超高效液相色谱串联质谱分析肺癌患者干血斑中的丙烯酰胺

摘要

丙烯酰胺（AA）是在食品，香烟烟雾和在暴露于丙烯酰胺的环境中发现的致癌物质。本研究旨在分析在干血点（DBS）的肺癌患者与吸烟纪录的样品AA级别，不吸烟的记录，同时也否定的空白。AA水平的分析通过液相色谱串联质谱法（LC-MS / MS）和DBS提取使用蛋白质沉淀技术来确定。质量检测，使用正电子喷雾电离（ESI）和多反应监测（MRM）型用做米/zvalues of 71.99 > 55.23 for acrylamide and米/z心得安的内标为260.16 > 116.04。有吸烟记录的肺癌患者AA水平在4.670范围内μ克/ mL至11.986 μ克/毫升。无吸烟记录的肺癌患者AA水平在2.041之间μ12.702 g / mLμ克/毫升。上AA水平上负空白数据是在2.72的范围内 μ3.51 g / mLμ克/毫升。独立样本的结果t- 试验（ )表明有吸烟记录的患者与无吸烟记录的患者AA水平无显著差异。然后对肺癌组与阴性空白组进行Mann-Whitney检验，两组间有显著性差异( ）。

1.介绍

肺癌是导致死亡的最主要癌症之一(180万人死亡，占总死亡人数的18.4%)，其预后不良[1]。大约85%的肺癌是由吸烟引起的。吸烟含有60多种有毒化合物，可导致癌症生长。2]。香烟烟雾中致癌物的一种组分是丙烯酰胺[3.]。据报道，香烟的烟雾中含有超过1 μg /香烟[4,5，据估计，吸烟可导致丙烯酰胺摄入3μ克/公斤/天(5,6]。

国际癌症研究机构(IARC)将丙烯酰胺归类为2A类(可能对人类致癌)。丙烯酰胺的形成也存在于高碳水化合物含量的食物中，如炸薯条、薯片、炸红薯、爆米花、谷类食品、面包和饼干等，这些食物经过120℃以上的高温加热阶段[7]。这样的加热可导致氨基酸天冬酰胺和其还原糖[之间的美拉德反应8,9]。世界卫生组织指出，在一般人口中，通过食物摄入丙烯酰胺的平均值在0.3-0.8之间μ克/千克体重/天[7]。

CYP2E1将丙烯酰胺代谢成甘氨酸，甘氨酸是最终的致癌物。缩水甘油胺会与DNA结合形成DNA加合物，这被认为是暴露丙烯酰胺致突变和致癌性的主要原因[8,10,11]。研究丙烯酰胺继续从动物进行给人类。血液采集方法也得到了发展，使拍摄对象可以更舒适。干燥血点（DBS）biosampling方法是一种新集中发展方法，并且它具有诸如收集过程的几个优点是相对容易的，需要的血液只有小体积，并且是微创以允许研究对象的舒适感;即在DBS纸张吸收在基体中分析物往往是在室温下稳定，使得它可以被存储和分布容易[12]。

本研究的研究对象为有吸烟史和无吸烟史的肺癌患者。本研究旨在发现两组丙烯酰胺水平是否存在差异。然后将肺癌患者组与阴性空白组进行比较。DBS中丙烯酰胺的分析以前从未做过。因此，本研究采用LC-MS/MS对DBS中丙烯酰胺进行分析，并开发验证了生物分析方法[13]。

2。材料和方法

2.1。参考标准样品和材料

丙烯酰胺和心得安购自Sigma-Aldrich(新加坡)。甲酸、乙腈高效液相色谱级和用于分析的甲醇均来自默克公司(德国达姆施塔特)。PerkinElmer 226从PerkinElmer(威豪，美国)获得。

2.2。准备解决方案和标准

将10mg的AA溶于10ml的超纯水中，得到浓度为1000的AA原液μ克/毫升。将原液稀释，得到中间溶液为100μ克/毫升。工作溶液是通过用超纯水的中间溶液的稀释制备。工作溶液用于制备校准样品通过用全血稀释工作溶液以一定范围的2.5-100以获得一系列浓度的 μ克/毫升。AA的质量控制样品，以7.5的浓度与所述工作溶液的相同方法单独制备 μ克/毫升，50 μ克/毫升，和75 μg/mL用于低、中、高质量控制(QCL、QCM、QCH)。普萘洛尔原液以甲醇配制，浓度为1000μ克/毫升。工作溶液是通过用甲醇中间溶液的稀释制备得到的10的浓度 μ克/毫升。

2.3。样品制备

血液样品通过AA的工作溶液的稀释制备，以获得在2.5-100的范围内的浓度 μ克/毫升。每个浓度被发现多达30 μ然后在室温下干燥2.5小时。干燥后，纸被切成两段，放入试管中。然后，内标溶液加入100μL (10μ普萘洛尔溶液g/mL)和500μL甲醇。混合液涡流1分钟，超声振动5分钟。以4,015 g离心1分钟，400 g离心μL of the supernatant was evaporated at 40°C with pressure 8 psi for 20 minutes by a vacuum equipped with nitrogen gas. The residue was reconstituted with 100 μL的流动相0.1%甲酸溶液在水和乙腈(40:60)中超声处理20分钟。涡旋30秒，737g离心3分钟。然后,70年μ上清液的L的插入小瓶中，为10的最终混合物 μL注入LC-MS/MS系统。

