铜和/或胆固醇过载对线粒体的影响函数在老鼠模型中初始退化

文摘

铜(铜)和胆固醇(Cho)都是与神经退行性疾病在人类和动物模型。我们研究了影响Wistar鼠口服补充微量的铜(3 ppm)和/或饮用水中曹(2%)2个月。增加大量nonceruloplasmin-bound铜中观察到等离子体和大脑海马一起更高浓度的血浆铜蓝蛋白在等离子体中,皮层和海马。铜、赵,结合治疗铜+曹能够诱导更高的Cho /磷脂比在线粒体膜同时减少谷胱甘肽含量。双磷脂酰甘油的浓度降低,过氧化反应产品时,共轭双烯的形成,增加。治疗包括赵产生rigidization在线粒体内外膜同时提高渗透率。没有显著增加Cyt C渗漏观察到细胞溶质除了从大鼠皮层的情况下接受铜和曹caspase-3活动也有重大的改变和伯灵顿/ Bcl2比率。然而,一个β第1 - 40(1-42)/()比在皮层和海马更高。这些发现表明一个初始神经退行性过程由铜或赵可能会使这两个协会的补充剂。

1。介绍

众所周知,铜(铜)是所有生物体的重要过渡金属,功能作为许多酶的辅因子(1- - - - - -3]。然而,我们和其他实验室演示了在活的有机体内和在体外无机铜过剩生产水平的提高活性氧(ROS)和损伤生物分子,最终促进细胞死亡(4- - - - - -7]。人类不断面临过剩的铜由于无意识的接触污染(污染的水、食物),专业活动(8- - - - - -10),摄入的膳食补充剂10- - - - - -12),和长时间使用子宫内的设备(13,14]。铜等离子体水平升高,尤其是free-Cu或所谓nonceruloplasmin-bound铜(NCBC)、相关神经退行性损伤(10,15,16]。近年来,有相当数量的增加铜神经退化过程相关的已发表论文(15- - - - - -18]。符合这一点,布鲁尔(10)假设摄入来自不同来源的无机铜至少是阿尔茨海默病(AD)的部分原因在发达国家。Squitti et al。17- - - - - -19)报道,NCBC,松散分子如血清白蛋白和其他蛋白质,是参与广告发展的一个主要危险因素。他们认为是CP比铜解释Cu-associated特性的重要生物标志物病人活广告。

广告有多个条件和诱发因素。然而,据报道,无机铜与高脂肪饮食为广告的发展,特别是如果存在其他风险因素(19]。Pappolla et al。20.)提出,高胆固醇血症加速生化neuropathologic损害在转基因小鼠。此外,Notkola et al。21]发现血浆胆固醇(Cho)水平预测广告盛行的以人群为基础的样本444名男性(年龄在70 - 89年)。最近,在活的有机体内广告神经退行性疾病的模型表明,铜的协会和赵会增加神经退行性损伤的发展的风险(22- - - - - -24]。

铜过量已经广泛与ROS生产过剩在体外和在活的有机体内(6,7,25]。氧化应激被认为是一个主要事件发展的广告(26]。教皇et al。27)报道,ROS生产过剩由于电子传递链的功能障碍病因与广告相关的神经退化和帕金森病。此外,一些实验证据表明线粒体能量发生变化以及氧化损伤的积累在AD发病机制的主要转基因动物模型和人类患者的大脑(28,29日]。

审查的Paradies et al。30.),线粒体被认为是最重要的细胞细胞器导致神经退行性的过程,主要通过呼吸链功能障碍和活性氧的形成。因素增加线粒体ROS的速度生产导致线粒体功能障碍,因为损害oxidative-induced mtDNA等各种重要的生物分子,脂类,蛋白质,从而增加线粒体恶化一个自我实现的过程(31日]。与活性氧积累,线粒体功能障碍是最早的和最突出的特征之一的广告(27,28),这个条件是与多个负面后果密切相关。线粒体功能失调产生高水平的最终毒性细胞ROS,特别是长寿命和低抗氧化防御系统,如神经元(28,29日]。同时,线粒体是同样的目标产生的ROS pro-oxidative因素如铜过载或增加NCBC的水平。

在线粒体脂质直接受到活性氧的生产过剩,心磷脂(CL)是一种最深入参与突触和神经损失(31日]。CL与内生proapoptotic级联,最终导致apoptosome的集成和随后的激活效应的半胱天冬酶系统[28- - - - - -31日]。此外,CL参与生物能量学过程的监管和线粒体膜的完整性。过氧化的CL直接影响生化功能取决于内部和外部线粒体膜的组成和结构。实验证据清楚地表明,这个脂质代表活性氧攻击的最重要的目标30.]。

