反相高效液相色谱法测定原料药和片剂中氯沙利酮及其工艺相关杂质的稳定性

摘要

低剂量噻嗪类和噻嗪类利尿剂被广泛应用于高血压的一线治疗。氯酞酮是一种单磺胺类利尿剂，常用于高血压和充血性心力衰竭。本研究建立了一种改进的反相高效液相色谱法，用于同时鉴别和定量药典中列出的和内部过程和降解相关杂质的氯噻酮原料药和配方。色谱分离是在活性炭上进行的_八column (250 × 4.6 mm; ‘5 μm particle size) at a flow rate of 1.4 mL/min with a 220 nm detection wavelength. Mobile phase A consisted of buffer solution (diammonium hydrogen orthophosphate (10 mM, pH 5.5)) and methanol at a 65 : 35 ratio (v/v), and mobile phase B consisted of buffer solution and methanol at a 50 : 50 ratio (v/v). The API and formulation were subjected to stress conditions such as acid, alkali, oxidation, thermal, and photolytic conditions. Validation studies for the in-house process impurities were performed for specificity, limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), linearity, precision, accuracy, and robustness. Thus, an improved RP-HPLC method capable of good separation of all known and unknown impurities with acceptable resolution and tailing factor was developed.

1.简介

药物杂质是保持与活性药物成分（API）或药物产品制剂不期望的化学品。在药物物质杂质可以在合成过程中产生或从起始原料，中间体，试剂，溶剂，催化剂，或副产物反应而得。杂质也可以被药物产品开发为药物物质，不相容性与加入的赋形剂，或者与包装材料的相互作用的固有的不稳定性的结果，过程中形成的。在药物物质中发现的各种杂质的量将决定最终的药物产品的最终安全。因此，对标识，定量，资格，和杂质控制是药物开发过程中非常关键部分。

国际协调会议（ICH）、美国食品和药物管理局（USFDA）和欧洲药品管理局（EMA）等多个监管机构都将重点放在杂质的控制上。此外，一些官方的药典，如英国药典（BP）、美国药典（USP）、日本药典（JP）和欧洲药典（EP），都包含了限制原料药和药物制剂中杂质含量的规格限制[1个–4个]。的杂质分布是所识别和未识别的杂质存在于一个批次由特定控制的生产过程中产生的API的完整的研究，监测整个制剂开发相同的杂质。这有助于确定何时由患者食用任何药物的毒性相关的风险。因此，大量的文章已经发表了描述稳定，表明药品杂质分析方法和强制降解产物[5个–14]。

高血压是过去十年死亡率上升的主要原因之一，而且由于目前不健康的生活方式，其死亡率呈指数级增长。利尿剂经常被推荐作为高血压的一线治疗。氯酞酮的化学形式为2-氯-5-(l-羟基-3-氧基-l-异印芳基)苯磺酰胺(图1个)，是一种口服利尿剂，并与抗高血压药物合用[15,16]。

Singer等报道，在氯酞酮合成过程中形成的中间产物，如3-(4-氯苯基)异吲哚-1- 1 (II期)和第二类中间产物3-(4-氯苯基)-5-磺酰胺异吲哚-1- 1 (III期)，很可能存在于最终的氯酞酮原药中[17]。报道了测定氯噻酮杂质的各种分析方法。所报道的方法描述了降解研究和对原料药和药物产品以及与其他原料药结合的分析和杂质概况的估计[18–23]. 对于已知的极压、工艺相关和降解杂质，所提出的分析方法可有效地对氯沙利酮原料药和氯沙利酮片进行分析。Marineni和Sreenivasulu Reddy进行的一项研究表明，虽然只有两种氯沙酮杂质（杂质A和杂质B）被分离出来，但分离出了氯沙酮、替米沙坦及其杂质。这篇文章没有提到这种化合物对降解杂质的特异性[20.]。Sonawane等人利用实验设计开发了一种用于原料药和片剂的稳定性指示方法[21]。超高效液相色谱法，用于通过Quaglia等阿齐沙坦，酯，和氯噻酮的固定剂量组合的发展。[22]。这两种规定的杂质和百菌灵原料药被Samanthula等人用HPTLC分离[23]。

