减少铜在阿尔茨海默氏症的大脑主要是可溶性可榨出的分数

文摘

阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆的主要原因,是一个重要的全球经济和社会负担。过渡金属的作用,特别是铜(铜),广告已成为重要的利益由于dyshomeostasis这些基本要素,可以传授深刻的对细胞生存能力和神经功能的影响。我们测试的假设有一个系统性的扰动在广告铜划分中,大脑内以及在外围,特别在红细胞内。我们的研究结果表明,之前报道的减少铜在人类的额叶皮质是局限于可溶性()和总匀浆()分数。没有观察到的差异在红细胞铜浓度。我们的数据表明,有一个大脑特定的变更广告本地化铜含量提取的可溶性物质,这并不反映在红细胞上。利用metalloproteomics方法进一步研究能够阐明代谢机制(s),结果在大脑铜水平降低广告的发展。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆的主要原因在老龄化和代表了越来越多的健康流行1]。尽管进步在理解事件导致认知能力下降,广告的主要原因仍是待定。铜的作用(铜)、铁(Fe)和锌(锌)的广告已经成为重要的利益,因为dyshomeostasis必需微量元素已经观察到对细胞生存能力和神经功能产生深远的影响2,3),之前审查(4]。

铜、一个至关重要的元素在中枢神经系统(CNS),对生命至关重要,但其独特的氧化还原倾向呈现它有毒的情况下增加不稳定的物种(5- - - - - -8]。铜通路中的特定病变可导致严重但可治疗神经损伤,包括门克斯和威尔逊氏病(9- - - - - -11]。铜显示一个明显的区分分布在整个大脑,反映了其不同的功能在各种神经过程12,13]。

在中枢神经系统内,铜已知的减少额、枕叶,顶叶(14在广告中杏仁核和海马15]。这种衰退的过程不是很好理解,但胞外聚合的淀粉-β(一个β)据报道,富含微量元素包括铁、锌和铜16]。最近也报道,额叶皮层从广告对象绑定可交换的倾向增加铜、与氧化损伤中观察到的组织(17]。

脑脊髓液(CSF)、铜水平没有观察到显著不同浓度在广告和健康对照组(HC) [18- - - - - -20.]。然而,在外围流体,研究铜dyshomeostasis更加强烈。增加的报告(19,21],[下降22,23),或保持不变24- - - - - -26血清或血浆铜在广告也呈现总铜水平变量的诊断实用程序,审查[27]。然而,许多研究得出的结论是,有一个微妙但一致超过nonbound或扩散性的血清中铜(21,22,28- - - - - -34]。尽管如此,一个共识已经被缺乏标准化和限制由协变量影响外围“高在“铜浓度的筛选35]。在其他的外围组织,如红细胞超氧化物歧化酶1 (SOD1)消失在广告活动被发现23]。这被认为是由于铜酶缺乏症,先前报道(36]。

在这项研究中,我们测试的假设有一个系统性的扰动在铜划分广告,在额叶皮层以及外围,红细胞内。

2。方法

2.1。主题

AIBL研究了纵向神经成像,生物标志物,neuropsychometric,和生活方式的数据,看到37方法的详细描述)。短暂,参与者年龄在65年,英语流利被分成三个组;认知健康个体(HC),参与者患有轻度认知障碍(MCI)的基础上,建立了标准(38,39),参与者被诊断为可能的或可能的广告NINCDS-ADRDA所定义的标准(40]。从所有参与者获得书面知情同意,这项研究是通过适当的机构伦理委员会。

2.2。红细胞制备

全血收集从通宵禁食参与者27 g针,到Sarstedt S-Monovette Lithium-Heparin 7.5毫升管(01.1608.100)。管子在3200 g×30分钟旋转在室温条件下,等离子体是小心翼翼地从比容。淡黄色的外套是由聚蔗糖梯度离心提取白细胞。erythrocytefraction洗3次通过添加0.9%生理盐水结束大约14毫升的体积。红细胞被轻轻地倒相管分散10倍然后在650×g离心10分钟20°C和制动。最后离心是1500 g×10分钟20°C和制动。最后的盐水洗是丢弃,红细胞resuspended结束的6毫升磷酸缓冲盐(PBS) (pH值7.4),然后整除到聚丙烯(Nunc精子银行,丹麦)管和snap-frozen液氮。