总之,有确凿证据表明ROS hyperproduction与线粒体功能障碍。氧化应激也直接参与神经退化和铜过载与胆固醇明显作为协同神经障碍的病因的风险因素。所有上述证据表明需要更深入的研究这一现象。针对缺乏确凿的研究的生化影响铜+曹(CuCho)协会mitochondrial-associated功能障碍,特别是相对于那些方面参与程序性细胞死亡,我们旨在调查的影响CuCho线粒体分离皮层和海马Wistar鼠和探索(i) Cho /π比率和稳态荧光各向异性的线粒体内外膜以评估他们的流动性;(2)线粒体膜的完整性通过探针的措施转移膜电位;(3)主要线粒体抗氧化剂谷胱甘肽的浓度;(iv)的浓度的关键线粒体磷脂,心磷脂,和可能pro-oxidative损坏原因;(v)凋亡通路的活动根据线粒体膜的完整性(caspase-3和伯灵顿/ bcl - 2比例);和(vi)的浓度β淀粉样蛋白(β)在两个脑区和外围等离子体的生物标志物proneurodegenerative效果。

2。材料和方法

2.1。化学物质

使用的所有化学药品均为分析纯,从σ化学。有限公司(布宜诺斯艾利斯,阿根廷或美国),默克公司(达姆施塔特,德国),和卡洛Erba(意大利米兰)。

2.2。动物和治疗

认证的无菌雄性Wistar鼠。老鼠保持在控制温度(25°C)和强制通风相对湿度为60%,在正常光周期12 h黑暗和12 h的光。动物的健康监测按照国际推荐的做法生命科学研究所实验动物资源委员会,国家研究委员会(ILAR)。固体食物和饮用水随意。实验准备的饮食在我们实验室根据建议Wistar鼠(32]。所有程序处理动物跟着美国国立卫生研究院规定(33]。实验协议进行审核和批准的生物伦理委员会医学科学教师,UNLP (00382/11)。

2.3。试验协议

老鼠(21天)被随机分配(每组10动物)协议详细如下,治疗8周(2个月)。选择非常年轻老鼠让我们丢弃任何神经退行性(未知的)事件(s)的年龄动物有关。顺便说一下,这种方法可能是外推到人类暴露于铜从一开始他们的生活。此外,在前面的实验(图中未显示),我们指出那个以免在一生的第一年我们没有差异模型的响应的函数的起始治疗的时代。对照组(C)是维护lab-prepared丸,建议正常生长包含7 ppm的铜34,35]。Cu-supplemented实验组(铜)美联储在控制球和自来水补充3 mg / L (ppm)的铜的超纯CuSO形式₄(默克公司,达姆施塔特,德国)。Cho-supplemented集团(Cho)是美联储在颗粒含有2% (W / W)秋(87%纯)(从Saporiti SRL、布宜诺斯艾利斯、AR),和铜+ Cho-supplemented集团(CuCho)同时对铜水+曹食物。老鼠监测试验期间观察他们的行为,量化水和食物消费,并确定他们的身体体重增加。总铜浓度在自来水补充CuSO决心通过原子吸收方法,ppm(意味着所有日常测量的实验周期)。考虑到每个动物之间的花季和毫升水/天(在开始和结束的协议,职责),铜最多0.01至0.05毫克/天从水中收购(铜剂量相当于0.06和0.18毫克/公斤动物生活,职责)。线性回归曲线和食品中铜含量方差分析测试表明没有明显变化之间的6准备用于实验(ppm或毫克铜/公斤饮食)。铁和锌含量(由原子吸收光谱法)是相同的所有准备工作(和ppm,职责)。沿着实验不同于固体食物的摄入来g /鼠,这意味着口服摄入铜在铜范围从0.08到0.21毫克/天/鼠(铜0.0032至0.0008毫克/公斤活体动物)。

2.4。样品收集

的治疗,动物深感与氯胺酮麻醉(70毫克/公斤)和甲苯噻嗪(5毫克/公斤)应用肌内,然后牺牲斩首。大脑被分割成两个区域:皮质和海马体,使用Paxinos和华生的阿特拉斯(36作为组织解剖的指南。大脑区域都洗、体重和均质使用三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(10毫米pH值7.4)与蔗糖(70毫米),甘露醇(230毫米),乙二胺四乙酸(EDTA)(1毫米)和二硫苏糖醇(DTT)(1毫米)(缓冲)。匀浆在2°C 700×g离心10分钟和上层清液recentrifuged 8000×g(10分钟/ 2°C)获得细胞质分数。纯线粒体分数被从先前的颗粒离心分离resuspending 3毫升的缓冲和离心法在5分钟1000×g (2°C)。球被丢弃和上层清液re-centrifuged 10分钟11000×g (2°C)。最后,最后一球(线粒体分数)在缓冲resuspended II(缓冲我0.015%毫克纯白蛋白(σ化学。有限公司;布宜诺斯艾利斯,AR))。上层清液的胞质分数是由超速离心法110000×g 1 h 2°C。在动物的牺牲,也收集使用肝素抗凝血(1 IU / 5毫升)在冰冷的聚丙烯管。血浆样本立即准备通过离心冷(4000×g, 10分钟)和存储在−70°C到分析。