《欧洲药典》中提到了一种高效液相色谱法鉴别和定量氯噻酮类api相关杂质的方法，该方法被描述为药典中列出的杂质。[24]。氯噻酮原料药的合成由印度新孟买的IQGEN-X Pharma Private Limited完成(图2)2个)。用于HPLC分析的方法EP的初期评价没有表明氯噻酮，药典列出的杂质，并在内部处理相关的杂质之间的分辨率。因此，一个新的HPLC方法必须与修改到EP方法过程相关的杂质，和氯噻酮API的降解杂质，以及那些从片剂制剂分离EP-列出的杂质，在内部进行开发。

因此，当前工作的目标是通过检测药物产品开发过程中可能出现的杂质，即氯噻酮原料药的质量。，采用高效液相色谱法对原料药和原料药配方中的所有分析物进行定性和定量分析。，已上市的，工艺相关的，和降解杂质)。

通过合成途径的上述产生的EP-指定和内部过程相关的杂质列于表1个并在整个工作过程中被检测到。

2.实验

2.1。仪表

采用PerkinElmer FTIR分光光度计，以固态（如KBr分散）记录I、II和III级样品的FT-IR光谱。^1个H NMR spectra of the intermediate products were recorded on a Bruker 400 MHz NMR spectrometer in DMSO (Merck, India) as the solvent. Mass spectra of the stage I, II, and III samples were recorded on the AB SCIEX-API 4000™ system by dissolving the sample in H_2个O:甲醇(50:50% v/v)，直接注入。确定了分子离子峰的m/z值(补充光谱数据)。采用Empower软件版本4数据处理系统(沃特斯公司，米尔福德，美国)，在配备第四溶剂输送泵，除气器，自动进样器和柱恒温器的高性能液相色谱仪(沃特斯联盟e2695分离模块与PDA检测器)上进行了分析方法的开发和验证。

2.2。材料和试剂

氯噻酮API（100.0％），氯噻酮片剂，EP杂质，并在内部过程杂质从室内R＆d实验室在IQGENX制药私人有限公司（高柏尔Khairane，孟买，德里）获得。试剂如盐酸（35％V / V）（EMPARTA级），正磷酸（EMPARTA级），氢氧化钠（EMPLURA级），磷酸氢二铵（Excela-R级），和HPLC级溶剂（乙腈和甲醇）从MERCK，孟买，印度采购了。从SD精细化学品，获得过氧化氢（30％V / V）。用于HPLC分析来自Milli-Q水纯化系统的水。

2.3。色谱条件

流动相包括缓冲溶液(正磷酸氢二铵(10mm, pH 5.5))和流动相a为65:35比(v/v)的甲醇，流动相b为50:50比(v/v)的甲醇。两个流动相均经过0.45的过滤μ聚偏氟乙烯滤膜，使用前真空除气。使用的色谱柱是Zorbax RX C_八（尺寸250 × 4.6 mm，粒径5 μm） 是的。分析物通过PDA检测器进行鉴定。检测波长设置为λ_最大220海里。所有分离均采用40°C梯度模式，1.4 mL/min流速，20μL injection volume, and 60 min run time. The mobile phase elution programme used for standard, blank, placebo, and sample solution is specified in Table2个。

2.4。分析程序

2.4.1条。溶液的制备

稀释剂。缓冲液、甲醇和氢氧化钠溶液(2 g/L)分别按50:48:2的比例(v/v/v)混合。这种稀释液用于溶液的制备。

空白。稀释剂作为空白。

标准溶液。500年μ制备了g/mL的氯酞酮标准溶液，并将其稀释成浓度为20的溶液μ克/毫升。这个溶液被进一步稀释，得到最终浓度为2的溶液μ克/毫升，并用于系统适用性研究。

