文摘

背景。微rna - 576 - 5 - p (mir - 576 - 5 - p)中扮演一个重要的角色在不同的人类癌症。然而,mir - 576 - 5的生物功能- p在乳头状甲状腺癌(PTC)仍不清楚。在这项研究中,我们探讨了函数和特定的角色在PTC mir - 576 - 5 - p。方法。mir - 576 - 5 - p的表达水平在PTC患者组织和细胞系由反向transcription-quantitative聚合酶链反应(存在)。细胞计数用细胞计数kit-8 (CCK-8),伤口愈合,和Transwell化验进行评估mir - 576 - 5 - p的影响扩散,迁移和入侵TPC-1细胞。表达水平的增殖蛋白激酶4 (MAPK4)和磷酸化水平的蛋白激酶B(一种蛋白激酶),细胞外调节蛋白激酶(ERK)和P38增殖蛋白激酶(P38)检测到免疫印迹和免疫组织化学(包含IHC)。结果。的表达水平mir - 576 - 5 - p在PTC组织和TPC-1细胞显著增加。体外,mir - 576 - 5 - p的超表达促进了增殖,迁移和入侵TPC-1细胞。此外,MAPK4 PTC组织中高度表达,mir - 576 - 5 - p可能上调MAPK4的表达。有趣的是,MAPK4击倒逆转细胞增殖而不是在TPC-1细胞迁移和入侵mir - 576 - 5 - p是过表达。此外,过度mir - 576 - 5 - p诱导激活TPC-1 AKT通路的细胞,和MAPK4基因敲除逆转这个AKT通路激活。结论。在这项研究中,我们发现mir - 576 - 5 - p明显在PTC组织和TPC-1细胞。此外,mir - 576 - 5 - p提升TPC-1细胞的增殖MAPK4的增强表达和激活AKT通路。

1。介绍

甲状腺癌(TC)是最常见的内分泌系统的恶性肿瘤,发病率及其稳步增长在过去的十年中全球(1]。根据不同的病理特性,甲状腺癌可分为乳头状甲状腺癌(PTC),滤泡性甲状腺癌(FTC),甲状腺髓样癌(MTC)和未分化甲状腺癌(ATC)2,3]。PTC(列车自动控制系统)是最常见的病理类型的TC,占80%以上的TC病例。PTC(列车自动控制系统)通常被认为是一种恶性肿瘤进展缓慢,预后良好,随着10年存活率约90% (4]。然而,在一些病人,PTC显示了积极的行为,导致预后不良。虽然总体生存率显著提高手术或放疗后,转移性PTC的预后差(5]。因此,准确的术前诊断和精确治疗PTC是必要的。在PTC特定的生物标志物的发现可以帮助评估肿瘤的侵袭性潜力和指导手术策略或提供新的治疗靶点6]。因此,它具有重要意义阐明PTC的分子机制的发展获得新的治疗靶点。

突变或异常的小分子核糖核酸(microrna)是一组小(年龄在18岁至25岁之间核苷酸长度)的高度保守的非编码RNA分子在肿瘤发生中发挥关键作用,发展,入侵和转移,可能导致癌症7,8]。等大量的microrna mir - 622, mir - 214,和microRNA-23a发现参与调节乳头状甲状腺癌的发生和发展9- - - - - -11]。此外,表观遗传改变细胞功能的PTC尚未完全了解。mir - 576 - 5 - p被发现是调节在各种癌症,胶质母细胞瘤、结肠癌等(12,13),和超表达mir - 576 - 5 - p与大脑有关转移的结直肠癌和生存在肺神经内分泌肿瘤14,15]。此外,事实证明,mir - 576 - 5 - p可以促进增殖、迁移和入侵nonsmall细胞肺癌细胞(16]。然而,我们所知的,特定角色和mir - 576 - 5 - p机制在PTC尚未探索,并根据这一点,我们设计了这个研究并完成了一系列的实验来分析生物角色mir - 576 - 5 - p和相关机制TPC-1细胞。