2.5。原子吸收测量

整除的样品消化了4毫升HNO的混合物₃(c)和1毫升HClO₄(奥尔德里奇或σ化学。有限公司,布宜诺斯艾利斯,阿根廷在120°C)通过加热60分钟一块矿化(37]。摘要冷却,用超纯水稀释(18 mΩ厘米,卡洛Erba、米兰、意大利),并与0.22超滤器μ微孔膜(Milli-Q净化系统,从微孔、钙、美国)。超滤器破裂直接吸进PerkinElmer 1100 B的火焰分光光度计配备了优秀的阴极灯(美国优秀的公司,诺沃克,CT)的光谱宽度1海里。标准的100 ppm解决方案锌和铁从HCR Inc . (QuimiNet、布宜诺斯艾利斯、AR)。铜决定被校准用标准溶液(200 ppm)的铜(没有₃)₂在HNO₃0.5 N (Titrisol默克有限公司,达姆施塔特,德国)。所有测量进行了峰高模式(324.7纳米线)。内部- [(SD / x)·100]和国米-[(ΔSD /Δx)·100]测定变异系数分别为6.0%和15.5,分别。我们经常获得类似的校准曲线方程(IR = 55·10⁻⁵+ 0.048(铜、mg / L)),以及统计分析演示了一个相关系数总是在0.95和0.99之间。此外,我们探讨了所谓的基体效应,可能修改的标准的回归。在样本,获得的值不同从48 - 60·10⁻⁵非常类似于铜的标准解决方案,说明基体效应被认为是不重要的或者是微不足道的。样本均值为恢复和RSD为上升99.7%和3.3%,分别检测极限为0.09 mg / L。为了验证该方法的准确性,我们探讨了影响时间的稀释后,酸性消化温度,HNO的浓度₃/ HClO₄建议后Terres-Martos et al。38]。我们也检查结果与生物样品(等离子体和匀浆)对Seronorm血清微量元素(来自血清实验室、Billingstad、挪威),发现无显著差异,宣布获得(认证)浓度。

2.6。血浆铜蓝蛋白(CP)水平和Nonceruloplasmin-Bound铜(NCBC)

样本分析酶p-phenylenediamine转化为一个蓝色的产品(39当时以550海里。在37°C反应进行缓冲冰乙酸/醋酸钠(50毫米,pH值5.5)直接进入平底的盘子,使用微型板块读者SpectraMax从分子设备模型分析技术(CA桑尼维尔,美国)为3分钟。内部,interassay变异系数分别为4.4%和8.3,分别。CP浓度与反应速率的计算是通过比较纯粹的CP标准(σ化学。有限公司,布宜诺斯艾利斯,阿根廷)。使用铜和CP数据计算了non-CP-bound铜(NCBC,或所谓的自由铜)所描述的布鲁尔(19)通过减去铜绑定到每个毫克的总铜的CP的数据。这个参数可以很容易地使用公式表示为百分数(((铜)−47.2×(CP))×100 /(铜)),铜μmol / L和g / L CP [40]。

2.7。脂质分析

总脂质提取的方法Folch et al。41]。每个Folch提取的整除蒸发残渣溶解在50 mM钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)包含洋地黄皂苷1%。整除,这个解决方案是保持酶的测定胆固醇(Cho)和磷脂(PL)使用商业套装从维也纳实验室(罗萨里奥(阿根廷)。确定线粒体心磷脂(CL)内容、样本的高效薄层色谱分离(分离法预镀硅胶板(10×20厘米)的浓度区绘画纸Schleicher和Schuell(英国梅德斯通)。流动相是氯仿:甲醇:氢氧化铵(65:25:4;按体积)。斑点本地化使用碘蒸汽侧巷发现与真实标准的CL, mono dilyso-CL,和其他参考磷脂(两代情极性脂质,安大略省,加拿大)。剩下的板是覆盖着玻璃,以避免可能的自发的氧化。CL和lyso-CL区都刮掉了盘子,筛选了从硅“逆”Folch提取(氯仿:甲醇;1:2)。 After evaporation under nitrogen at room temperature, the selected zones were dissolved in 200 μL Folch溶剂混合物。CL的总量和lyso-CL量化通过磷测量使用Chen等人的方法。42]。

