IJAC 国际分析化学杂志》上 1687 - 8779 1687 - 8760 Hindawi 10.1155 / 2020/2015264 2015264 研究文章 丙烯酰胺的分析肺癌患者的干血滴Ultrahigh-Performance液相色谱串联质谱分析 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7217 - 7900 Harahap Yahdiana 1 爱丽霞 卡米拉 1 Starlin Zenshiny 1 Jayusman Achmad Mulawarman 2 威尔金斯 查尔斯·L。 1 教师的药店 印尼 Depok 印尼 ui.ac.id 2 功能肺学的医务人员 Dharmais肿瘤医院 雅加达 印尼 dharmais.co.id 2020年 19 5 2020年 2020年 20. 02 2020年 04 05年 2020年 19 5 2020年 2020年 版权©2020 Yahdiana Harahap et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

(AA)是一种致癌物质丙烯酰胺在食品、香烟和一个环境暴露于丙烯酰胺。本研究旨在分析AA含量干血现货(DBS)与吸烟的肺癌患者的样本记录,不吸烟记录,和消极的空白。AA含量的分析是由液相色谱串联质谱(质/ MS)和DBS提取使用蛋白质沉淀技术。质量检测是使用积极的电子喷雾电离(ESI)和多反应监测(MRM)类型 米/ z71.99 > 55.23丙烯酰胺和的值 米/ z260.16 > 116.04普萘洛尔的内部标准。AA含量与吸烟肺癌患者记录是4.670的范围内 μ11.986 g / mL μ克/毫升。AA含量不吸烟肺癌患者记录是2.041的范围内 μ12.702 g / mL μ克/毫升。数据AA含量在2.72 -空白 μ3.51 g / mL μ克/毫升。独立样本的结果 t以及( p > 0.05 )表明,AA含量吸烟患者和那些没有吸烟记录没有显著差异。然后,Mann-Whitney测试进行肺癌组和消极之间的空白组,两组之间的显著差异被发现( p < 0.05 )。

 印尼 nkb - 0480 / UN2.R3.1 / HKP.05.00/2019 1。介绍

肺癌是一种最大的癌症死因(180万人死亡,占总数的18.4%),由于这种癌症的预后不良( 1]。大约85%的肺癌病例是由吸烟引起的。香烟包含60多个有毒化合物,从而导致癌变组织( 2]。一个组件在香烟致癌物丙烯酰胺( 3]。据报道,香烟含有超过1 μg (AA /香烟[ 4, 5,据估计,吸烟可以导致丙烯酰胺摄入量3 μ克/公斤/天( 5, 6]。

国际癌症研究机构(IARC)将丙烯酰胺分为2组(可能对人类致癌)。还发现在丙烯酰胺的形成与碳水化合物含量高的食物,如薯条、薯片、油炸红薯,爆米花,麦片,面包,饼干,通过高温加热阶段120°C以上( 7]。这样的加热会导致氨基酸天冬酰胺及其之间的美拉德反应还原糖( 8, 9]。世界卫生组织指出,在一般人群中,丙烯酰胺通过食物的平均摄入量在0.3到-0.8之间 μ克/公斤体重/天( 7]。

CYP2E1代谢将丙烯酰胺成glycidamide,作为最终的致癌物质。Glycidamide将绑定到DNA形成DNA加合物,这被认为是一个主要原因的致突变性和致癌性接触丙烯酰胺( 8, 10, 11]。对丙烯酰胺的研究继续进行,从动物到人类。采血方法也被开发出来,主题可以更舒适。干血现货(DBS) biosampling方法是新发达的方法,它有几个优点,如收集过程相对简单,只需要体积小的血液,和微创允许舒适的研究对象;矩阵分析物的吸收在DBS论文往往是在室温下稳定,以便它可以存储和分布式容易( 12]。

在目前的研究中,涉及科目不吸烟肺癌患者和记录。本研究的目的是找出是否有两组的丙烯酰胺含量的差异。然后,肺癌患者也比消极的空白组。丙烯酰胺的分析DBS从未做过的。因此,本研究丙烯酰胺分析与生物分析法DBS使用质/ MS方法开发和验证( 13]。

 2。材料和方法 2.1。参考标准样品和材料

丙烯酰胺和普萘洛尔从Sigma-Aldrich购买(新加坡)。甲酸、乙腈高效液相色谱级和甲醇进行分析得到从默克公司(达姆施塔特,德国)。从PerkinElmer PerkinElmer获得了226年的论文(美国沃尔瑟姆)。