MAPK的非典型成员的家庭,增殖作用的生理和病理功能蛋白激酶4 (MAPK4)肿瘤已经逐渐开始得到关注。MAPK4已经被证明可以促进乳腺癌细胞增殖、迁移,并通过激活PI3K / AKT信号入侵,下游蛋白质c-JUN,细胞周期G1 / S, epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)。同时,MAPK4是骨肉瘤中高度表达,抑制细胞增殖和迁移通过激活物/ p38信号通路。在前列腺癌的研究中,MAPK4超表达促进前列腺癌转移通过HSP27 upregulation。此外,MAP2K4可以激活p38蛋白质和诱导前列腺癌上皮细胞转化为间充质细胞,从而导致遥远的肿瘤细胞转移(17,18]。然而,MAPK4被发现在胰腺腺癌表达下调,确认为一种肿瘤抑制基因。(19]尽管表达的差异在上述研究中,MAPK4在PTC的作用及其与一种蛋白激酶信号通路的关系仍不清楚。

在这项研究中,我们评估mir - 576 - 5 - p的影响扩散,迁移和入侵乳头状甲状腺癌。此外,我们调查是否MAPK4-AKT信号通路介导mir - 576 - 5 - p的角色在促进肿瘤增殖、迁移和入侵。

2。材料和方法

2.1。PTC组织样本集合

PTC组织和邻近的正常甲状腺组织收集病人的手术前诊断为PTC然后接受甲状腺切除术从2018年7月到2019年4月在西南医科大学的附属医院。以确保有足够的样品最后病理诊断,42对PTC组织和正常组织样本收集甲状腺切除术后,大约2 g。样本立即冻结在液态氮在−180°C,然后转移到低温冰箱长期储存的−80°C。所有样本收集与病人和他们的家属的知情同意,并签署了有关道德规范文件。实验伦理委员会批准西南医科大学的附属医院。

2.2。细胞培养

人类甲状腺乳头状癌的细胞(TPC-1)和正常甲状腺上皮细胞(Nthy-ori 3 - 1)从广州吉诺生物技术有限公司获得中国有限公司。TPC-1 RPMI 1640培养基培养细胞(美国HyClone公司)补充10%胎牛血清(美国的边后卫,Gibco热费希尔公司)和孵化37°C湿润孵化器有限公司为5%₂(美国热费希尔)。Nthy-ori 3 - 1在F-12K培养基培养细胞(美国热费希尔公司Gibco)补充10%的边后卫(美国热费希尔公司Gibco) 37°C和5%的公司₂。

2.3。细胞转染

mir - 576 - 5 - p模仿(5′-AUUCUAAUUUCUCCACGUCUUU-3′;50 nmol / L), mir - 576 - 5 - p抑制剂(5′-AAAGACGUGGAGAAAUUAGAAU-3′;100 nmol / L),模拟负控制(数控;5′-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3′;50 nmol / L),抑制剂-控制(数控;5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3′;100 nmol / L), siRNA-MAPK4 (GGCGCTTTGTTGACTTCCA;100 nmol / L)被用于这项研究。寡核苷酸都是购自核糖生物有限公司有限公司(广州)。Lipofectamine 2000(美国表达载体),这是一个多功能的转染试剂,可以有效地使转染不同的货物到不同的附着和悬浮细胞系,转染试剂使用。 According to the instructions, cells were inoculated into 12-well plates one day before transfection, and transfection was carried out when the cell density reached 50%. The final concentration of the miR-576-5p mimic and mimic negative control was 50 nmol; that of the miR-576-5p inhibitor and inhibitor negative control was 100 nmol. Transfected cells were cultured at 37°C in a humidified incubator containing 5% CO₂24小时后,媒介改变了。然后,细胞用于实验。

2.4。RNA提取和反向Transcription-Quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)分析

总RNA提取患者组织和细胞系的试剂盒试剂(美国热费希尔);核酸数量、质量和纯度测定使用分光光度计(美国热费希尔公司Nanodrop)和1%琼脂糖凝胶电泳。随后,500 ng的RNA用于逆转录(目录218160号;Chagan有限公司、希尔登,德国)。用于获得的互补RT-qPCR使用SYBR绿色PCR设备根据制造商的指示(208054号产品目录;德国希尔登Chagan有限公司)。原料mir - 576 - 5 - p和U6是从Chagan公司(产品目录没有购买的。MIMAT0018987;MS00044996)。RT-qPCR使用2.2.3 StepOnePlus版本执行实时PCR系统(应用生物系统公司; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Expression of miR-576-5p was calculated relative to that of U6 using the comparative threshold method (2^−∆∆ct)。

