检测可溶性淀粉样蛋白-脑脊液寡聚物和不溶性高分子量粒子:发展的方法与潜在的阿尔茨海默病的诊断和治疗监测

文摘

可能的诊断阿尔茨海默病(AD)可以建立基于临床标准premortem像神经心理测试。在尸检时,淀粉样斑块定义广告等特定的神经病理变化。然而,标准的标准基于病史和精神状态检查不考虑长期疾病的临床特征,和生物标志物来提高诊断的广告是迫切需要的。在大量的研究中,淀粉样蛋白-β(一个β在AD患者的CSF)单体浓度一致,与健康对照组相比显著降低。因此,单体的βCSF中被认为是一个有用的生物标志物,为临床的诊断。然而,不是单体的形式,而是一个β寡聚物已被证明是有毒的物种在AD病理及其量化和描述可以促进广告诊断和治疗监测。在这里,我们审查的现状分析开发可靠,定期检测β在脑脊液寡聚物和高分子量粒子。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是一种有害的神经退行性疾病和痴呆的最常见原因。广告导致记忆丧失和行为问题,导致灾难性的影响患者的生活和病人的亲属。据估计,全球大约有2700万人受到影响。衰老是广告的主要危险因素之一,人们年龄的稳步增长,预计困苦人的数量到2050年quadruble [1]。

淀粉样蛋白-β(一个β)肽已被确认的病理中发挥重要作用。4 kDa肽,42个氨基酸残基组成的39,来源于蛋白质水解淀粉样前体蛋白(APP)的两种不同的蛋白酶,β- - -γ分泌酶(2- - - - - -4]。一个β与广告相关的主要成分是淀粉样斑块(5]。淀粉样蛋白级联假说认为,β聚合紧随其后的是斑块的形成是广告的核心事件(6]。今天,众所周知,diffusable和可溶性β低聚物的物种的主要有毒物种是广告。一个β寡聚物已被证明损害长期势差(LTP),减少树突棘的密度在海马脑片在体外和损害记忆在活的有机体内。纤维的β在斑块沉积表现出相对较低的毒性,和大脑中的斑块负荷并不相关症状的疾病进展(7- - - - - -10]。今天,诊断明确的广告需要临床诊断,根据临床症状的观察,和后期检测淀粉样斑块和神经纤维缠结,后者由聚合τ蛋白,病人脑组织的死者。可以建立诊断可能的广告“50%到90%确定依赖于临床标准,神经心理测试和实验室检测(11- - - - - -13]。第一个分子事件导致广告,像一个β齐聚反应和斑块沉积以及τ病理学,应该出现明显症状出现前10到20年(11- - - - - -16]。因此,提出了新的诊断标准研究,目的是将支持生物标记信息,例如,CSFβ和τ单体浓度、葡萄糖和淀粉样蛋白成像使用正电子发射断层扫描(PET)和核磁共振光谱(夫人)检测脑萎缩,允许更敏感和特定的诊断在临床前阶段的广告,也就是说,当症状不明显(17,18]。

直接或间接相关的生物标志物的病理生理改变广告可能是辅助诊断广告不同临床阶段。早期诊断将有助于治疗决策,目前大多数科学家都认为,广告将是最有效的治疗在疾病的早期阶段19]。目前,只有对症治疗的广告是可用的,但是一些化合物是目前正在开发,其中大部分是针对β例如,分泌酶抑制剂、免疫疗法β聚合抑制剂(19- - - - - -21]。超过10个化合物目前在临床三期试验,和几个阶段I或II。指PubMed,数以百计的化合物在临床前的状态。此外,生物标志物需要选择和描述患者参加临床研究以及监控候选药物的影响(22]。

各种研究表明,A的水平β1-42单体,在大多数情况下由ELISA或相关方法,涉及较高的预测价值识别的前驱的广告在轻度认知障碍(MCI)的情况下。CSF的单体的浓度β1-42减少30 - 50%相比,AD患者年龄,nondemented控制在许多独立研究证实,敏感性和特异性90%,其中大部分是超过80。有证据表明结合生化分析τ和磷酸化τ,这都增加了患者CSF的广告相比,控制,和一个β测量在脑脊液可以提高诊断价值,甚至可以预测广告90%到80的敏感性和特异性的值(23]。各种生物标志物的研究也一直在进行等离子体,但结果很不一致,目前方便检测β1-42作为生物标志物在等离子体尚未证明(了24,25])。