 2.2。制备的解决方案和标准

股票的解决方案的AA AA是由溶解10毫克10毫升超纯水获得浓度为1000 μ克/毫升。股票的解决方案是稀释获得中间解决方案在100年 μ克/毫升。准备的工作方案与超纯水稀释中间解决方案。工作解决方案被用来准备校准样品稀释工作解决方案与全血获得一系列浓度范围为2.5 -100 μ克/毫升。质量控制样品的AA准备分别在相同的程序工作溶液浓度为7.5 μ50 g / mL, μ克/毫升和75 μg / mL为低,中,高质量的控制(QCL、药物和QCH)。普萘洛尔原液制备甲醇的浓度1000 μ克/毫升。工作解决方案准备用甲醇稀释中间解决方案获得的浓度为10 μ克/毫升。

 2.3。样品制备

血液样本被稀释的准备工作解决AA获得浓度在-100年2.5的范围 μ克/毫升。每个浓度发现了多达30 μL在星展纸,然后为2.5小时在室温下干燥。干燥后,纸切成两块,放入管。然后,内部标准的解决方案是添加多达100 μL (10 μ)和500 g / mL心得安的解决方案 μL甲醇。混合涡1分钟,用近5分钟。混合物在1分钟4015克、离心机和400年 μL在40°C上层清液的蒸发压力8 psi 20分钟由真空配有氮气。残留是与100年重组 μL(流动相水和乙腈0.1%的甲酸溶液(40:60),用了20分钟。30秒的样本涡和离心机在737 g为3分钟。然后,70年 μL的上层清液插入瓶,和最后一个10的混合物 μL女士是注入到质/系统。

 2.4。质/女士

使用液相色谱串联质谱分析(质/ MS)与Acquity UPLC本·C18柱(1.7 μ米,100毫米×21毫米)。丙烯酰胺分析使用甲酸和乙腈0.1%的流动相梯度洗脱。电喷雾电离(ESI)来源是在积极与多反应监测(MRM)模式类型。MRM转变的先驱产品离子对 米/ zAA和71.99 > 55.23 米/ z260.16 > 116.04普萘洛尔的内部标准。毛细管使用电压是3.50 kV 50 V锥电压。反溶剂温度、气体流量、气体锥源流量设定在400°C, 650 L / h, 1 L / h。入口电压对丙烯酰胺和普萘洛尔是26 35 V, V和分别。电压在碰撞室为每个化合物8 V和18 V。使用的注射量是10 μl

 2.5。方法验证

验证试验进行了基于美国食品和药物管理局(2013)和欧洲药品局(2011)生物分析法验证指南( 14, 15]。

 2.6。选择性和特异性

选择性和特异性评估通过分析空白全血和空白全血掺入了AA和(内部标准)发现在DBS纸。评估使用至少6矩阵从不同的学科。内源性成分的峰面积LLOQ应小于±20%的峰面积和±5%的峰面积。

 2.7。线性

空白样品,零样本,AA和八个浓度(37.5,2.5,5,7.5,15日50,75年和100年 μg / mL)全血的校准曲线,发现在DBS卡就做好了准备。分析了每个样本绘制AA的峰面积和峰面积比值。每个浓度三次复制和分析过程。校准曲线是可以接受的,如果非零校准器±15%的名义集中在每个验证运行除LLOQ±20%的名义在每个验证运行和75%浓度和至少六个非零校准器水平应该在每个验证运行符合标准。

 2.8。准确度和精密度

在四个浓度的准确度和精密度进行了分析质量控制股票(LLOQ, QCL、药物和QCH)。内部和interday评估进行五个复制,需要%方差系数(% CV)除LLOQ 15%±20%,和准确性(% diff)除LLOQ应±15%±20%。

 2.9。复苏

复苏是通过分析计算QC样品的全血和飙升的空白全血样品分析物postextraction三个浓度(QCL、药物和QCH)。QC样品的峰面积比和被分析物的样品飙升postextraction比较在每个浓度获得%回收价值。每个浓度的步骤被重复三次。复苏的值是可以接受的,如果%简历±15%。

 2.10。基体效应

基体效应评估通过比较分析物的峰面积之间的工作标准溶液和飙升的空白全血样品的分析物postextraction两个浓度(QCL和QCH)。%的简历我不应该超过±15%。标准化矩阵因子值与内部标准应获得0.80到1.20的可接受范围。