2.3。分馏的脑组织进行生化分析

脑组织从维多利亚时代的大脑获得银行网络,和所有实验通过墨尔本大学的健康科学,人类伦理委员会(ID1136882)。把冷冻的大脑在−80°C解冻1厘米−20°C和分组片。脑膜被移除的大约5 g的额叶皮质(9),和灰质在0.2 - -0.5 g整除解剖,储存在−80°C。灰质是允许在冰上融化,然后使用一个均质BioMasher(泛光灯国际)。组织被BioMasher,柱塞插入,然后设备离心机在100000×g台式离心机。三羟甲基氨基甲烷缓冲液离心后,盐水(TBS, 50毫米三pH值8.0,150毫米氯化钠)包含EDTA免费的蛋白酶抑制剂(罗氏,05056489001)的比率增加了1:4(组织:缓冲、w / v)。样品然后转移到离心器管和离心机在100000 g×30分钟在4°C。TBS上层清液,或“可溶性”材料,收集并存储在−80°C免疫印迹分析。100毫米的颗粒是resuspended纳科₃pH值11.0(1:4、组织:缓冲区),进一步离心机在100000 g×30分钟在4°C。浮在表面的,“外围膜/水泡”材料恢复,和颗粒是resuspended 7 M尿素,2 M硫脲,4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] 1-propanesulfonate(家伙),30毫米n -二甘氨酸pH值8.5,离心机在100000 g×30分钟在4°C。“膜”的材料,上层的恢复,在室温下产生的颗粒被孵化70%甲酸16小时前离心机在100000 g×30分钟。顺序提取后,仍没有可观察到的材料。

2.4。感应耦合等离子体质谱法(icp)

冷冻整除的红细胞或脑组织匀浆分数在室温下解冻。脑匀浆,50μL与950稀释(1:20)μL 1%的HNO₃(v / v)。50μL洗涤红细胞被消化的等效集中(65%)HNO卷₃和H₂O₂在80°C(默克密理博)5分钟,然后稀释1:20 HNO为1%₃。铜浓度决定使用一个安捷伦科技7700 x icp系统。进样系统使用聚四氟乙烯MiraMist并行路径喷雾器(Burgener研究Inc .)和标准Scott-type双向喷雾室(玻璃扩张)。氦用作气体碰撞。icp条件复制从我们实验室之前报道的研究(35]。仪器校准使用多元素标准(Accustandard, ICP-MS-2-1、ICP-MS-3 ICP-MS-4;共有44个元素)包含铜在0、5、10、50、100磅^89年Y作为铜的所有同位素的内部标准。Interday相对标准偏差测定使用质量控制血清(Seronorm)认证的铜(84.55水平μg / L 95%可信区间80.35 - -88.75μg / L),并一直在2.0 - -5.0%之间。

2.5。统计分析

统计分析与棱镜version 6.0 (Graphpad Inc .)。比较两组之间的差异,使用单向方差分析Bonferroni多重比较测试。重要的值< 0.05。

3所示。结果

表1和图1表明,铜在人类的变化额叶皮层局部溶性分数。我们观察到明显降低在总铜水平与以前的研究一致14,15]。调查如果铜是全局或局部的变化到一个特定的细胞间,我们分离了脑组织分成四组:可溶性,边缘膜、膜和多孔材料,积分和甲酸可榨出的材料,主要含有不溶性斑块(41]。我们只观察到明显降低铜的溶性广告和HC(图之间的分数1,、单因子变异数分析Bonferroni多重比较检验)。表2显示了后期的大脑的人口样本。尽管我们做了观察铜在每一个下降的趋势,我们发现当铜被表示为一个百分比的总铜为每个单独的(图2),没有观察到显著差异,表明铜守恒平衡可能homoeostatically监管。我们观察到50 - 60%的可提取的总组织铜含量是本地化的可溶性物质(图2)。

