脑脊液ERK1/2水平升高的证据在老年痴呆

文摘

脑脊液(CSF)样本33老年痴呆(AD)患者,21岁的轻度认知障碍患者转化为广告期间跟踪(MCI-AD),稳定的轻度认知障碍患者25 (MCI-stable)和16 nondemented科目(ND)进行了分析与化学发光免疫分析法评估增殖蛋白激酶的水平ERK1/2(细胞外signal-regulated激酶1/2)。结果评价与总τ(tTau)磷酸化τ(pTau)和β-淀粉样蛋白42肽(一种β42)。CSF-ERK1/2在广告组相比显著增加稳定的MCI患者和ND组。免疫印迹分析池脑脊液样本显示,这两种亚型,ERK1 ERK2,少量的双重磷酸化ERK2被检测到。预测诊断AD生物标志物,CSF-ERK1/2不如tTau, pTau,β42。

1。介绍

阿尔茨海默病是一种慢性神经退行性疾病,导致内存和其他高级皮层功能逐步下降(1]。潜在的神经病理分子变化显然是镜像的脑脊液(CSF)水平升高总τ(tTau)和磷酸化τ(pTau)和42β-淀粉样蛋白肽(浓度降低β42)。总τ的增加被认为反映神经元变性的强度,同时pTau可能表明Tau蛋白的磷酸化状态(进行审核,看,例如,2])。生物标志物可以补充临床疾病诊断目前主要基于功能症状,他们可能有助于识别高危个体处于疾病早期阶段或(3,4]。这将是特别重要的小说疾病修饰治疗可用之后,会产生最早期应用中受益。生物标志物,可靠地报告疾病病理生理过程也可能是有用的监测在临床试验中药物疗效。

一个早期事件发展的神经纤维的变化阿尔茨海默病的病理hyperphosphorylationτ(5]。底层的生化机制知之甚少,并提供更深的洞察力是高相关性的一个主题。提出了各种激酶可能牵连,其中之一是MAP激酶ERK2(了6,7])。在最近的一项研究中,我们演示了这种可能性来检测可溶性ERK1/2从患者脑脊液神经精神障碍,我们奠定了方法论基础CSF-ERK1/2量化与96 -电化学发光monoplex免疫测定(8]。作为一个试点研究的逻辑延伸,我们报告测量ERK1/2在老年痴呆患者的脑脊液样本33(广告),21个轻度认知障碍患者转化为广告期间跟踪(MCI-AD), 25稳定患者轻度认知障碍(MCI)稳定,和一个年龄引用队列()nondemented科目(ND)组成。

2。材料和方法

2.1。患者和对照组

研究过程都通过各自的当地伦理委员会,和病人或其法律护理人员给他们的知情同意。在基线,一个全面的病史,患者接受彻底的物理,神经和精神检查。每个病人的ct或MRI检查记录。老年痴呆(AD)的诊断根据NINCDS-ADRDA标准(9]。她被诊断为轻度认知障碍(MCI),根据彼得森标准(10),如果一个病人有一个客观的缺陷在一个或多个认知域(小于1,5 SD相比,一个年龄,性别,和education-matched控制队列),但其一般认知功能和日常生活的活动没有受损。

参与研究的受试者被分为四组根据临床和神经心理标准:(1)老年痴呆患者(广告,);(2)患者完成了彼得森MCI(标准10),转换为临床随访期间广告(MCI-AD,;30个月平均时间转换;范围:12-59月);(3)MCI患者在随访期间保持稳定(MCI-stable,;平均随访时间:43个月;范围:8 - 78个月);(4)nondemented个人中心指的症状或其他神经系统疾病进行腰椎穿刺诊断原因(头痛、怀疑脊髓病等)(ND))。ND组包括4个人(“控制”)进行症状,但后来发现神经健康,一个人完成了MCI诊断基线,但后来被发现是认知健康。生物标志物的临床诊断是盲目的结果。认知功能障碍的严重程度的评估,细微精神状态检查(MMSE)使用11]。MMSE分数不能用于7(16)的ND受试者没有显示记忆衰退的迹象,根据临床神经学检查,患者和4(33)的广告。作为额外的神经心理学测试,MODA痴呆(米兰整体评估(12在佩鲁贾执行])。在Kuopio,一组不同的神经心理测试用于测试不同认知域。测试的完整列表已经被描述在其他地方(13]。神经心理学评估两个站点包含测试的内存,语言、视觉空间的技巧,注意,方向,和执行功能。文化节,用于佩鲁贾,此外包括表现日常生活的活动报道近亲属。