然而,单体的形式β不是主要负责同种型神经毒性和神经退化。一个β寡聚物已被证明在AD病理发挥基本的神经毒性作用,和量化的能力和资格以及不溶性高分子量(高分子量)骨料不仅可以增强广告的诊断,而且还有助于调查的贡献β骨料AD病理。的发展技术的可靠检测β总量,然而,在技术上具有挑战性由于异构和自然不稳定的粒子,稳步互换成彼此,他们的低丰度。在这里,我们审查的现状分析开发可靠,定期检测β在脑脊液寡聚物和高分子量粒子。我们特别关注的发展方法和单一β总灵敏度。方法是成功开发但尚未应用于人类体液不包括在内。所有类型的方法回顾总结在图1。在本文中,术语描述各种non-monomeric“聚集”β矫形器包括寡聚物、原纤丝和纤维。一个β寡聚物被定义为nonfibrillar、可溶性低分子量矫形器。这个术语描述unsoluble高分子量粒子β矫形器。短语描述特殊β物种作为作者的检查方法。

图1

β β β β β β β β 总结的方法类型的检测使用在脑脊液寡聚物。Sandwich-ELISA方法提供低聚物特异性因为相同的抗体作为检测的捕获和应用。另外,oligomer-specific抗体可用于检测过程。在三明治纳米技术工具,两个特定抗体的框架低聚物。检测是放大的信号,例如,通过共轭金纳米粒子与数以百计的DNA条形码附加biobarcode化验。DNA-magnet-sandwich复合物是使用磁铁从样本中提取。随后,DNA条形码的总数。在分析基于种子聚合,既存multimeric粒子在体液飙升通过添加标签肽样本。检测是通过荧光相关光谱(FCS)来执行的。荧光共振能量转移(FRET)是一种描述能量转移机制两个发色团之间的空间距离,两个荧光团之间提供连接到相同的一个低聚物。通过流式细胞仪的信号检测。Surface-FIDA基于激光焦点扫描一个特别准备了玻璃的芯片的表面。荧光相关光谱(FCS)设备或激光扫描显微镜(LSM)都可以使用。一个聚合或寡聚物集中在一个二维表面固定在载玻片使用捕获抗体。总量是发现通过添加至少两个fluorescence-labeled从抗体。至少两个激光束是专注于玻璃芯片的表面,和荧光发出的光,在共焦荧光抗体检测方法,使单一的综合检测。具体的量化值与荧光像素的总和是产生以上阐述像素colocalization地区一个阈值(截止)强度值。只有double-labeled事件被认为是分析。

2。的检测方法β聚集在脑脊液中,导致一个总结的信号

从2005年开始,各种各样的文章发表描述技术的检测β在体液总量。所有的方法都是基于一个β标题使用特定的抗体,导致的总结数量β骨料读出,通过纳米技术或ELISA-based工具。的检测β单体由低聚物是排除特定的抗体或应用程序相同的一个β系统中绑定抗体两次,例如,捕获以及检测抗体。因为绑定抗原决定基单体已经被捕获抗体,二聚体应该是最小的可检测单位。后者也将检测高分子量的方法β如果样品在测试前没有离心机粒子。

2005年,两篇文章报道极其敏感的基于纳米技术的化验检测的β派生的扩散性的配体(ADDLs)出版。哈等人结合ADDL-specific抗体与局部表面等离子体共振(LSPR)光谱和调查一个AD患者的CSF和一个控制。Georganopoulou等人applied-ADDL特定抗体开发一种超灵敏的条形码为特定的检测化验ADDLs CSF。脑脊液样品15 AD患者和15控制研究。在这两种初步研究,AD患者的样本显示与对照组相比表现出更高的ADDL浓度(26,27]。在最初出版物之后,没有后续的文章发表ADDL-specific化验。可能由于技术困难的技术报告协议包含的几个关键步骤在样品制备和测量程序,并适合应用在高吞吐量或多中心研究可能是有限的。

2010年,Fukomoto等人报道了一种新颖的ELISA方法检测特定的高分子量(高分子量)β低聚物。协议中,相同的n端绑定β抗体BAN50用于捕捉低聚物以及检测。公元18脑脊液样本和7 MCI情况下,更高的信号β高分子量低聚物被发现在25 nondemented控制。此外,负相关的β低聚物读出和MMSE分数可以被描述。检测到低聚物的大小确定为40到200 kDa,主要分馏在尺寸排阻色谱法实验在45到90 kDa,代表主要是10到20即。单体和lower-molecular-weight低聚物物种没有检测到(28]。因此,作者提供了一个技术上相对简单的方法来检测的特殊子集β矫形器。