2.8。线粒体膜的完整性

线粒体膜电位()是衡量评估线粒体膜的完整性使用孤立的线粒体染色从Sigma-Aldrich工具包,Inc .(布宜诺斯艾利斯,AR)。这个工具包是基于吸收的亲脂性的阳离子探针5、5′,6′6 -tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethyl-benzimidazolcarbocyanine碘染色(JC-1)直接依赖于线粒体基质。在健康细胞,染料集中在矩阵,形成明亮的红色荧光聚集的地方。吸收的线粒体JC-1可以利用作为一个有效的区分凋亡和健康细胞。任何情况下,消散防止积累JC-1线粒体染料,染料是分散在细胞质中,导致从红(JC-1凝聚)转移到绿色荧光(JC-1单体)。测量样本中,我们使用一个PerkinElmer LS 55荧光光谱仪,设定在525 nm激发波长和590海里排放。

2.9。稳态荧光各向异性的衰变时和TMA-DPH

亚线粒体分数(内外膜)后得到弗雷泽和Zammit[描述的方法43)的修改Pellon-Maison et al。44]。膜流动性分析之前,总蛋白浓度测定在每个暂停,调整约300μg蛋白/毫升使用5毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液pH值7.40。膜流动性是由荧光各向异性(或极化)使用两种荧光探针技术:1,6-diphenyl-1 3 5-hexatriene(衰变时;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和1 - [4 - (trimethylamino)苯基]6-phenyl-1 5-hexatriene (TMA-DPH;分子探针,尤金或)。TMA-DPH被用来监测流动性在细胞膜表面附近。极地地区的这个探针固定在lipid-water接口和碳氢化合物一部分进入脂质膜的一部分。TMA-DPH分子的疏水部分的长度大约相当于一个质膜(45]。衰变时纳入了疏水区域的脂质双分子层(46]。衰变时或者TMA-DPH各向异性与膜流动性呈负相关47]。各向异性测量进行了如前所述[48),用细微的修改。简单,膜被积极使用涡振子1分钟和均质受到轻微的声波降解法布兰森声波降解器450(美国布兰森超声波SA, CA)(输出设定在40%)3分钟后潜伏期在冰上。声波降解法周期是由浊度控制在600 nm处的悬架和中断时的吸光度值0.2或更少了。这个过程不会干扰脂质影响的过渡,但分散聚合,促进荧光读数和减少光散射(49]。衰变时的样品和TMA-DPH化验(3毫升)包含5毫米Tris-HCl缓冲pH值7.4,60μg蛋白的稀释悬浮液,50μ在四氢呋喃或25 M MDPHμ在二甲基甲酰胺和M TMA-DPH孵化为45分钟37°C。在他稳态各向异性测量λ十年代βspectrofluorophotometer(热电子Corp .),悉尼,澳大利亚)配有恒温器电池座。检查样品的温度的精度±0.1°C使用热敏电阻温度计。激发和发射被设定在357/435和358/428 nm衰变时和TMA-DPH(职责)使用5 nm激发和发射狭缝。样本与线性照明(垂直,或水平,)极化单色光和发出的荧光强度(,任意单位)平行或垂直于激发光束的方向都被记录下来。空白样品没有添加探测器(s)也估计不具体的测量可能到达探测器的光。探针的荧光各向异性被计算为,在那里和分别是发出的荧光的强度,平行和垂直于方向垂直偏振激发光;G是校正因子()的光学系统的比率水平的垂直偏振发射组件,当激发光在水平方向极化;和代表TMA-DPH或衰变时。根据Shinitzky Barenholz [50),荧光各向异性值成反比细胞膜流动性。因此,高度的荧光各向异性代表一个高结构秩序或低细胞膜流动性。

2.10。线粒体减少(谷胱甘肽)和氧化谷胱甘肽(GSSG)内容

总谷胱甘肽是由谷胱甘肽还原酶/ dithionitrobenzoic (DTNB)方法,可以测量谷胱甘肽和GSSG [51]。线粒体谷胱甘肽(mGSH)计算减GSSG总谷胱甘肽含量(谷胱甘肽+ GSSG)。因此样本中运行的存在和缺乏divinylpyridine 2毫米。

2.11。程序性细胞死亡生物标志物

2.11.1。Caspase-3活动

Caspase-3活动是由一个比色测定测量工具(CASP-3-C),基于合成肽底物的水解acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroaniline (Ac-DEVD-pNA) Caspase-3(σ化学。有限公司,布宜诺斯艾利斯,阿根廷)。由此产生的对硝基苯胺(p-NA)监测,发布了405海里。每个分析并行运行inhibitor-treated细胞溶解产物(测量的非特异性水解底物)和caspase-3积极控制(使用商业caspase-3 5毫克/毫升工具包所提供的制造商)。对硝基苯胺的校准曲线用标准溶液(p-NA)也为每个运行分析计算蛋白酶表达的活动μ摩尔p-NA发布/分钟·毫升的样品。