2.5。细胞伤口愈合

伤口愈合细胞被用来评估TPC-1细胞的迁移。简单地说,转染TPC-1细胞(5×10⁵细胞/)接种到24-well盘子和无血清培养系统在RPMI 1640介质;细胞接种密度大约是30%。当细胞完全覆盖的底部,擦伤了垂直于井底形成一个线性伤口使用吸管小费。然后,挠细胞被洗PBS和无血清培养系统在RPMI 1640中24小时。伤口关闭距离被摄影测量五个随机选择的领域的时候受伤后24小时(时间0)和伤害。

2.6。Transwell化验

Transwell化验是用来检测细胞的侵袭性。短暂,我们播种24-well板细胞无血清培养基,但包含Matrigel-coated插入过滤器(美国合演康宁),然后用10%的边后卫RPMI 1640中添加到众议院。细胞培养在37°C公司5%₂24小时,固定为4%甲醛通过过滤器10分钟,结晶紫染色和5%。我们定量分析了细胞入侵的基底膜基质膜。

2.7。细胞计数Kit-8 (CCK8)扩散化验

细胞增殖是由CCK8评估分析(日本公司)。TPC-1细胞(3×10 (3/))细胞接种到96孔板在100年最后一卷μl,然后用上述转染mir - 576 - 5 - p模仿,抑制剂,和相应的数控。样本评估在24、48和72小时后转染。CCK-8解决方案(10μl)被添加到每个在37°C,孵化2小时。吸收为450 nm计算可行的细胞的数量。

2.8。免疫组织化学(包含IHC)和免疫印迹分析

分析MAPK4 formalin-fixedparaffin-embedded组织4中表达μm部分是由包含IHC,表达了MAPK4使用anti-MAPK4抗体(1:50,ab2011501;Abcam公司,剑桥,麻萨诸塞州)。西方墨点法,从TPC-1细胞总蛋白提取或PTC组织使用里帕缓冲区(Beyotime生物技术研究所、中国)。总蛋白溶菌产物分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。之后,膜被封锁在室温下2小时用脱脂牛奶,然后孵化主要抗体(anti-MAPK4_1: 1000;anti-PCNA_1: 1000;anti-p-AKT_1: 1000;anti-AKT_1: 1000;anti-p-ERK_1: 1000;anti-ERK_1: 1000; anti-p-P3_1 : 1000; anti-P38_1 : 1000; anti-GAPDH_1 : 2000) overnight at 4°C. The next day, the PVDF membrane was washed three times with PBST and then incubated at room temperature for 1 hour with 1 : 3000 diluted antirabbit IgG (Beyotime Institute of Biotechnology, China; cat: A0208) and 1 : 3000 diluted antimouse IgG (Beyotime Institute of Biotechnology, China; cat: A0216). Protein bands were detected using Enhanced Chemiluminescence Detection Reagent (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA.) and quantitatively analysed by Photoshop image software.

2.9。动物研究

十二个雄性BALB / c裸小鼠(3 - 4周大)也获得了类似的身体的重量从重庆Tengxin公司和随机分为4组,每组3。总共5×10⁶转染TPC-1细胞(mir - 576 - 5 - p模仿,mir - 576 - 5 - p模拟数控,mir - 576 - 5 - p抑制剂,和mir - 576 - 5 - p抑制剂NC)被注入皮下注射到腋窝每周两次为4周,直到在麻醉的情况下安乐死。用卡尺测量肿瘤大小,肿瘤体积(V)是根据公式计算 。4周后,肿瘤被删除,重,很快就储存在−80°C进行进一步分析20.]。根据项目经伦理委员会批准的西南医科大学动物实验和使用动物实验是按照指南和使用。

2.10。统计分析

所有值给出平均值±标准偏差(n6 = 3),处理GraphPad棱镜(GraphPad、钙、美国)。以上两组之间的差异被单向方差分析分析。学生的t以及用于评估两组之间的差异。 被认为是一个重要的区别。