2010年,高绑定一个发达肽等人β骨料,用它们作为一个诱饵β聚集在“错误折叠的蛋白质测定CSF (MPA)。骨料被绑定到aggregate-specific珠子后,β变性和浓度是决定β1-40和β1-42 monomer-specific elisa。有趣的是,在脑脊液样本26 AD患者,大量的β1-40总量可能比样本中检测到10个年龄组(29日]。检测到骨料的性质还不清楚,因为aggregate-specific珠子是将高阶总量以及描述β低聚物,β是变性浓度测定用常规ELISA对吗β单体。这些信息,然而,可能有助于描述广告病理和诊断方法的发展。

一般来说,应用ELISA或相关分析系统分析体液的内容β聚合物有几个优点。ELISA研究很容易执行和技术简单,呈现他们适合多中心研究。在情况下β种特异的抗体被录用,且只有一个特殊的一个β构象异构体检测,必须注意所选的构象异构体是病理和诊断相关的广告。不同一个β低聚物的矫形器,从二聚体到高分子量的物种,已被描述在体外和在活的有机体内是高度多样化的结构和形状(7- - - - - -9,30.- - - - - -32]。最相关的身份β构象异构体目前正在积极的和有争议的研究课题可能依赖阶段的疾病。

到目前为止,各种conformer-specificβ抗体,是特定的β低聚物,原细纤维或纤维(33- - - - - -37]。只有一些人受雇于ADDLs在脑脊液检测的生物标志物研究26,27]或原纤丝在脑脊液和血液38,39]。据我所知,oligomer-specific单克隆抗体A11(微孔),认识到所有类型的淀粉样蛋白寡聚物,例如,朊病毒,但不是单体和纤维36),另一个βoligomer-specific抗体(克隆4 d8、Gentaur分子产品)是商用,但没有用于任何生物标志物的研究报道。

潜在的大的构象特定的抗体β单体必须仔细地排除在外。克拉弗等人进行ELISA方法的特异性和敏感性的氨基端绑定β抗体6 e10是用于捕获和检测。它可能是在描述试验表明,Aβ单体检测至少在一定程度上(40]。此外,Sehlin等人指出,积极的结果产生的β低聚物ELISA分析可能引起的异染的抗体,丰富的CSF和识别其他物种的免疫球蛋白。异染的抗体干预三明治由横向支撑捕获和检测抗体和免疫测定引起假阳性结果(41]。检测的ELISA研究的另一个缺点寡聚物可能是低估的分子数被Stenh et al。42]。

上述方法的一个缺点是,一个总结信号生成所有粒子在调查中。以防conformer-specific抗体应用,结构不同β低聚物物种在样例将保持未被发现。在本文的下一段中,我们将关注方法基于单粒子检测方法如荧光相关光谱和激光扫描显微镜。方法与单粒子灵敏度允许每个定义,最敏感的检测的β低聚物和高分子量粒子。此外,一些方法,描述单一粒子在调查中,例如,对大小,形式,结构,和组合,是可能的。最后,详细的量化和描述β聚合物可能导致更好的理解的贡献β低聚物和高分子量粒子AD病理。

3所示。检测和表征方法单一β聚集在脑脊液

到目前为止,只有很少的单一的检测方法β聚集在体液中所描述的文学。其中一个原因可能是,在单分子检测技术水平,如荧光相关光谱(FCS),激光扫描显微镜(LSM)敏感的探测器和流式细胞术,容易荧光背景或其他工件和能产生假阳性信号。信号引起的β寡聚物,它有一个相对体积小,必须清楚的区分出信号引起的单体或荧光背景,和数据分析必须非常仔细地只适应计数的信号β矫形器导致AD病理。

第一种方法的检测单β聚集在脑脊液被Pitschke等人在1998年。作者采用种子聚合和发现的过程β使用FCS聚集在AD患者的脑脊液。FCS意味着相关分析粒子的荧光强度的波动,由于布朗运动和时间的推移而变化的解决方案。激光聚焦到样品通过二向色镜。当fluorescence-labeled粒子穿过震源体积,他们发出荧光,发出的光线到达一个非常敏感的光电倍增管或雪崩光电二极管探测器。光来自失焦区域由小光圈镇压前的探测器。在典型的FCS应用程序中,荧光粒子的平均数量和他们的平均扩散时间可以确定和浓度和颗粒的大小可以计算。粒子的荧光可以自行调查,通过标签,或添加荧光配体抗体。