2.11.2。伯灵顿/ bcl - 2比

免疫印迹分析伯灵顿和bcl - 2进行计算伯灵顿/ bcl - 2比例。相等的数量(30μg蛋白每车道)总蛋白质分离的sds - page凝胶(15%)减少条件下和Miniprotean第六单元(Bio-Rad、钙、美国)。蛋白质被electrophoretically转移到PVDF膜(IPVH00010止动剂,微孔,美国)。膜被封锁的5%脱脂奶和孵化anti-Bcl-2和anti-Bax抗体,分别为(1:1000;sc - 492兔多克隆和sc - 493兔多克隆从圣克鲁兹CA,美国一夜之间职责),在4°C。其次是孵化与山羊anti-rabbit二级抗体结合辣根过氧化物酶(1:20.000;美国圣克鲁斯,CA)。照片拍摄使用分子凝胶成像仪Doc XR和ChemiDoc XRS系统(Bio-Rad)和光学密度的乐队是量化。

2.12。β-淀粉样蛋白肽第1 - 40()和(1-42)

β-淀粉样蛋白肽(β第1 - 40)()和(1-42)测量使用人类/老鼠βAmyloid-40和光二世和人类的酶联免疫试剂盒kouichi Amyloid-42和光高灵敏度,酶联免疫试剂盒kouichi分别。前化验样本离心机(2°C) 5000 g×15分钟和上层清液稀释1:1由制造商提供的缓冲区。结果对等离子体中表达pmoles pmol / mg / L和大脑组织蛋白质。的一个β第1 - 40(1-42)/()从每个单独的一对数据比率计算。

2.13。生物标志物的心磷脂过氧化反应

2.13.1。真实的时

时(LPOO)心磷脂提取(CL)测定的方法Nourooz-Zadeh et al。52]。结果表示为μ摩尔LPOO /μ摩尔CL(用于计算我们使用的消光系数4.60 (10⁻⁴)·摩尔⁻¹·厘米⁻¹在560海里)。

2.13.2。共轭二烯烃

共轭二烯烃的分光光度检测执行根据Recknagel和Glende[描述的方法53]。得到光谱寄存器之间的300和220海里和减去空白频谱纯环己烷。共轭二烯烃显示一个典型的吸收带的范围230 - 240 nm。结果表示为相对光密度单位(UDO) / mg线粒体CL。

2.14。统计分析

所有值代表10老鼠化验一式三份的意思表示为平均值±标准偏差(SD)。数据分析通过方差分析+图基测试借助SPSS 11.0.1软件(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。免疫印迹分析获得的乐队,我们使用了图像J图像处理软件(美国国立卫生研究所)。结果也用σ科学绘图软件绘制和分析从σ化学(版本11.0)。有限公司(圣路易斯,密苏里州)。统计学意义()的差异是由上标字母表示(值与它们之间不同的字母是统计不同)。

3所示。结果

生长参数(最终体重增加,体重,食物效率比,等等)显示实验组之间无显著差异(数据没有显示)。同时,取水实验人群基本上是相同的,这是一个理由认为老鼠没有注意补充水的适口性差而nonsupplemented。同样的情况发生在固体食物。

3.1。铜含量线粒体悬浮液

原子吸收测量表明,总铜含量消化线粒体中止实验人群之间没有显著性差异。然而,皮质的平均值高于海马(与g / mg线粒体蛋白质,职责)。

3.2。Nonceruloplasmin-Bound铜(NCBC)和血浆铜蓝蛋白(CP)浓度

图1(一)显示免费的铜的浓度(表示为NCBC)在血浆和脑区进行了分析。等离子体和海马显著增加铜和CuCho治疗后与对照组相比。在皮层中,我们观察到无显著差异。

我们也分析了CP在等离子体浓度,皮层和海马后实验饮食(图1 (b))。CP铜后显著增加,CuCho补充在等离子体和两个脑区。从CuCho饮食喂养的大鼠皮质和海马还显示显著增加对铜单独治疗。

3.3。饮食对线粒体膜物理化学性质的影响

图2展示了曹之间的比例和总磷脂(总无机磷酸盐或π)在皮层和海马。在这两个大脑区域,铜治疗产生了显著增加这个比例。补充与赵和铜+曹(CuCho)也产生显著提高Cho /π比率控制或铜相比单独治疗。

线粒体膜电位的估计是荧光测定的聚合度JC-1染料从大脑皮层和海马线粒体悬浮液(图3)。补充与铜本身没有产生显著变化在海马和离散虽然在皮层膜透性显著增加。在这两个大脑区域胆固醇补充也产生了很明显的完整性损失时更明显脂质与铜有关饮用水中(特别是在海马)。

