可能的肿瘤坏死因子α诱导淀粉样病变(前驱期期间23),本研究中检测到。这还有待建立非常低水平的这些应用乳沟产品在触发高架TNF可能仍然有效α释放。在协议中,picomolar水平低β(这可能仍由免疫印迹和ELISA方法检测不到这里使用)已报告积极影响突触传递(35,36]。或者,应用高于生理水平的增加,这是由于转基因超表达,可能引发肿瘤坏死因子α归纳。因此,应用程序的能力,调节gaba ergic神经元的突触可塑性(37]可能确实与肿瘤坏死因子协同行动α现阶段影响神经元兴奋性如前所报道APPswe / PS1dE9鼠标[AD发病的21]。使用APP-overexpressing老鼠,未来的研究需要测试这个有趣的假设。

符合这一假说,我们的发现增加了证据表明有一个preinflammatory TNF的角色α神经元兴奋性的规定在第一阶段的广告发病机理。事实上,在研究年龄(3个月),APPswe / PS1dE9老鼠不显示显著增加β或β周大福生产(本研究),然而他们显示海马神经元的兴奋过度21]。根据先前的研究中,海马神经元兴奋性的增加意味着增加癫痫样的活动,它表现为nonconvulsive癫痫和与膜电位下降21]。最近的证据hAPP-J20小鼠模型的广告以及广告患者表明这兴奋过度可能是由于降低了gaba ergic传播产生的电压门控钠离子通道亚基的表达减少Nav1.1 [38)或gaba ergic损失(39- - - - - -42]。此外,肿瘤坏死因子α等广告与突触功能障碍有关,肿瘤坏死因子α拮抗剂能够阻止β介导的抑制(LTP)体内长期电位化43]。兴奋性改变和突触可塑性,特别是在LTP,可能构成典型的认知缺陷的广告和病理肿瘤坏死因子α信号可能导致这样的障碍。

与每个AD-associated胶质改变早期,这可能反映了细胞因子的水平,增加类似的变化在病理学的更高级的阶段被广泛认可。例如,一项研究通过吉梅内斯和他的同事们使用PS1×应用小鼠海马il - 1中发现显著增加β和肿瘤坏死因子α分别由6 - 18个月的年龄,(44]。类似的结果在增加il - 1的表达β和处于在7个月大,9个TgCRND8小鼠,分别也报道,brain-region-specific [45]。最近发表的一项研究,我们小组也已记载了细胞因子和TSPO感应APPswe / PS1dE9小鼠年龄为6个月(46]。有趣的是,在这些高级阶段的广告病理学,兴奋过度,这可能与至少TNFα也许il - 1β在发病的早期阶段47),是不再检测。未来的主要挑战是了解细胞因子的机制这样的开关动作过程中广告发展,这可能与肿瘤坏死因子的双重性质α信号(48]。

5。结论

我们的研究表明,最初的肿瘤坏死因子诱导的机制α发生前症状可能与生产过剩的应用阶段的广告。事实上,增加应用程序触发星形胶质细胞激活在缺乏β。此外,表型标记星形胶质细胞激活(GFAP)应用和肿瘤坏死因子呈正相关α。结合形态学激活的迹象,这些数据表明,星形胶质细胞参与激活过程在广告发生前症状阶段可能是肿瘤坏死因子的来源α即使没有完整的胶质激活。进一步的研究,旨在发现比TSPO敏感生物标记星形胶质细胞的激活和GFAP upregulation现在是必要的。他们应该帮助设计新的干预策略的阶段发生前症状疾病提供一种很有前途的方法来停止广告的发展。

信息披露

Aurelie Domene和切尔西Cavanagh分享第一作者。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢JoAnne McLaurin博士(新宁研究所、多伦多大学)宝贵的反馈和建设性的建议和艾琳小姐霍夫尔为她贡献在初始阶段的工作。研究导致这些结果已经收到基金会的资金倒拉纳DVS20131228910医学和服务德合作et d 'Action从杜Consulat一般法国魁北克SK,欧盟第七框架计划(fp7/2007 - 2013)根据授权协议。278850(别忘了),Labex铁(ANR-11-LABX-18-01)西尔维沙龙餐厅和国家倒说是(计划MALZ) et l 'Association法国阿尔塞西尔Delarasse。

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