Pitschke和同事添加标签β肽,在SDS避免self-multimerization,脑脊液样品15 AD患者和19个控件。与常规FCS上面描述的应用程序相比,荧光强度信号和时间进行了分析,以及高强度荧光峰的频率每分钟计算。样本的控制产生了波动,相对较低的荧光强度信号添加标记后20分钟β。样品的AD患者中,高强度荧光脉冲被检测到。在后者,multimericβ粒子作为种子快速聚合的标记β单体和额外的实验证明,粒子在契约的主要组成部分β。Smaller-intensity峰值检测的控制样本来自自发荧光探针的multimerization,但可以清楚的区分出积极信号。的线性分析与合成一个测试β和可以验证20 ng 1000 ng 20之间μL样本体积(43]。只有有限的信息总量的大小,最初出现在CSF添加fluorescence-labeled之前β单体。只有每个单粒子的荧光强度可以给出骨料粒度的提示。第一篇文章的起点检测方法的发展β低聚物或高分子量粒子体液。

2007年,德国汉高等人精制Pitschke和他的同事描述的方法和发现大β1-42-binding粒子(表示圈)人类AD患者的CSF和控制使用一个类似的测量原理如上所述。白手起家的共焦检测系统的检测灵敏度提高20倍(间接)相比,系统描述了Pitschke et al .,采用微通道流过系统和样本速度约0.72毫米/秒。分析表明,飙升CSF与荧光样品β导致绑定探测粒子既存的CSF,生产高荧光强度的峰值。一个βautoaggregates,已经大大减少了过滤fluorescence-labeledβ通过定义,被排除在分析强度截止。只有非常聪明的圈,三倍Pitschke所使用的阈值等,也包括在内。圈的样品中发现患者8 AD患者和6混合型广告以及控制(6 nondemented 10其他神经退行性疾病)高个人间变异,但圈浓度不是特定的广告。

接下来,该集团用共焦显微镜探讨粒子作为种子样品的更多细节。探测粒子的荧光图像β1-42贴上Cy3添加到样本。使用一个常规成像分析,面积、形状、亮度和纹理粒子的测定和圈被分为四类。一个βautoaggregates可以明确定义亮度低,体积小,和异构纹理。LAP-1总量很少被发现在脑脊液和类似粒子发现当标签β添加合成吗β种子。第二圈聚集似乎含有蛋白结合的一种β骨料。LAP-3和LAP-4都明亮的粒子,要么椭球(LAP-3)或圆形状(LAP-4)。他们就像在自身免疫性疾病的免疫复合物。LAPs-4在所有广告患者已经几乎没有,但出现在大约40%的控制样本。这个讨论了相干为可溶性循环IgG-based间隙系统进一步证据β矫形器(44]。在其他的研究中,自然发生的β自身抗体检测在更高程度上等离子体控制,样品相比,AD患者(45]。德国汉高等人描述的方法揭示了非常有趣的信息圈。的图像,然而,圈看起来相对大(2μ米),这项研究的结果几乎不可能比得上生物标志物研究中较小的一个β聚合或低聚物。

2007年,桑托斯等人建立了一个方法β低聚物检测基于荧光共振能量转移(FRET),通过流式细胞仪检测烦恼事件。两个fluorescence-labeled标签在脑脊液寡聚物β添加了抗体:4 g8-alexafluor 488和6 e10-alexafluor 594。能量转移的担忧意味着从一个兴奋的捐赠(4 g8-alexafluor 488)的受体分子(6 e10-alexafluor 594)定义的空间条件下,导致受体分子的荧光发射。烦恼事件只发生如果两个抗体是密切的空间距离,也就是说,如果都绑定到相同的β低聚物。一个β单体不会发现只有一个抗体探针可以绑定,分别,如果在近距离两个单体,结果担心信号的强度很低。两个具体的应用β检测过程将确保高特异性的抗体测定。方法的敏感性研究使用合成ADDL和须根的准备工作,确定为线性的10点到2.5 nM,和单体浓度。检出限是在femtomolar范围。估计的β构象异构体大小可能是由于每个单粒子的荧光强度分析。174人类脑脊液样本nondemented个人、样本容量200μL,进行调查分析。大型低聚物浓度的变化证明,和年龄之间的弱相关的个人和低聚物的浓度。分析被证明是高度可再生(46),但到目前为止没有数据从广告获得病人样本出版。相反,2008年,桑托斯等人发表了相关的检测方法β低聚物在等离子体样本。同时,的内容β1-40和β1-42可以量化使用种专一性β免疫沉淀反应的抗体。结果immunocomplexes固定磁珠,fluorescence-labeled抗体被添加。随后,流式细胞术的样本调查。一个的数量β寡聚物允许区分17血浆样品的AD患者和16 nondemeted控制的等离子体样品的特异性为81.2%,敏感性为70.6% (47]。