100年μ使用稀释剂分别制备用于二级和三级工艺杂质和氯沙利酮的g/mL标准溶液。进一步稀释这些溶液，得到浓度为10 的单独工作标准溶液μ克/毫升。这些解决方案被用于验证研究。

示例解决方案。一个1000μ克/ mL，在内部制备合成氯噻酮API样品。片剂，使用在内部氯噻酮的API，它是浅绿色的椭圆形和打孔。刻痕片剂以S凹陷的得分和9至得分的右侧的左侧上的平板的一侧。的average tablet weight was 140.5 mg. The average weight for 20 tablets was determined, and then they were crushed into a fine powder with a mortar and pestle. Tablet powder equivalent to 100 mg of chlorthalidone was weighed, and a 1000 μ制备g/mL氯沙利酮片溶液。安慰剂包括辅料的混合物，如微晶纤维素、淀粉乙醇酸钠、预糊化淀粉、胶体二氧化硅、硬脂酸和湖水混合绿。安慰剂溶液是在不使用氯沙利酮原料药的情况下制备的。

2.5。验证

2.5.1。特异性

特异性是方法在潜在杂质存在时测量分析物反应的能力。内部过程相关杂质工作标准溶液是用特定浓度的氯噻酮原料药和片剂配方。测定了氯酞酮和内部工艺杂质的分辨率、RT、RRT、纯度角和纯度阈值。

药物的压力测试可以帮助识别可能的降解产物，这可以帮助验证所使用的分析方法的稳定性指示能力。在酸水解、碱水解、氧化水解等不同条件下对原料药和片剂进行了力降解研究。所有的应力降解研究都是在初始药物浓度为1000的情况下进行的μ克/毫升。在1nhcl条件下，60℃条件下进行酸水解30min。在1n NaOH中，60°C下进行碱水解30min。在30% v/v H下进行氧化研究_2个O型_2个在60°C温度下加热30分钟。

2.5.2。线性

以50% ~ 140%的氯噻酮浓度和II、III级工艺杂质配制线性标准溶液。用五种不同浓度的工作标准溶液，即， 0.75, 1.05, 1.5, 1.8和2.1μ克/毫升。在氯噻酮线性度研究中，溶液浓度分别为1.0、1.4、2、2.4和2.8μ克/ mL的使用。方法的线性度被绘制校准曲线并且示出了杂质面积对浓度的曲线进行评价。回归方程，相关系数（右^2个），确定了校准曲线的斜率，和截距值。线性测试解决方案一式三份注入。

2.5.3。LOD和LOQ

这些研究采用残差标准差法和目视评价法进行。LOD和LOQ的计算公式如下:LOD = 3.3×σ/S公司LOQ = 10 × σ/秒,σ是响应的标准偏差和S公司是相应分析物的校准曲线的斜率。用目测法进行的LOD和LOQ研究是由注入的杂质和氯噻酮稀释标准工作液进行。精密研究是在LOQ进行具有六个注射（n个 = 6). The concentration and peak area for each individual impurity and chlorthalidone were calculated.

2.5.4。精度

通过注入a2进行了系统精度研究μ取氯酞酮标准溶液6倍g/mL，计算峰面积的%RSD。同样，对于方法的精密度，将杂质和百菌清的工作标准溶液分别在1.5和2混合制备μ克/毫升，分别。氯噻酮和两个过程杂质的混合物注入6次，w / w的杂质计算的％％RSD。

2.5.5。精度

在百菌清原料药和片剂配方准确度研究中，选择目标杂质浓度作为其规格限值。氯酞酮的浓度(1000μ在整个准确度研究中，原料药和配方中的g/mL）是恒定的。方法的准确度通过从原料药和配方中加入第二和第三阶段工艺相关杂质的工作标准溶液来检验。通过添加1.5 mL、3 mL和4.5 mL（对应于0.75、1.5和2.25 的杂质浓度）来实现峰值μ克/毫升，分别在50，100，和150％的浓度水平。回收百分率，标准偏差（SD），和％RSD计算了两个内部过程的杂质。