3.4。谷胱甘肽含量和脂质过氧化作用的生物标志物

曹和CuCho治疗线粒体总量显著减少谷胱甘肽(谷胱甘肽+ GSSG)在这两个大脑区域控制数据和补充与铜相比(图4)。在海马皮层降低更明显。添加无机铜饮用水没有产生显著变化的对照组。

图5显示两个产品的浓度的CL脂肪酸氧化,时(LPOO)和共轭二烯烃(数据5(一个)和5 (b)、职责)。显著增加LPOO观察铜后除了在海马和皮层控制数据。曹治疗在这个生物标志物在海马产生明显降低。非常显著增加观察CuCho治疗对补充与铜或单独秋这两个大脑区域。铜和CuCho治疗后,共轭二烯烃的含量也高于控制数据在海马和皮层。

3.5。心磷脂(CL)和Lyso-Cardiolipin在线粒体悬浮液(拼箱)的内容

图6(一)显示了线粒体CL的总浓度μ摩尔的无机磷酸盐(π)/毫克的蛋白质。铜处理后,氯含量下降在这两个大脑区域分析。Cho-supplemented饮食增加了CL在皮层和海马,而cosupplementation铜和赵没有产生显著变化对控制饮食。图6 (b)后显示的水平lyso-CL(拼箱)饮食治疗。所有饮食诱导浓度显著增加拼箱相比,海马和皮层控制数据;然而,更高的增加观察治疗组与铜(单独或结合Cho)。

3.6。线粒体膜微粘度明显

分离线粒体内外膜为他们检查明显microviscocities使用两个荧光探针(衰变时或者TMA-DPH),探讨脂质双分子层的不同区域。数据7(皮质)和8(海马)显示值的各向异性具有负相关性(内部和外部)膜流动性。在大脑区域和与探针测试,我们观察到流动性降低,增加荧光各向异性产生的胆固醇补充单独或结合铜。

3.7。程序性细胞死亡生物标志物

尽管伤害中观察到内线粒体膜的完整性(JC-1测量),我们没有发现任何显著增加Cyt C细胞溶质分数的唯一例外slight-although显著增加同时从大鼠大脑皮质接受铜和曹(数据没有显示)。同意这一发现,caspase-3活动没有明显修改任何实验组(表中1)也没有任何重大变更伯灵顿/ Bcl2比率(图9)。

3.8。生物标志物的神经退化

表2显示了一个β第1 - 40(1-42)/()比在等离子体和皮层和海马神经退行性病变匀浆作为一种生物标志物。铜或赵治疗产生显著增加在这个生物标志物在大脑皮层和CuCho协会产生了更多的显著增加。赵补充增加了比在海马体价值区别观察治疗同时铜和赵。这些变化并没有反映在边缘等离子体。

4所示。讨论

不恰当的饮食铜和胆固醇摄入量是与阿尔茨海默氏病的发展。本研究遵循先前的实验证据报告饮食的影响铜和曹操作pro-neurodegenerative导致在动物模型。

无机铜升高的影响,赵,或两者的结合饮食(2个月)大幅修改线粒体功能。结果表明,这些膳食补充剂能够增加氧化损伤的大脑皮层和海马(大量增加时和共轭二烯烃的心磷脂小分支),增加比例Cho /磷脂,因此减少mGSH的浓度,降低膜电位,修改心磷脂的比例和lyso-derivatives,改变内在和外在的线粒体膜流动性,增加一个β第1 - 40(1-42)/()比例。

众所周知,铜在人体的新陈代谢受到严格监管控制。通常在人血浆总铜的浓度(由美国和其他组织)的范围0.3 - 2.1 mg / L摄入铜1.4至2.0毫克/天(16]。然而,铜的数量没有绑定到血浆铜蓝蛋白(NCBC)很低,已经与一些相关的神经退行性疾病的特点,如广告(16,17]。胆固醇也与病原学或相关的风险增加发展广告(54- - - - - -57]。因此,我们的实验系统设计探讨可能的合作这两个因素在促进神经退化、关注他们的角色在线粒体的功能。线粒体功能障碍由于ROS生产过剩和/或膜的物理化学性质的改变(主要是脂质成分)据报道,在广告的发展的主要因素,为早期在疾病的进展25- - - - - -27]。

在讨论的有效性和/或限制我们的实验系统,有必要考虑补充的水平与铜和曹和代谢的特点这两个膳食补充剂。对铜过载使用口服,我们的实验条件是基于以前的工作23,24),类似于铜水平常见结果的暴露在空气中,食物,和水污染8,58- - - - - -60),摄入的膳食矿物质补充剂,专业从事农用化学品的活动(9- - - - - -12)或女性子宫内可见光谱线的用户设备(13,14]。在老鼠的研究表明,铜代谢和体内平衡与人类本质上是相同的61年]。同样,口服补充赵被选中之前其他研究者的实验的基础上(22- - - - - -24),等离子体曹集中代表了大约30%的增长在中值获得了对照组。在人类经常发现增加dyslipemia [62年]。我们选择治疗时间相当于大约6年人类的条款,因此假设实验暴露条件合理可以外推到人类。已知的脂蛋白的代谢差异老鼠而不是人类可以被认为是限制这样的假设,但这可以考虑在其他实验模型(兔子或仓鼠,例如)。重要的是要记得,老鼠非常独特的甾醇代谢,因为在其他物种研究之前(兔子,天竺鼠,仓鼠,松鼠猴)肝脏显示一个二次函数,定量而肝外组织中发挥重要的作用在整个动物甾醇生物合成和代谢63年]。