2.2。脑脊液样本

在意大利佩鲁贾的脑脊液样本收集()和Kuopio,芬兰()。通过腰椎穿刺脑脊液被和加工按照标准化程序所描述的其他地方(13- - - - - -15]。后脑脊液常规检测,一卷~ 10 - 12毫升的CSF收集在聚丙烯管和离心去除细胞。上层清液(CSF)整除,冻结在−在一个小时后取样80°C。包含超过500红细胞脑脊液样本μL(离心)之前被排除在分析之外。

2.3。ELISA的测量β42岁的总τ,Phospho-Tau (pT181)

脑脊液生物标志物ELISA测定方法(Innotest hTau-Ag, Innotest pTau181-Ag, Innotestβ淀粉样蛋白1-42,Innogenetics NV、绅士、比利时)。我们的测量进行Neurologica,佩鲁贾大学意大利和在《神经学部门,Kuopio大学芬兰。tTau pTau,β42数据收集在其他研究的背景下,这些生物标志物的结果已经出版之前,至少在部分(13,16- - - - - -18]。在当前的研究中,这些tTau pTau,β42个数据评估与当前ERK1/2测量。

2.4。ERK1/2电化学发光Monoplex化验

ERK1/2人类CSF与monoplex测量总ERK1/2完整的细胞溶解产物96 -电化学发光分析(美国马里兰州盖瑟斯堡内消旋规模发现)基本上如前所述[8]。测量ERK1/2脑脊液样品,收到干冰冷冻和储存在−80°C,解冻,整除,refrozen−80°C。立即测量前,CSF整除第二次解冻,和111年μ每个样本和18.7 LμL分析缓冲区的集中(最终浓度的测定:100毫米氯化钠,20毫米Tris-HCl, pH值7.5,1毫米EDTA, 1毫米EGTA, 1% Triton x - 100,加蛋白酶抑制剂,和磷酸酶抑制剂(请注意,在我们之前的描述分析过程,最后添加氯化钠浓度被错误地显示为150毫米(8])。重复读取,50μL每口井进行了分析与默沙东公司总ERK1/2 monoplex试验根据制造商的指示。产生的1.17倍稀释的化验缓冲区被认为是集中的计算ERK1/2浓度。获得一个合适的参考标准曲线,计算样品重组激活His-tagged ERK2 (Calbiochem)最初上升到汇集人类脑脊液样本的浓度480 ng / mL (“CSF-stabilized ERK2股票解决方案”)。先前的观测表明,重组活化激酶在这些条件下相对稳定,这样可以存储在整除−80°C。从这ERK2 CSF储备溶液,连续稀释(250 - 16000倍)准备在1 x分析缓冲区(见上图)和以一式三份1 x分析缓冲区。每个试验板的标准曲线计算MSD发现工作台3.0软件。检测下限(LLOD)被定义为3个标准差(SD)高于空白信号(平均每个板的3空格)。9的95份脑脊液样本研究,ERK1/2测量(意味着重复读取)低于各自的相应LLOD试验板。作为一种手段,包括他们的统计诊断组之间比较,这些样本报告39 pg / mL的任意值对应于脑脊液浓度略低于平均LLOD。当分析ERK1/2和年龄或古典CSF生物标志物之间的相关性,下面的9 ERK1/2测量LLOD被排除在外。

2.5。统计分析

与GraphPad Prism 5.01软件统计测试执行(美国加州La Jolla GraphPad软件有限公司)。非参数测试(克鲁斯卡尔-沃利斯检验之后,邓恩的多重比较检验和斯皮尔曼相关测试)被应用在大多数情况下,因为D 'Agostino-Pearson综合K2测试表明,一些分析物并不遵循正态分布。一定程度的被认为是具有统计学意义。实际的水平给出描述性的目的。