2.4。质/女士

使用UPLC BEH C18柱(1.7)进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析μ米,100 mm × 21 mm). Acrylamide analysis used a mobile phase of 0.1% formic acid and acetonitrile with gradient elution. The electrospray ionization (ESI) source was operated in a positive mode with a multiple reaction monitoring (MRM) type. The MRM transition of the precursor to product ion pairs was米/zof 71.99 > 55.23 for AA and米/z心得安的内标为260.16 > 116.04。Capillary voltage used is 3.50 kV with 50 V cone voltage. Desolvation temperature, gas flow rate, and gas cone source flow rate were set at 400°C, 650 L/h, and 1 L/h. The inlet voltage for acrylamide and propranolol is 26 V and 35 V, respectively. The voltage in the collision chamber for each compound is 8 V and 18 V. The injection volume used is 10 μL.

2.5。方法验证

验证分析是根据美国食品和药物管理局(2013)和欧洲药品管理局(2011)生物分析验证指南进行的[14,15]。

2.6。选择性和特异性

通过分析空白全血和DBS纸上标记AA和IS(内标)的空白全血的选择性和特异性。评估使用来自不同对象的至少六个矩阵。内源性成分的峰面积应小于LLOQ峰面积的±20%和IS峰面积的±5%。

2.7。线性

空白样品，样品零，和AA（2.5,5，7.5，15％，37.5，50％，75的8个浓度，和100 μ制备用于校准曲线的全血g/mL)，并斑点在DBS卡片上。每个样品通过绘制AA峰面积与IS峰面积的峰面积比进行分析。每个浓度复制三次，用相同的方法分析。校准曲线是可以接受的,如果非零校准器±15%的名义集中在每个验证运行除LLOQ±20%的名义在每个验证运行和75%浓度和至少六个非零校准器水平应该在每个验证运行符合标准。

2.8。准确度和精密度

准确度和精度在从质量控制的库存（LLOQ，QCL，QCM和QCH）四种浓度进行了分析。帧内和日间评估用五次重复执行，并且需要的方差（％CV）±系数百分数除了LLOQ 20％15％，准确度（％差异）应在±15％除了LLOQ±20％。

2.9。复苏

通过分析全血中的QC样品和提取后加入分析物三种浓度(QCL、QCM和QCH)的空白全血样品，计算回收率。将QC样品和萃取后加入分析物的样品在不同浓度下的峰面积比进行比较，得到回收率%。对于每个浓度，该步骤重复三次。如果% CV为±15%，回收率可接受。

2.10。基质效应

基体效应是通过比较工作标准溶液和，将其用在两种浓度（QCL和QCH）分析物掺入拔牙后空白全血样品之间分析物的峰面积进行评价。The %CV of the ME should not be more than ± 15%. The standardized matrix factor values with the internal standard should obtain the acceptance range of 0.80 to 1.20.

2.11。结转

残留物通过在量化的上限校准标准后注入的空白样品进行评估。测得的峰面积不应在定量（LLOQ）的下限和内标物的峰面积的5％是分析物的峰面积的大于20％，分别。

2.12。稳定

在室温(25℃)下0、6和24小时的短期和在贮藏温度(−20℃)下0、7、14、21和28天的长期长期，评估丙烯酰胺和心得安的贮存液稳定性。试验进行了三次重复，差异值不应超过10%。通过分析短期储存(在室温下保存0、6、24小时)和长期储存(在冰箱(−20℃)存放1、10、15天)后的QCL和QCH，检测样品的稳定性。通过分析QCL和QCH(在自动采样器温度下保存0和24小时)来测试自动采样器的稳定性。试验进行了3次重复，%diff和%CV值不应超过15%。

2.13。该方法的应用

这项研究已与数030 / KEPK / III / 2019获得来自Dharmais肿瘤医院的健康研究道德委员会的伦理审查。干血斑从18名患者组成的6名肺癌患者与吸烟记录和12名肺癌患者无吸烟记录收集。采血通过用无菌采血针头刺破手指来完成。The blood that has been taken was then collected in a 0.5 mL K_3.EDTA真空采血管。在那之后,30μL立即在DBS纸上发现血液，并在室温下干燥约2.5小时。干燥的DBS样品储存在一个密封的袋子里，袋子里有干燥剂，直到分析时间。

对有吸烟记录和无吸烟记录的肺癌患者DBS样本丙烯酰胺分析结果进行数据处理。用所建立的线性回归方程计算丙烯酰胺水平。然后，用独立样本进行统计检验t-检验和Mann-Whitney检验，以观察组间的显著差异。