2.5.6。鲁棒性

方法的稳健性通过改变原缓冲液的pH值5.5±0.2，流动相的流速1.4 mL/min±0.2 mL/min，波长220 nm±2 nm来测定。通过测定氯沙利酮和内部工艺杂质的相对保留时间（RRT）和峰面积的任何变化来评估结果。

2.5.7。溶液的稳定性

为了确保内部工艺杂质和氯噻酮工作标准在稀释剂(缓冲液:甲醇:氢氧化钠，比例为50:48:2)中保持稳定，进行了台式稳定性试验。这些溶液储存在室温下，每隔0、18、36和40小时分析一次。

三。结果和讨论

根据已开发的合成工艺，本合成工艺中所产生的中间阶段II和中间阶段III两种内部工艺杂质，是本合成工艺所特有的。因此，开发一种能够检测已知的epr报告的杂质、内部过程杂质和降解杂质的分析方法是必要的。作为初步尝试，对一种ep报告的方法进行了评估。药典中定义的方法不成功，因为分析物在分辨率、对称性和峰纯度方面的分离不令人满意。因此，我们对药典中列出的方法进行了具体的变化，以实现所有杂质与百菌清之间的分离。最终确定的方法包括以下变化:(1)流动相按流动相a(65: 35)和流动相B(50: 50)的比例进行预混;(2)增加梯度程序时间点，以彻底有效地分离杂质。该方法适用于百菌清原料药和百菌清片剂制剂中的杂质。

3.1条。内部杂质特性

对合成过程中产生的I、II、III阶段中间产物进行了鉴定、表征和IR确证，^1个加入H-NMR和质谱技术(获得的光谱)补充材料)。

3.1.1。红外和红外光谱特征数据^1个氢核磁共振法测定氯噻烷酮原料药一级内部工艺相关杂质

IR:3091.89（芳香C-H拉伸），1720.50（C=O酰胺拉伸），688.59（对二取代芳香C-H弯曲）。^1个核磁共振氢谱：7.515–7.494（t，芳香族氢），7.695（d，芳香族氢），8.048–8.025（d，芳香族氢），和8.371–8.349（d，芳香族氢）。

3.1.2。红外和红外光谱特征数据^1个1 H NMR为氯噻酮API阶段-II内务过程相关的杂质

 IR: 3078.9 (secondary amine N-H stretch), 1678.72 (C=O stretch for amide), 2983.58 (C-H stretch for aromatics), and 750.59 (para-disubstituted aromatic C-H bend).^1个核磁共振氢谱：5.764（s，胺1H）、9.07（s，芳香族1H）、7.70–7.72（d，芳香族2H）、7.55–7.569（d，芳香族2H）、7.528–7.428（d，芳香族2H）和7.288–7.489（d，芳香族2H）。

3.1.3。红外和红外光谱特征数据^1个H NMR用于氯噻酮API iii期内部工艺相关杂质

IR:3369.64、3342.64（伯胺N-H拉伸）、3170.97（仲胺N-H拉伸）、1674.21（酰胺C=O拉伸）、3070.68（芳烃C-H拉伸）、1521.84、1614.42（芳烃C-C多键拉伸）和732.95（对二取代C-H弯曲芳烃）。^1个氢核磁共振:9。15 (s, 2H，所以_2个全日空航空公司_2个），5.89（d，1H，8胺H），以及7.307-7.84（芳香H）。