在这里使用的微量铜补充没有大幅修改线粒体内的金属的浓度与皮层和海马。然而,两个月的治疗后,我们观察到CP浓度的增加在这两个大脑区域在这些实验团体收到铜。我们主要属性增加促炎反应条件Cu-induced诱导的氧化应激中描述我们的以前的工作64年]。我们无法测量NCBC内部纯化的线粒体分数主要由于缺少CP或中这种蛋白质的存在数量超出我们的测量方法的检测。然而,在血浆和全匀浆我们发现NCBC增加了铜政府即使在这里使用的少量。与此同时,CP浓度也高于所有样品除了皮层,这可能有一个强大的自我平衡的系统来控制铜的水平。与之前的研究相一致,Das et al。65年)报道,增加免费的铜(NCBC)刺激通过激活AP-1 CP的表达。

实验饮食也产生了重大改变线粒体脂质成分的分数。铜补充增加了Cho /磷脂Wistar鼠皮层和海马的比例。这种增长是曹或CuCho加法后更加明显。这些变化显然必须与修改相关的代谢(吸收、生物合成和/或退化)的两种亚型的脂质。说明这些影响还有待调查,打开一个新途径的研究潜在的重要性在寻找治疗目标神经退化过程。由于上述变化,我们观察到线粒体膜的物理化学性质的重要修改。跨膜电位的改变在铜和铜+ Cho-treated老鼠。此外,线粒体膜的表观microviscocity(内部和外部)是由赵和CuCho治疗发生了深刻的变化。广义的形式和广泛的损害增加渗透率(JC-1)和rigidization主要是通过两个探测器的使用大大不同能力的脂质双分子层勘探(衰变时和TMA-DPH)。这些发现与之前报道的数据协议将膜流动性的损失与曹/π比率的增加(66年]。这些变化的相关性从生理的角度。众所周知,许多膜蛋白功能包括运营商、酶和受体等,可以调节膜的微环境在嵌入式(66年]。由于活性氧过剩有关键作用的广告和其他神经退行性疾病(67年,68年),我们将专注于膜上的属性变化的可能后果线粒体氧化还原内稳态和程序性细胞死亡的可能激活信号。

线粒体谷胱甘肽(mGSH)被认为是抗氧化剂对线粒体功能和生存的关键。是主要的防线维护适当的线粒体氧化还原环境,预防或修复氧化修改可能导致线粒体功能障碍和细胞死亡。mGSH的重要性不仅在于其丰富而且在极端的多功能性,以抵消过氧化氢,脂质氢过氧化物,或外源性物质,主要是作为酶的辅助因子,如谷胱甘肽过氧化物酶或glutathione-S-transferase。许多cell-inducing刺激,如NCBC过剩或其他过渡金属,从而诱导氧化应激,减少mGSH的水平,使线粒体额外的侮辱(例如,多余的胆固醇组成的生物膜)(66年]。有趣的是,谷胱甘肽进入线粒体的运输是非常依赖于生理调节膜参数的维护,尤其是Cho /π比率和明显microviscocity内线粒体膜(66年- - - - - -70年]。dicarboxylate载体和2-oxoglutarate载体已被证明函数作为谷胱甘肽转运蛋白高度敏感的线粒体膜的理化状态(69年]。谷胱甘肽载体的活动是抑制膜流动性下降。同意这些事实,我们不仅观察减少mGSH Cho-supplemented老鼠也强烈的负相关mGSH和Cho /π之间比率在线粒体膜(图10)。铜补充也产生了Cho /π比率的增加,虽然不够明显修改膜流动性,使得它无法修改mGSH水平。