3所示。结果

3.1。mir - 576 - 5 - p在PTC组织和调节TPC-1细胞

调查mir - 576 - 5 - p在组织和细胞系,其表达在人类PTC的42对组织和邻近正常组织被RT-qPCR检测。结果表明,mir - 576 - 5 - p的表达显著调节在PTC组织与邻近正常组织相比(图1(一))。表达水平的中位数mir - 576 - 5 - p(4.28)作为截止值,和42 PTC患者分为低表达组(n= 24)和高表达组(n= 18)的截止值mir - 576 - 5 - p。应该指出的是,mir - 576 - 5 - p的表达水平与年龄相关 ,TNM阶段 ,和淋巴结转移 (表1)。此外,mir - 576 - 5 - p明显TPC-1细胞中过表达与Nthy-ori(图3 - 1细胞1 (b))。这些数据表明,mir - 576 - 5 - p的表达在组织和TPC-1细胞增加,表明mir - 576 - 5 - p可能发挥重要作用在PTC(列车自动控制系统)的发生和发展。

3.2。mir - 576 - 5 - p促进迁移,增殖,TPC-1细胞的入侵

接下来,调查的角色mir - 576 - 5 - p在PTC,一系列的功能实验由转移mir - 576 - 5 - p模仿,抑制剂,和相应的负控制成TPC-1细胞。CCK8试验的结果表明,upregulation mir - 576 - 5 - p提升TPC-1细胞的增殖mir - 576 - 5 - p的差别,但对这些抑制细胞增殖(图2 (a))。同时,扩散的蛋白质PCNA的表达水平提高使转染后mir - 576 - 5 - p模仿和显著降低TPC-1细胞抑制表达mir - 576 - 5 - p(图2 (b)和2 (c))。此外,细胞伤口愈合和Transwell化验的结果都表明,upregulation mir - 576 - 5 - p促进TPC-1细胞的迁移和入侵和mir - 576 - 5 -抑制这些差别p对这些流程,如图2所示(d) 2 (g)。这些见解表明,mir - 576 - 5 - p可能发挥重要作用在扩散,迁移和入侵TPC-1细胞。

3.3。mir - 576 - 5 - p -诱导增殖,迁移和入侵TPC-1细胞是依赖一种蛋白激酶信号通路激活

已经证明,MAPK和磷脂酰肌醇3-kinase PI3K / AKT信号通路调节致癌的转换,增长,癌细胞的生存21]。两个信号通路的关键蛋白质,包括一种蛋白激酶ERK,和P38检测评估的影响mir - 576 - 5 - p TPC-1细胞行为。与对照组相比,mir - 576 - 5 - p模仿,磷酸化水平的一种蛋白激酶显著增加mir - 576 - 5 - p mimic-transfected TPC-1细胞及其抑制剂引起的相反的效果。没有明显的变化ERK表达或被发现(图3)。这些结果表明,mir - 576 - 5 - p调节的功能TPC-1细胞通过一种蛋白激酶信号通路,至少在部分。

3.4。介导差别MAPK4对这些mir - 576 - 5 - p - AKT激活诱导细胞增殖和TPC-1细胞

新兴证据表明MAPK4监管的一种蛋白激酶信号通路可能参与肿瘤的发病机制,如肺腺癌、结肠癌、前列腺癌(18]。基于这些发现,我们初步推测,mir - 576 - 5 - p -诱导功能的变化通过MAPK4-AKT TPC-1细胞可能发生信号轴。来测试这一假说,表达MAPK4首次临床PTC标本,观察和免疫印迹结果表明,PTC组织MAPK4表达水平显著高于相邻的正常甲状腺组织,和类似的数据被发现包含IHC(图4 (a)和(b))。此外,包含IHC显示MAPK4主要表达在甲状腺细胞的细胞质中。有趣的是,肿瘤大小有差异,由于利率MAPK4积极性的PTC(> 1厘米),PTC(< 1厘米),正常甲状腺组织的63.31%,25.78%,和9%,分别为(图4 (c)和4 (d))。这些结果表明MAPK4过表达,可能扮演重要的角色在PTC(列车自动控制系统)的发展,可能与肿瘤的大小。

接下来,我们验证MAPK4是否参与mir - 576 - 5 - p -体外诱导功能变化。如图5 (a)和5 (b),表达MAPK4在细胞转染与siRNA-MAPK4显著降低。CCK8结果表明,扩散能力siRNA-MAPK4-transfected TPC-1细胞明显低于siRNA-NC-transfected细胞。此外,upregulation mir - 576 - 5 - p明显逆转的影响沉默MAPK4 TPC-1增殖的细胞(图5 (c))。出乎意料的,没有影响迁移或入侵TPC-1细胞MAPK4安静后,表明MAPK4可能不参与这个过程(图5 (d) 5 (g))。这些结果表明,MAPK4参与调节扩散而不是TPC-1细胞的迁移和入侵,这个过程是由mir - 576 - 5 - p。