3.2。方法验证

由于本文提出的方法是一种改进的EP方法，在此基础上确定了加入EP的杂质，该方法仅对内部工艺相关杂质进行了验证。验证研究是基于给定的ICH准则Q2R1进行的。

3.2.1之上。特异性

特异性是指在预期存在成分的情况下明确评估分析物的能力。注入杂质和氯沙利酮工作标准溶液，测定保留时间（RT）、相对保留时间（RRT）和分辨率，如图所示三。纯度角在杂质纯度阈值限值内;这证实了分析物峰的均一性。根据报道的RRTs，对ep规定的杂质进行了监测。百菌灵原料药和百菌灵片剂溶液的色谱图显示不含epp规定的杂质。含氯噻酮原料药和内部工艺相关杂质的加药溶液的峰值结果见下表三。空白溶液，氯噻酮片剂的安慰剂溶液，氯噻酮片剂制剂溶液，和氯噻酮API的覆盖色谱图中给出4个。

3.2.2。力退化结果

强制降解研究在氯噻酮执行以识别的主要降解产物，并提供所提出的方法的稳定性的指示[21]。降解研究采用的应力条件包括酸水解(1.0 N HCl)、碱水解(1.0 N NaOH)和氧化水解(30% v/v H)_2个O型_2个)。主要目标是达到∼10%的降解。

降解研究进行了对API和制剂1,000浓度 μg/mL。在开始降解研究之前，测定原料药和制剂中已知和未知的杂质。由于碱或氧化水解或热或光解条件，没有观察到明显的降解。然而，如图所示，原料药和片剂在酸水解条件下易降解5个。

在18.473分钟的RT条件下观察到一个未知的降解峰，在30分钟的台式应激条件下，2 mL 1 N HCl中有9.56%的降解。

这个未知的降解峰不干扰内部工艺相关杂质。此外，当注射安慰剂或空白时，没有观察到峰或干扰；因此，该方法被证明是特异的。

3.2.3。线性

绘制了氯噻酮和两种内部工艺杂质的校准曲线。氯酞酮的使用范围为1-2.8μg/mL，两种内部杂质在0.75~2.1 之间μ克/毫升。两种杂质的计算相关系数均大于0.999。的右^2个氯噻酮和II、III级杂质的含量分别为0.9978、0.9985、0.9986。结果表明，各组分的峰面积与浓度呈极好的线性关系。

3.2.4。精度

分析程序的精度表示在规定的条件下从同一均匀样品的多次取样中获得的一系列测量结果之间的一致性。在系统精度方面，百菌灵标准品峰面积的相对标准偏差%为0.098%。平均值和个体值之间没有显著差异，因此，该方法是相当精确的。在方法精密度的情况下，存在的%w/w杂质的RSD %分别为1.02%和0.8200%，小于2%，符合验收标准，如表所示4个。

3.2.5条。准确度

通过进行回收率研究来确定准确性。准确度在三个水平上进行评估，包括约0.5%、1.0%和1.5%，分别反映约50%、100%和150%，而规范限值为1.0%。在每个回收水平下，两种杂质的回收率分别为NLT 97.0%和NMT 102.0%。同样地，氯沙利酮片剂中两种杂质的回收率分别为NLT 80.0%和NMT 120.0%。结果表明，该方法准确，能同时定量分析氯噻烷酮原料药和制剂中的杂质。表中总结了氯沙利酮原料药和片剂中杂质的回收率5个和6个，分别是。

3.2.6条。定量限和定量限

定量限度是样品中被分析物的最低含量，可以用适当的精度和准确度定量测定。检出限是样品中可被检测到但不一定被定量为确切值的分析物的最低量。氯噻酮的定量限为0.4μ和0.32克/毫升μg/mL, II级杂质含量为0.3μ和0.24克/毫升μg/mL, III级杂质为0.3μ和0.25克/毫升μg/mL分别采用目测法和校准曲线法。氯沙利酮的LOD为0.12 μ和0.10克/毫升μg/mL，二级杂质为0.09 μg/mL和0.085 μg/mL, III级杂质为0.09μg/mL和0.083 μg/mL分别采用目视法和标定曲线法。