 2.11。结转

结转后被注入空白样品评估校准标准上限的量化。测量峰面积不应超过20%的被分析物的峰面积的下限量化(LLOQ)和内部标准峰面积的5%,分别。

 2.12。稳定

储备溶液稳定性的丙烯酰胺和普萘洛尔是在短期内评估0,6日和24小时在室温(25°C)和长天0、7、14、21日和28日在存储温度(−20°C)。三个复制的方式进行试验,% diff值不应超过10%。样品稳定性测试后通过分析QCL和QCH短期存储(在室温下保持为0、6和24小时)和长期存储(在冰箱(−20°C)几天1,10和15)。Autosampler稳定性还测试了通过分析QCL和QCH(保存在Autosampler温度0和24小时)。在三个复制的方式进行试验,% diff和% CV值不应超过15%。

 2.13。应用程序的方法

本研究取得了卫生研究的伦理审查的Dharmais肿瘤医院伦理委员会030号/ KEPK / III / 2019。收集干血滴从18岁患者组成的6吸烟肺癌患者记录和12没有吸烟肺癌患者记录。血液采样是通过一根手指戳破无菌柳叶刀针。的血液被收集在一个0.5毫升K3EDTA真空采血管。在那之后,30 μL血液立即被发现在DBS纸在室温下干燥2.5小时左右。干DBS样本存储在一个密封袋含有干燥剂,直到时间进行分析。

数据处理进行DBS样品中丙烯酰胺分析的结果没有吸烟的肺癌患者和记录。利用线性回归方程计算了丙烯酰胺含量。然后,使用独立的样本进行统计检验 t以及和Mann-Whitney测试组之间存在明显区别。

 3所示。结果与讨论 3.1。色谱系统和样品制备

在这项研究中,质/女士使用三重四极式质量分析仪和多反应监测(MRM)质谱模式。使用MRM因为它很好地用于分析一个复杂的矩阵如星展。使用的流动相为0.1%甲酸乙腈与梯度洗脱剖面如表所示 1。洗脱了使用渐变类型洗脱总分析时间3分钟。空白的色谱,0 LLOQ QCL,药物和QCH如图 1。分析物在样品的色谱图所示 2。

概要的流动相洗脱。

一分钟 流量(毫升/分钟) 流动相(%) 移动阶段B (%) 一分钟
0.00 0.2 40 60 0.00
0.05 0.2 60 40 0.05
1.00 0.2 60 40 1.00
1.20 0.2 50 50 1.20

色谱(a)的空白,(b)为零,(c) LLOQ, (d) QCL, (e)药物,QCH (f)。

色谱分析物的样品:(a)的样本SK05和(b)的主题SK07样本。

制备方法在分析是一个非常重要的方法,尤其是在星展样品含有许多杂质从全血组件,可以影响化合物的分析。因此,合适的制备方法是必要的,这样他们就可以独立的分析物的矩阵。发现的血液的星展纸,每一步也优化提取方法,和样品制备方法得到如上所述。沉淀蛋白质技术(PPT)优于其他SPE和米歇尔等样品制备方法,即快速、简单,可以适应大规模筛选。

 3.2。方法验证

完整的验证试验进行了在前面的研究和在同一个实验室。校准曲线的线性决意通过绘制峰面积比( y)分析物的内部标准与标称浓度( xAA)。校正曲线的线性浓度范围的2.5 - -100.0 μ为AA g / mL。如表所示 2内部和interassay精密度和准确度实验进行LLOQ和QC样品(QCL、药物和QCH)实现EMA和FDA的要求% diff和%的平均偏差要求不超过±15%,除非平均LLOQ % diff浓度不超过±20%。在运行和运行不精确之间在1.89 - 7.07%和4.12 - 9.51%范围,分别。之间的精度内运行和运行约为6.12 - 10.35%和9.88 - 11.73% %的偏见。质/ MS方法应该排除任何矩阵的影响。矩阵的影响被分析物之间的分析显示区域添加空白后提取工艺相比的面积标准溶液的溶剂。这个方法显示一个可接受的基体效应从96.33到105.68%与可变性(CV)低于10%。经济复苏得到的百分比为95.51%,84.61%,和90.61% % CV 0.68%, 1.56%, 0.68%。复苏的数据如表所示 3。

总结完整的验证结果。

被分析物 质量控制 浓缩的。( μg / mL) 精度(%的简历) 精度(%偏见) 基体效应 内部standard-normalized矩阵因子
在运行 之间的运行 在运行 之间的运行 平均%±标准差 %的简历 平均%±标准差 %的简历
AA LLOQ 2.50 7.07 9.51 −10.35 −11.73
QCL 7.50 3.89 4.12 6.12 9.88 105.68±12.34 11.68 0.91±0.13 14.11
药物 50.0 3.12 4.48 9.49 13.71
QCH 75.00 1.89 5.41 −6.29 11.75 96.33±8.77 9.11 0.98±0.10 10.11
普萘洛尔 117.05±5.77 4.93