2.6。初步分离池CSF和样品制备

为了方便后续的免疫印迹分析,汇集CSF prefractionated等电点聚焦。十个人广告,non-AD患者脑脊液样本的总和。3.25毫升的CSF池与10 x蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和混合10 x磷酸酶抑制剂鸡尾酒(完整的微型和PhosStop,罗氏)收益率1 x抑制剂浓度。缓冲交换到“off-gel补液”(7 M尿素,2 M硫脲,1% (w / v)德勤,0.5% (v / v) Pharmalyte)和浓度的样品~ 100的最后一卷μL, Vivaspin旋转实现了集中器(500μL, 000 MWCO,缝匠肌Stedim哥廷根)根据制造商的协议。补液的解决方案是添加到集中样本的最终体积2毫升,和蛋白质分离根据他们的等电点(π)3100 off-gel分馏塔(安捷伦)。的等电点聚焦了50的最大电流μpH值为20.000 vhr 13厘米长3 - 10 IPG条(通用电气医疗集团)。结果12分数,这些覆盖pH值8.5 ~ 6.5 - ~汇集。这样,大量减少白蛋白的实现,促进进一步分析。prefractionated样本中的蛋白质和三氯乙酸沉淀和desoxycholate。短暂,样本与钠混合desoxycholate达成最终浓度为0.02%。30分钟后孵化在冰上,三氯乙酸是添加到最终浓度为15%。额外的小时冰后,样本离心机在16.000 g和4°C为30分钟。最后,小球被冰冷的丙酮和风干的两倍。sds - page,颗粒溶解在60μL样品缓冲(62.5毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值6.8,2% (w / v) SDS, 10% (v / v)甘油;德勤约100毫米;0.005% (w / v)溴酚蓝)与搅拌10分钟在95°C。

2.7。sds - page及免疫印迹

蛋白质分离12% T / C SDS-polyacrylamide凝胶(2.7%19),然后涂抹在PVDF膜(微孔)半干转移的恒流1 mA /厘米²60分钟25毫米三,192毫米甘氨酸,20% (v / v)甲醇(20.]。2% ECL的膜被封锁推进阻滞剂(通用电气医疗集团)在PBS / 0.075% Tween-20 (PBS-T) 45分钟和孵化一夜之间在4°C抗体稀释在屏蔽解决方案。以下使用抗体:兔子anti-ERK2(碳14)sc - 154(圣克鲁斯生物技术)(稀释100 ng / mL)工作;兔子anti-ERK1 / MAPK3 (RnD系统)(稀释250 ng / mL)工作;单克隆anti-MAP激酶激活(克隆MAPK-YT)(σ)(稀释工作1:1000)。第二天,膜与PBS-T洗和孵化1 h与horseradish-peroxidase-coupled二级抗体室温。与PBS-T洗涤后,这些墨迹开发与ECL-plus化学发光底物根据制造商的指示(通用电气医疗集团)和可视化inta成像仪(inta,哥廷根,德国)。

3所示。结果

3.1。诊断组,人口数据、MMSE分数和脑脊液生物标志物

的人口数据的摘要4诊断小组在调查中,意味着MMSE评分和中等水平的脑脊液生物标志物tTau, pTau,β42所示表1。方差分析测试表明,平均年龄在4组之间没有显著差异()。tTau CSF水平(等级数目)和pTau明显广告——MCI-AD组高于MCI-stable和ND组(克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的多重比较测试)。一个β42在广告和MCI-AD患者显著低于MCI-stable和ND科目(补充信息,参见图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.4061/2011/739847)。

3.2。量化的ERK1/2 CSF

ERK1/2浓度的脑脊液样本量化总ERK1/2 monoplex电化学发光分析。连续稀释的标准曲线计算出测量分析缓冲区的“CSF-stabilized”ERK2原液(见材料与方法)。试验的检测下限(LLOD)被定义为3个标准差(SD)高于空白信号。4试验板使用,LLODs被计算为31.1 pg / mL, 31.4 pg / mL, 40.5 pg / mL,和31.7 pg / mL,分别(意味着LLOD±SD:pg / mL)。考虑到1.17倍稀释的脑脊液样本的化验所产生的缓冲集中在测量之前,的意思是LLOD化验与39.4 pg / mL的ERK1/2浓度稀释CSF。总的来说,在这项研究中,95年脑脊液样本包括在分析中。对原始信号计数,变异系数(CV)之间的重复读取是平均的(平均数±标准差)。各自的重复读取之间的最大的简历(原始信号计数)观察到在整个样本为10.3%,表明一个可接受的技术分析性能。然而,值得注意的是,有关单独计算的不精确复制CSF-ERK1/2浓度是更高(CV±SD:,;下面的测量水平意味着计算ERK1/2 LLOD被排除在外)。