3.2.7。鲁棒性

稳健性是衡量一种分析方法是否不受方法参数微小但故意变化的影响，并表明该方法用于样品常规分析的可靠性。表中总结了稳健性结果7个表明该方法的精度与鲁棒性结果无显著差异。因此，即使缓冲液的pH值、流速和波长稍有变化，该方法仍具有相当的准确性和重现性。

3.2.8。溶液的稳定性

氯沙利酮、二级工艺杂质和三级工艺杂质的百分比差异分别为1.0%、5.88%和4.17%，均在10%的合格标准范围内。稳定性研究表明，氯沙利酮标准溶液在25℃下稳定40 小时，杂质加标溶液在25℃下稳定36 小时。

3.2.9。过滤器的选择研究

用0.45 进行滤纸相容性研究μm尼龙过滤器和0.45μ聚偏氟乙烯过滤器采用氯沙酮标准溶液和内部工艺杂质工作标准溶液。氯沙利酮标准溶液的相似因子结果为1.00，在0.95到1.05的可接受标准范围内。未过滤溶液和过滤溶液之间的计算绝对百分比差异在规范限值内。因此，两者均为0.45 μm尼龙过滤器和0.45 μmpvdf滤波器兼容，可用于常规分析。

3.2.10。稳定性研究

稳定性研究提供了原料药或成品质量的证据，由于温度、湿度和光照等多种环境因素，原料药或成品的质量可能随时间而不同。因此，对原料药和配方进行了长期和加速稳定性研究。稳定性研究，如表所示八，揭示了％的杂质水平在EP内和室内两个API和制剂规格界限。

4.结论

现有文献未报告的氯噻酮杂质和降解产物确定一个单一的方法。甲新修改的RP-HPLC法可以分离所有分析物，即药典列出的，在内部相关，和降解杂质，具有可接受的分辨率和拖尾因子。降解研究表明，所形成的未知杂质可以用同样的方法得到很好的解决，而从内部工艺相关的杂质的任何干扰。所提出的方法是精确和准确的两个氯噻酮API和片剂中检测可能的已知和未知的杂质。因此，可以用于与氯噻酮API和片剂制剂常规杂质分析此发达方法。

数据可用性

作者确认支持本研究结果的数据可在文章和/或其补充信息文件中获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者感谢Vinayak Godbole博士，IQGEN-X Pharma Pvt Ltd, Navi Mumbai，对工作的指导。作者感谢美国科技(科技),印度政府,提供研究基金来执行这项工作在项目题为“国家研究和培训设施的综合分析发现策略,开发和测试的药物,制药和保健品“DPRP孟买药学院计划,孟买。项目批准令编号:VI-D&P/ 552/2016-17 /TDT(G)，日期为2017年3月7日。

补充材料

图3.1:百菌灵原料药和内部工艺杂质的特征。图3.1.1:百菌清API i期内部工艺杂质的红外光谱。图3.1.2:百菌清API i期内部工艺杂质1H NMR谱图。图3.1.3:百菌清API i期内部工艺杂质的质谱。图3.1.4:氯噻酮API第二阶段内部工艺相关杂质的特征。图3.1.5:百里通API第二阶段内部工艺杂质的红外光谱。图3.1.6:1H NMR谱氯噻酮API第二阶段内部工艺相关杂质。图3.1.7:百菌清API第二阶段内部工艺杂质的质谱。表3.1.1:氯噻酮API第二阶段内部工艺杂质的IR和1H NMR数据的解释。图3.1.8:百菌清API第三阶段内部工艺杂质的特征。 Figure 3.1.9: IR spectra of the chlorthalidone API stage-III in-house process-related impurity. Figure 3.1.10: 1H NMR spectra of the chlorthalidone API stage-III in-house process-related impurity. Figure 3.1.11: Mass spectra of the chlorthalidone API stage-III in-house process-related impurity. Table 3.1.2: Interpretation of the IR and 1H NMR data for the chlorthalidone API stage-III in-house process-related impurity.(补充材料)

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