此外,监管MAPK4之间的关系和mir - 576 - 5 - p TPC-1细胞研究。MAPK4表达显著调节后mir - 576 - 5 - p模仿转染和表达下调后mir - 576 - 5 - p抑制剂转染(图6 (a)和6 (b))。正如所料,沉默MAPK4导致upregulation PTEN蛋白的表达水平的差别,对这些p-AKT蛋白质水平。同时,upregulation mir - 576 - 5 - p逆转的影响MAPK PTEN和p-ATK(图6 (c)和6 (d))。

3.5。mir - 576 - 5 - p促进体内肿瘤生长

评估是否mir - 576 - 5 - p促进体内肿瘤生长,我们进行了动物实验。upregulation后结果表明,mir - 576 - 5 - p,肿瘤的生长速率明显增加。同时,mir - 576 - 5 - p的差别后,对这些基因,肿瘤生长速度明显降低(图7(一))。4周后,小鼠死亡,肿瘤被删除和重。结果表明,移植后mir - 576 - 5 - p,肿瘤大小和重量明显增加。同时,下调后mir - 576 - 5 - p,肿瘤大小和重量显著降低(数字7 (b)和7 (c))。此外,我们发现mir - 576 - 5 - p的表达在肿瘤组织内,和结果表明,表达的mir - 576 - 5 - p mir - 576 - 5 - p模仿组显著高于mir - 576 - 5 - p模拟数控组,但mir - 576 - 5 - p表达mir - 576 - 5 - p抑制剂组显著低于mir - 576 - 5 - p抑制剂NC组(图7 (d))。这些结果表明,mir - 576 - 5 - p能促进体内肿瘤生长。

4所示。讨论

最近,大量的microrna已报告参与《创世纪》,发展和预后的PTC (22- - - - - -24]。在这项研究中,我们观察到的高表达mir - 576 - 5 - p在PTC组织和TPC-1细胞。我们监管表达式TPC-1 mir - 576 - 5 - p的细胞在体外和体内,发现upregulation mir - 576 - 5 - p能促进扩散,迁移和入侵TPC-1细胞以及体内肿瘤的生长。此外,mir - 576 - 5 - p导致调节TPC-1 MAPK4和增强的一种蛋白激酶的表达活动的细胞。最后,我们证实,mir - 576 - 5 - p -诱导细胞增殖是由MAPK4-AKT TPC-1细胞信号通路。

mir - 576 - 5 - p被报道与某些慢性炎症性疾病,如关节炎、百日咳、系统性红斑狼疮、非酒精性脂肪肝病和结核病(25- - - - - -29日]。此外,mir - 576 - 5 - p是调节在结直肠癌患者脑转移,胶质母细胞瘤,神经内分泌肿瘤的肺,和结肠癌12- - - - - -15]。这些研究表明,mir - 576 - 5 - p与肿瘤发生远处转移,整体存活率的癌症和癌症细胞的功能中扮演着重要角色。调节mir - 576 - 5 - p促进迁移和入侵食管鳞状细胞癌(ESCC)通过抑制核受体相互作用蛋白的表达(NRIP1) [30.]。已经证实,mir - 576 - 5 - p加速黑色素瘤细胞系(各种人类的入侵31日]。此外,mir - 576 - 5 - p是参与调节食道癌细胞的增殖(32]。与之前的研究一致,我们发现mir - 576 - 5 - p PTC组织中高度表达,TPC-1细胞,和超表达mir - 576 - 5 - p推广扩散,迁移和入侵TPC-1细胞。