3.结果与讨论

3.1。色谱系统和样品制备

在本研究中，LC-MS/MS使用了三重四极杆质谱分析仪和多反应监测(MRM)质谱模式。MRM之所以被使用，是因为它在复杂矩阵(如DBS)的分析中使用得很好。流动相使用0.1%甲酸和乙腈，梯度洗脱剖面如表所示1。Elution was performed using a gradient-type elution with a total analysis time of 3 minutes. The chromatograms of blank, zero, LLOQ, QCL, QCM, and QCH are shown in Figure1。样品中的分析物的色谱示于图2。

制备方法是一种非常重要的分析方法，特别是在DBS样品中含有大量来自全血成分的杂质，会干扰化合物的分析。因此，需要合适的制备方法来将分析物从基体中分离出来。对DBS纸上的血斑体积和提取方法的各个步骤进行优化，得到如上所述的样品制备方法。沉淀蛋白技术(PPT)与SPE、LLE等样品制备方法相比，具有快速、简单、可适用于高通量筛选的优点。

3.2。方法验证

在之前的研究中，在同一实验室进行了完整的验证试验。通过绘制峰面积比(y)与内标物之比较(x）AA的。标准曲线是线性的超过2.5-100.0的浓度范围 μ克/毫升为AA。如表2，在LLOQ和QC样品(QCL、QCM和QCH)上进行的分析内和分析间精密度和准确度实验(QCL、QCM和QCH)满足EMA和FDA的要求，除非LLOQ平均%差异浓度不超过±20%，否则平均%差异和%偏置要求不得超过±15%。运行内部和运行之间的不精确值分别在1.89 - 7.07%和4.12 - 9.51%之间。在运行内和运行之间的准确度估计的%偏差为6.12至10.35%和9.88至11.73%。LC-MS/MS方法应排除任何基质效应。通过对空白萃取后加入的分析物面积与溶剂中标准溶液面积的对比分析，可以看出基体的影响。该方法的基质效应为96.33 ~ 105.68%，变异系数(CV)在10%以下。回收率分别为95.51%、84.61%、90.61%，CV值分别为0.68%、1.56%、0.68%。恢复数据见表3.。

3.3。DBS样品中丙烯酰胺的分析

所有样品均采用上述验证的方法进行分析，并计算AA的浓度。无吸烟记录肺癌患者、有吸烟记录肺癌患者、阴性空白AA水平的曲线图结果如图所示3.。丙烯酰胺含量最低和最高分别为2.042μ克/ mL和12.70 μ克/毫升。肺癌患者与吸烟记录的平均的7.64丙烯酰胺含量的 μ克/ mL和不吸烟记录具有平均为6.6的丙烯酰胺含量的 μ克/毫升。独立样本t- 试验进行，结果表明，AA级别的患者和没有吸烟记录没有显著差异。这微不足道的差异是由于多种因素，包括肺癌患者与吸烟纪录已经停止与各个时间段吸烟。其他因素都在AA加料来源吸烟可以增加AA级别，如生活方式（饮食）和香烟烟雾的环境。暴露于AA可以从含有AA，香烟烟雾，甚至饮用水的食物，和所有的是人们的日常消费。对肺癌患者的食物消费习惯的数据显示在表4。SK07的DBS含有丙烯酰胺在12.07的最高浓度 μ克/毫升。根据调查问卷获得的数据，SK07是摄入含丙烯酰胺食物最多的患者，而且在家庭和工作环境中常年被动吸烟。SK05的DBS中AA的浓度最低为2.042μ克/毫升。这与从问卷中获得的数据是一致的，即SK05是摄入含丙烯酰胺食物最少的患者，并且是非被动吸烟者。

被人体吸收AA的福利将会被CYP2E1代谢成它的代谢产物，使AA的代谢率强烈地受到这种酶的活性的影响。基于由佩尔[进行的研究16而在无吸烟记录的肺癌患者中AA的高水平也可能与多态性有关，t等位基因rs2480258可以降低CYP2E1的功能活性，从而影响AA在人体内的代谢率。无吸烟记录肺癌患者和有吸烟记录肺癌患者AA水平的曲线图结果如图所示4。

然后对肺癌患者的丙烯酰胺水平进行Mann-Whitney试验，并将其与未患癌症且丙烯酰胺食物摄入量最低的阴性空白对照。分析结果( )肺癌患者丙烯酰胺水平与阴性空白有显著差异。肺癌患者组与阴性空白组丙烯酰胺水平分析曲线图见图5。

4.结论

该分析方法可以用于使用LC-MS / MS来分析丙烯酰胺和普萘洛尔作为DBS的样本在标准具有2.5 LLOQ μ克/毫升。肺癌患者AA水平为2.041μ12.702 g / mLμ克/毫升。独立样本t-检测结果 （ )表明肺癌患者中丙烯酰胺水平与有吸烟记录者和无吸烟记录者无显著差异。Mann-Whitney测试结果( )肺癌患者丙烯酰胺水平与阴性空白有显著差异。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在本文中。

的利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

致谢

这项研究由印尼Depok印尼大学研究和社区服务理事会(DRPM)资助，资助编号为NKB-0480/UN2.R3.1/HKP.05.00/2019。作者还感谢Dharmais癌症医院在取样过程中促进了研究对象的可用性。

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