损耗的主要在线粒体抗氧化防御系统是直接增加了脂质过氧化反应有关。pro-oxidative环境明显促进了CL并刺激其氧化再生或重塑活动通过增加中间代谢物,lyso-CL (mono -在皮层和海马dilyso-CL)。符合这一点,我们发现高LPOO在孤立的CL小分支和共轭二烯生产铜添加与曹cosupplementation后更为明显(CuCho)。Peroxidized CL减少池中可用的CL线粒体,从而防止过渡孔隙的形成和随后的泄漏Cyt C细胞溶质。此外,氧化CL能够产生线粒体功能障碍,防止通过电子传递蛋白复合物(28,68年]。我们找到更低的线粒体CL铜处理后的内容与以前的观测大脑区域在协议的Yurkova et al。71年]。他们报告说,铜离子具有片段的能力CL与随后的磷脂酸的形成和磷脂酰丙酮醇在线粒体威尔逊氏病的小鼠模型。有趣的是,赵补充生产氯水平的增加可能通过一个ROS-dependent acyl-transferase-1活动的过度刺激(72年]。这一事实没有显著变化对控制老鼠CuCho下观察治疗可以解释的代偿机制,以抵消由铜和赵建立相反的影响。

曹浓缩线粒体膜的其他重要的后果。改变线粒体膜的物理性质,如衰变时显示的反应和TMA-DPH探针,可以修改线粒体动力学,为维护线粒体的完整性至关重要和功能包括能源生产、ROS生成和凋亡调节(26- - - - - -31日]。修改在嵴线粒体动力学导致结构性变化形成和电子转移复合物的组装,妥协生物能疗法,导致钙dyshomeostasis,增加氧化应激(mGSH消费),线粒体DNA损伤,和突触功能障碍(28- - - - - -30.]。

我们有提到pro-oxidative条件引发CL过氧化反应,因此减少了CL的能力加入蛋白质像Cyt蒙特罗c . et al。73年)和Eckmann et al。74年)强调,尽管只有15%的Cyt C强烈束缚CL,少量的的氧化磷脂可能引发的动员Cyt C从线粒体内膜膜间隙,然后细胞溶质。然而,我们没有发现显著变化在Cyt C释放到细胞质中任何治疗,除了CuCho除了大脑皮层。伯灵顿也没有显著变化/ bcl - 2比例和caspase-3活动,表明内在凋亡途径仍不显著激活。pro-oxidative条件可能引起铜和胆固醇,减少mGSH水平的浓缩,产生CL过氧化反应;然而,似乎破坏的程度不足以产生显著的刺激apoptosome caspase-3通路的形成和随后的激活(73年]。我们实验室正在研究的影响更延长曝光时间来调查这些实验治疗的慢性影响。

陆et al。24)报道,铜与相关联β老年斑,这个复杂可以招募曹分子,氧化,产生了更多的活性氧。尽管明显的激活proapoptotic级联,我们发现在增加β在大脑中形成,这是一个公认的生物标志物的退化。这些变化在皮层和海马没有反映在外围等离子,最有可能的,因为后者是较不敏感或治疗的持续时间是不足以影响之间的比例β第1 - 40(1-42)/()在周围等离子体,或两者兼而有之。氧化应激诱导的β积累在线粒体膜,导致结构和功能损害。淀粉样蛋白-β与线粒体蛋白相互作用β绑定酒精脱氢酶(ABAD)是调节在AD患者的颞叶βPP转基因小鼠(28]。这个复杂的防止败坏烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的绑定,从而改变线粒体膜透性(当我们观察到模型)和减少呼吸酶的活动引发ROS升高生产(28- - - - - -30.]。增加了β生产和β-ROS-dependent形成与其他重要问题如presequence蛋白酶的失活(预科),其中最重要的蛋白质参与β退化;改变线粒体动力学(以前讨论的);nitrosative应力增加;还有激活D(不可或缺的一部分渗透过渡孔注射或mPTP药物);突触的强化失败;和细胞骨架畸变等(26- - - - - -31日]。所有这些事实表明监控水平的重要性β生产不仅在当地(SNC)还在系统性(边缘等离子体)级别。

5。结论

我们的工作表明,膳食补充饮用水中微量的无机铜+赵补充固体食物导致氧化应激在大脑皮层和海马的损耗mGSH逆Cho / Pi-dependent时尚;CL过氧化反应和刺激的改造路线;主要改变线粒体膜的完整性和流畅;和更高的β第1 - 40(1-42)/()比例作为神经退化的生物标志物。这些变化可能是添加剂和导数的更长期暴露在proapoptotic级联激活。正在进行的研究将对目前的结果的真正意义,建立亲密的机制这两个常见因素诱导的损害(铜和曹过载)与一个视图定义潜在在高危人群的预防策略。

缩写

铜:	铜
肤色线:	心磷脂
CP:	血浆铜蓝蛋白
赵:	胆固醇
LPOO:	时
mGSH:	线粒体谷胱甘肽
ROS:	活性氧物种。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

信息披露

所有作者披露任何财务和个人关系与他人或组织不当影响这项工作。

确认

本研究支持拨款Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas CCT-CONICET皮普没有。0697年,UNLP / m - 145。作者要感谢诺玛Cristalli女士,克里斯蒂娜•Pallanza女士,女士Eva Illara de Bozzolo优秀的技术援助。

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