MAPK和PTEN / AKT信号通路发挥核心作用在促进细胞增殖21,33]。许多研究表明,microrna调节增殖,迁移,并通过MAPK入侵PTC和PTEN / AKT信号通路。例如,mir - 150 - 5 - p促进PTC细胞增殖和生存通过激活ERK信号通路(34]。在乳头状甲状腺癌miR-20b起到了抑制作用通过调节MAPK / ERK信号通路(35]。miR-31可以显著抑制扩散的过度表达,入侵,PTC迁移细胞通过调节细胞外一种蛋白激酶信号通路(36]。此外,mir - 486抑制细胞增殖,入侵,迁移下调TENM1表达式和影响ERK和一种蛋白激酶信号通路和epithelial-to-mesenchymal过渡在乳头状甲状腺癌37]。我们也验证了MAPK和/或PTEN / AKT是否参与增殖,迁移,和入侵TPC-1细胞的参与mir - 576 - 5 - p和发现,在关键MAPK和AKT通路组件,只有AKT蛋白表达改变了mir - 576 - 5 - p击倒。这些数据清楚地确认AKT通路,而不是MAPK信号,参与mir - 576 - 5 - p - PTC诱导细胞功能调节。

MAPK4最初被确定为消极监管机构等非癌症细胞扩散preadipocytes和多发性骨髓瘤细胞系38]。最近,研究MAPK4在肿瘤领域已经受到了越来越多的关注。在osteosarcoma-derived U2OS和卵巢carcinoma-derived es 2细胞,减少翻译MAPK4信使rna介导IGF2BP1 prometastatic效应,表明MAPK4作为肿瘤抑制基因(39]。相反,MAPK4被认为是一种肿瘤启动子在某些癌症,如肺腺癌、结肠癌、前列腺癌(18]。此外,MAPK4转录水平的调节肺腺瘤(k - ras基因的致癌基因40]。MAPK4增殖效应也观察到在前列腺癌生物细胞(18]。看来MAPK4可能施加不同的影响不同的肿瘤,与反或pro-oncogenic效果。在我们的研究中,我们证实MAPK4在PTC组织。此外,我们发现MAPK4可以促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和调解的效果mir - 576 - 5 - p TPC-1细胞的增殖。

如上所述,mir - 576 - 5 - p绝对是参与调节PTC(列车自动控制系统)的功能细胞,MAPK4引起的。调查可能的相互作用mir - 576 - 5 - p和MAPK4, mir - 576 - 5 - p获得和丧失TPC-1细胞进行实验。我们的数据显示,过度的mir - 576 - 5 - p导致upregulation MAPK4,抑制mir - 576 - 5 - p阻止它。这些发现证实,mir - 576 - 5 - p直接或间接激活MAPK4在PTC促进细胞增殖,但详细的监管机制需要进一步证实。

这是表明MAPK4和一种蛋白激酶信号通路相关的各种肿瘤。王等人建议MAPK4促进肺癌和膀胱癌的发展通过一种蛋白激酶的激活信号通路(18]。类似于上面的研究,正如所料,沉默MAPK4导致upregulation PTEN蛋白的表达水平的差别,对这些p-AKT蛋白质水平。同时,upregulation mir - 576 - 5 - p逆转的影响MAPK PTEN和p-ATK。在一起,这些数据表明,mir - 576 - 5 - p通过MAPK4-AKT通路调节细胞,但没有证据之间的直接监管mir - 576 - 5 - p和MAPK4。其他机制是否参与mir - 576 - 5 - p -介导的功能变化在甲状腺癌的细胞仍有待进一步探讨。

总之,我们的研究表明,mir - 576 - 5 - p的表达在PTC组织和TPC-1细胞显著增加。此外,我们发现mir - 576 - 5 - p可以促进TPC-1细胞的增殖MAPK4的增强表达和激活下游的一种蛋白激酶信号通路。的直接目标基因mir - 576 - 5 - p将是未来研究的重点。

数据可用性

图数据和相关数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

伦理批准本研究从西南医科大学的附属医院。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

相对湿度,Y.Z., and F.L. designed the research. X.Y.Z. selected the reagents and acted as the experimental director of the research. R.H. and Y.Z. conducted the research. R.H., S.C., F.W., and F.W. analysed the data. R.H., Y.Z. wrote the paper. Y.L., L.C., and Q.X.G. participated in the revision of the manuscript. All authors have read and approved the final manuscript. Rui Hai and Yang Zhou have contributed equally to this work.

确认

本研究四川科技计划支持的联合创新项目(批准号2021 lzxnyd-d03)和科技战略合作项目之间遂宁第一人民医院和西南医科大学(批准号2022 snxnyd06)。