先前的研究有关广告的具体变化红细胞(42,43),包括铜、铜依赖酶的变化Zn-superoxide岐化酶1 (SOD1) [23]。我们使用特征样本AIBL研究对红细胞的铜水平进行调查。表3显示了个人的AIBL队列人口统计分析为红细胞铜浓度。图3表明,红细胞的铜浓度没有显著差异之间观察到的广告和控制样品。

4所示。讨论

本研究的目的是调查铜的分布和浓度在额叶皮层和外围的广告主题与健康相比,控制样品。大量的研究表明,有一个显著的扰动在铜协调广告在额叶皮层(14,17,44和外围3,27]。使用良好的学科,我们无法证明在红细胞铜水平的显著差异,发现符合我们调查的血清铜水平(35]。然而,我们确实观察额叶皮层内的显著差异,让广告组织明显比对照组少铜(= < 0.0001)。这个观察是一致的额叶皮层有铜缺乏独特的敏感性,而外围。之前的研究使用分馏探讨微量元素在广告的大脑45),但缺乏铜浓度变化的数据。通过分馏大脑组织成几个生化截然不同的子单元我们观察到的减少铜主要局限于可溶性分数。可溶性分数的变化是一致的金属硫蛋白的报道缺乏广告的大脑(46),但需要进一步metalloproteomic调查确定的程度,铜蛋白质组是在公元神经病理学改变47]。令人惊讶的是,没有观察到显著差异在甲酸分数(图1),与我们的期望相反,广告斑块证明增加铜与先前的报道(48,49]。没有增加铜的甲酸分数突出使用空间解决技术的重要性来衡量组织微量元素的分布,包括x射线microfluorescence显微镜(50)和激光消融icp (51,52]。

我们已经表明,超过50%的铜在人类大脑组织中可以提取的可溶性或胞质部分匀浆。此外,大脑中观察到的广告变化是由于特定的可溶性阶段的变化。铜有很强的参与倾向自由基化学、铜的分布和交付是由一组精心控制铜特定蛋白质机械(13,53,54]。这个铜处理系统维持不到一个免费的铜离子每个细胞(55]。因此,基本上所有的铜被绑定到生物配体或铜的陪伴,调节蛋白。未来的调查使用metalloproteomic方法(56- - - - - -58)将能够确定可溶性铜含量的变化是特定的变化约束力的合作伙伴,如报道减少金属硫蛋白在广告(46]。铜存在管制十分严格,如结扎实体单元中,这将是有趣的调查如果可溶性铜是全球性的变化,建议所有Cu-proteins减少广告,或者是选择性的改变限制蛋白质。特别是,铜蛋白质的化学计量学的详细调查,如血浆铜蓝蛋白和金属硫蛋白亚型的三个报告,也将涉及铜扰动信息,可能导致中枢神经系统缺陷。

总之,本研究检验了两个池的铜广告相比,年龄匹配的高碳钢。我们发现有一个特定的额叶皮层的变化,表明有一个扰动铜稳态导致当地减少浓度。我们没有检测红细胞的显著差异,这表明铜干扰可能是局限于大脑的广告,从而排除外围铜水平作为广告的一个有用的生物标志物。协变量的时机、系统性和机制(s)的改变仍需系统调查,和先进的分析metalloproteomic技术将会在未来很长一段路要回答这些问题。

确认

这项研究得到了科学工业和捐赠基金(http://www.sief.org.au/),国家卫生和医学研究委员会(NHMRC)通过痴呆合作研究中心项目(DCRC2)和联邦科学与工业研究组织(CSIRO) (http://www.aibl.csiro.au/)。大脑组织从维多利亚时代的大脑获得银行。FINMH承认从维多利亚时代的政府资金支持的运营基础设施支持计划。辉瑞国际贡献与金融支持协助分析血液样本,进一步支持AIBL研究项目。作者还要感谢Neuroproteomics弗洛里和Metalloproteomics实验室研究所神经科学和心理健康。

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