3.3。4 CSF-ERK1/2水平诊断组

比较之间的CSF-ERK1/2水平4诊断组,那些9样品CSF-ERK1/2测量(意味着重复读取)低于各自的试验板LLOD报告在人为设置的价值39 pg / mL。这对应于一个脑脊液浓度略低于均值LLOD(见上图)。作为一个群体,AD患者显示CSF-ERK1/2浓度显著高于nondemented个人()和稳定的MCI组(邓恩,克鲁斯卡尔-沃利斯检验的多重比较检验)(图1)。浓度中位数ERK1/2 MCI-AD组之间在AD患者和稳定的MCI / ND队列。然而,如图1,我们观察到一个清晰的组织之间的重叠。结果,组对比MCI-AD MCI-stable, MCI-AD和广告,MCI-AD和ND, MCI-stable和ND没有显示显著差异(克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的多重比较测试)。此外评估是否大MCI-stable之间的重叠和MCI-AD组可能归因于MCI-stable科目在我们的样例随访时间相对较短,我们与预定义的重复计算最小MCI-stable 24和36个月,随访时间。再次,只有广告和MCI-stable以及广告和ND组差异达到统计学意义(克鲁斯卡尔-沃利斯检验邓恩的多重比较期末测验)(数据没有显示)。

调查可能的诊断相结合的附加值CSF-ERK1/2水平与古典脑脊液生物标记,我们比较我们当前的结果与tTau脑脊液浓度,pTau,β42。pTau脑脊液浓度和tTau彼此有紧密的关联(斯皮尔曼测试(图)2(一个))。之间的显著相关性ERK1/2 tTau和ERK1/2 pTau观察,当考虑整个示例(图2 (b)),而这样的相关没有达到统计学意义的任何诊断组。CSF ERK1/2水平是负相关的β42在整个样本和广告组。非参数斯皮尔曼相关分析的总结ERK1/2与tTau pTau,β42所示表2。

CSF的测量生物标志物tTau, pTau,β42个已知显示不同的中心(很大程度上的差异21]。当我们执行单独的相关性分析2中心参与本研究,观察显著负相关性ERK1/2和之间β42个样本的两个站点时没有应用分类分为诊断组,并从Kuopio广告组。ERK1/2 tTau以及ERK1/2和pTau彼此密切相关的样本佩鲁贾当所有受试者认为,但不是在任何诊断组本身(补充信息,表S1)。

3.4。与MMSE CSF-ERK1/2的相关性

84年的受试者纳入本研究(广告:MCI-AD:MCI-stable:ND:),MMSE分数作为认知功能的测量。77年与计算这些CSF-ERK1/2浓度高于LLOD受到相关分析。在整个样本,CSF-ERK1/2显示统计学意义与MMSE分数(图-斯皮尔曼相关3(一个))。当广告、MCI-AD, MCI-stable组分别进行了分析,一个重要的观察-斯皮尔曼MMSE评分之间的相关性和CSF-ERK1/2 MCI-AD组(图3 (b)),但不是在广告组或稳定的MCI患者(数字3 (c)和3 (d))。

3.5。-操作者特性曲线

评估的可能性使用CSF-ERK1/2水平相关诊断组之间的歧视,-操作者特性曲线(ROC曲线)计算。图4(一)显示了ERK1/2 ROC曲线、tTau pTau,β42 ND歧视的广告,图4 (b)从稳定的MCI MCI-AD的歧视。曲线下面积计算(auc)表明,单一生物标记tTau pTau,β42明显优于CSF-ERK1/2。

3.6。免疫印迹分析Prefractionated CSF

提供额外的信息关于ERK1/2同种型(s)对检测到的信号ERK1/2电化学发光分析,合并脑脊液样本被off-gel prefractionated等电点聚焦,以方便后续的免疫印迹分析。pH值的分数范围从6.5 ~ ~ 8.5被SDS-polyacrylamide-gel组合和分离电泳免疫印迹紧随其后。调查小组的anti-ERK抗体显示ERK1, ERK2,双重磷酸化ERK2汇集人类CSF(图5)。乐队的视觉比较强度与同池脑脊液溶菌产物从SH-SY5Y细胞加载是一个积极的控制建议ERK2比ERK1更丰富。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们证实了我们之前发现的可测量的水平MAP激酶ERK1/2人类CSF (8),应用的方法建立在以前的工作评价CSF-ERK1/2浓度与样品包括AD患者,MCI患者转化为广告在跟踪(MCI-AD), MCI患者保持稳定,nondemented引用队列。作为一个群体,AD患者显示CSF-ERK1/2水平显著高于MCI-stable组和nondemented引用队列。个人ERK1/2浓度大量重叠显示的脑脊液样本诊断组,和作为一个单一的生物标志物,CSF-ERK1/2显然不如经典广告生物标记tTau pTau,β42,从中华民国曲线如图就是显而易见的4。