2006年,Birkmann等人开发了一个单一的朊病毒粒子的检测的方法,计算了FCS。朊病毒聚集在大脑的样本疯牛病,Scrapie-infected动物被化学沉淀分离,由两个不同的特定和fluorescence-labeled朊病毒标记抗体,和FCS使用双色中发现模式。一些探测器抗体绑定到一个总、高荧光强度的峰值检测,如果聚集十字激光的焦点。单体可以区分一个强度截止。巧合的信号标记都算作特定事件。2007年,该方法精制和用于检测朊蛋白总量的CSF BSE-infected牛与控制。在新的试验版本,计价Surface-FIDA(荧光强度分布分析),朊病毒蛋白总量是固定玻璃芯片的表面使用特定的捕获抗体。然后,两个fluorescence-labeled检测抗体申请总量的检测。测量原理的方案可以在图中找到。至少三个检测抗体用于测定程序,提供高特异性(48]。此外,检测单体可以排除应用程序相同的抗体捕获和检测探头。2007年,适应的检测分析β低聚物。综合分析评估使用的线性聚合的一个准备β。所示的试验是在一个广泛的是线性的β沙克总金额范围。合成一个β单体没有检测到。作为第一试验对实际执行Surface-FIDA脑脊液样本,20μL原油三AD患者CSF和两个nondemented控制患者进行分析。的数β聚集在AD患者高于健康对照组。最近,分析可以优化对其生化步骤和适应LSM,导致进一步提高灵敏度。此外,使用基于图像的方法,每一个总体特征可以对它的大小和组成(49- - - - - -51]。异染的抗体的影响,描述了Sehlin et al。41),没有调查,但应该在不断研究解决。

4所示。结论

阿尔茨海默氏症研究社区的利益来检测β低聚物和聚合物在体液近年来强劲增长。一个β寡聚物的主要有毒物种已被证明是AD病理,以及量化的能力和资格不仅可以增强广告的诊断,而且还有助于调查的贡献β低聚物和高分子量粒子AD病理。技术的发展为可靠的检测和定量的聚合β物种,然而,在技术上具有挑战性,因为已经描述的介绍。

今天6初步但独立研究表明,A的浓度β低聚物在AD患者CSF高于健康对照组,甚至一个研究报道了相似的结果在血浆样品26- - - - - -29日,43,47,49]。这些结果进一步加强的理论β寡聚物可能是一种有价值的诊断和治疗监测的标志广告。相比之下,德国汉高等人报道,之间没有相关性β总数量和诊断(44]。这些不连贯的结果可以解释为技术差异和不同的样品制备。已经表明,样品制备标准操作程序可能导致更一致的结果,和一些研究网络目前工作的标准化样本收集、preanalytical和分析功能的协调广告生物测量。

发现A的浓度β在AD患者脑脊液寡聚物是高于健康对照组似乎反驳ELISA研究表明总或单体β数量随疾病进展。英格伦et al .,然而,发现的降低β42很可能是由于其低聚[52]。因此,减少单体的报道β,它实际上可能只是减少单体的一个访问β,很可能是根据观察到的增加的聚合β疾病进展。获得可靠的信息在未来数百样品必须调查采用不同的试验系统。不过,很多工作需要阐明的性质β寡聚物相关疾病以及改善技术应用量化方法的鲁棒性。一些化验了这里是复杂的,其鲁棒性必须证明在未来。技术优化后,最健壮和可靠的分析可以很容易地用于其他蛋白质聚集参与神经退行性疾病的病理。

尽管腰椎穿刺是适度入侵和并发症的发生率较低53),在血浆将是很有价值的生物标志物检测到用于更广泛的诊断和治疗监测。这将是非常有用的适应最健壮的和敏感的方法开发了基于CSF血浆和血清样本。在等离子体测量,然而,在技术上更有挑战性。一个β是众所周知的绑定到等离子体蛋白质如白蛋白和脂蛋白,导致屏蔽抗原表位的54]。2009年,夏等人报道了一个β低聚物具体的ELISA。在这项研究中,等离子体的水平β42和低聚物的β物种有紧密的关联的对象(55]。

总之,一些敏感的化验检测和表征的β低聚物在CSF目前发达。初步结果表明,Aβ低聚物和高分子量粒子可能是有价值的生物标志物的广告,和生物标志物研究聚合β物种可能启发的作用β聚集在阿尔茨海默氏病的发展。

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