符合出版生物标志物的研究(4,22),在我们的示例中,一个β42岁的tTau和pTau CSF在基线显著改变的MCI患者后转化为广告(补充信息,图S1)。这对于CSF-ERK1/2并非如此。在广告组,但不是MCI-AD病人,CSF-ERK1/2在统计学上显著升高和ND和MCI-stable组。因此,看来CSF-ERK1/2的增加可能发生在稍后的阶段比tTau和pTau疾病。在整个样本,CSF-ERK1/2 tTau与脑脊液浓度显著相关,pTau和负相关β42。ERK1/2之间的相关性和tTau在我们之前的研究中也发现了一个小组患者的脑脊液样本不同的神经精神障碍(8]。一个简单的解释可能是,蛋白质都是在平行当神经元退化。然而,观察ERK1/2与τ在整个样本之间的相关性在我们目前的研究不是特别强(枪兵相比pTau和tTau)之间的关系,这两个之间的关系尚不具备统计学意义的诊断组织本身。获得更多的详细信息是否CSF-ERK1/2增加广告代表简单神经破坏除了τ的另一个标志,或者如果可能不同的细胞群或不同的潜在的分子机制反映,它可能是有趣的测量CSF-ERK1/2患者其他non-AD神经退行性疾病。在最近的一项研究中,一个显著的CSF水平之间的相关性tTau ERK1/2并没有观察到克雅二氏症患者(23]。有趣的是,在我们目前的研究中,我们发现了一个负面的基线CSF-ERK1/2协会和MMSE分数MCI-AD组。可以证实这些发现提供一个更大的样本,并可能还与其他认知功能的措施,我们相信,我们的初步结果表明,CSF-ERK1/2发生的变化比τ和以后β42。人能因此推测,从长远来看,CSF-ERK1/2感兴趣的可能是作为生物敏感疾病进展在MCI阶段。ApoE基因型是否影响CSF-ERK1/2水平必须保持开放以来在这个阶段将需要更大的样本容量合理的统计学评价。

增殖蛋白/细胞外signal-regulated激酶ERK1和ERK2随处可见组件细胞信号转导途径的调节不同的下游流程,包括增殖、分化、生存和凋亡[24,25]。在成年人的大脑,erk大量表达,参与活动依赖性神经元功能的规定,如突触可塑性、长期势差,长期抑郁,和细胞生存(评论,看到26- - - - - -28])。所有三个增殖激酶(MAPK)通路,物和p38通路报道,ERK在脆弱的神经元被激活广告提出了大脑和发病机制中发挥重要作用[29日]。同意的观察脑脊液从克雅二氏症患者23),我们证明此两种亚型的存在,ERK1 ERK2,在池脑脊液样本。在老鼠大脑,这些2 ERK亚型的地区分布差异报告(30.]。我们进一步证实了我们之前的发现(即检测到大量的激活。双重磷酸化)的ERK2池脑脊液。获得进一步的洞察致病性和分子病理生理变化,这可能是特别有趣的在将来的研究中解决的激活状态ERK1/2 AD患者的脑脊液。必不可少的先决条件的研究,然而,将可用性的高度敏感和可靠的测量双重磷酸化ERK1/2化验。

综上所述,我们在这里报告一个AD患者显著海拔CSF-ERK1/2相比ND和MCI-stable科目。预测诊断工具,CSF-ERK1/2原来不如“古典”CSF生物标记tTau, pTau,β42。虽然我们的研究结果需要在将来的研究中得到证实和扩展,观测结果表明,ERK-1/2水平的增加可能发生在疾病后期开发或比tTau的变化发展,pTau,β42在脑脊液。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者想表达真诚的感谢和感激已故教授Tuula Pirttila导致本研究通过提供脑脊液样本和临床信息。技术支持,他们感谢克里斯蒂先生Spaccatini(意大利佩鲁贾大学)。这项工作是支持的欧盟赠款cNEUPRO(合同编号。利- ct - 2007 - 037950)和neuroTAS(合同编号。lshb - ct - 2006 - 037953)和格兰特纯(蛋白质研究单元鲁尔在欧洲)从北莱茵-威斯特法伦州的州政府。j . Wiltfang H.-W。Klafki同样对本文亦有贡献。

补充材料

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