质量控制:质量控制、LLOQ:量化的下限,QCL:低水平,药物:中等水平,QCH:高水平,和简历:可变性,许多实验。

丙烯酰胺的数据恢复过程。

精确的浓度(ng / mL) 区域 %绝对复苏 平均(%) SD 简历(%)
没有提取 与提取
7500.00 54671.004 52228.059 95.53 95.51 0.65 0.68
55565.730 53426.156 96.15
56385.820 53478.938 94.84
50000.00 315153.000 271452.594 86.13 84.61 1.32 1.56
324646.469 272028.719 83.79
333239.719 279632.250 83.91
75000.00 382069.188 346540.781 90.70 90.61 0.62 0.68
368825.469 331795.656 89.96
372055.938 339249.281 91.18
3.3。丙烯酰胺在DBS示例分析

所有样品进行了分析使用验证方法如上所述,和AA的浓度进行了计算。图的结果AA级没有吸烟的肺癌患者记录,与吸烟肺癌患者记录,和消极的空白图所示 3。总的来说,2.042的最低和最高的丙烯酰胺含量 μ和12.70克/毫升 μ克/毫升。与吸烟肺癌患者记录平均7.64的丙烯酰胺含量 μg / mL和不吸烟记录的丙烯酰胺含量平均为6.6 μ克/毫升。独立样本 t以及执行,结果表明,AA含量和不吸烟患者记录没有显著差异。这微不足道的差异是由于几件事情,包括与吸烟肺癌患者记录与不同时期停止吸烟。其他因素是AA的来源除了吸烟能够增加AA的水平,如生活习惯(饮食)和吸烟的环境。接触可以从食物中含有AA AA,香烟烟雾,甚至饮用水,这是一个人们的日常消费。食物消费习惯的肺癌患者数据如表所示 4。DBS SK07含有丙烯酰胺的浓度最高的12.07 μ克/毫升。基于从问卷调查获得数据,SK07 acrylamide-containing病人消耗的食物最多,而且成为被动吸烟者多年来在家庭和工作环境。DBS的SK05 AA在2.042的最低浓度 μ克/毫升。这是按照从问卷调查获得的数据,SK05是病人消耗acrylamide-containing食物至少和nonpassive是吸烟者。

图DBS interpatient和消极的空白的丙烯酰胺含量的样品。

肺癌病人的食品消费习惯的数据。

学科代码 食品消费 总
油炸产品 面包产品 咖啡 爆米花 快餐
SK01 1 4 0 0 0 5
SK02 1 4 0 0 0 5
SK03 0 3 0 0 0 3
SK04 1 2 0 0 2 5
SK05 1 2 0 0 0 3
SK06 2 3 3 0 1 8
SK07 0 4 4 1 1 10
SK08 2 1 0 0 0 3
SK09 3 1 0 0 0 4
SK10 0 1 0 0 0 1
SK11 2 3 1 0 2 8
SK12 1 3 2 0 0 6
SKT01 1 2 0 0 1 4
SKT02 1 4 0 0 0 5
SKT03 1 2 0 0 0 3
SKT04 2 1 0 0 1 4
SKT05 1 4 3 0 0 8
SKT06 1 1 0 0 1 3
平均 5

AA被身体吸收将由CYP2E1代谢到它的代谢物,所以AA的代谢率强烈受这种酶的活性的影响。根据佩尔进行的研究( 16),高水平的AA在没有吸烟的肺癌患者记录也可以与多态性有关,T-allele rs2480258扮演了一个角色在减少CYP2E1的机能活动会影响AA人体新陈代谢的速率。图的结果AA级没有吸烟的肺癌患者与吸烟和肺癌患者记录在图所示 4。

图结果AA级的肺癌患者吸烟和不吸烟记录;SK电讯与吸烟是肺癌病人记录,和SK是没有吸烟的肺癌患者记录。

Mann-Whitney测试被执行在肺癌患者的丙烯酰胺含量与消极空格没有癌症疾病和最小的丙烯酰胺的食品消费。结果分析( p < 0.05 )之间的显著差异中丙烯酰胺含量的肺癌患者及其负面的空白。图形之间的丙烯酰胺含量的分析肺癌患者组和消极的空白组中可以看到图 5。

图之间的丙烯酰胺含量的分析肺癌患者组和消极的空白;SKP是一个肺癌病人,和SN -空白。

 4所示。结论

这种分析方法可以用于分析丙烯酰胺和普萘洛尔DBS的标准样品使用质/ MS LLOQ为2.5 μ克/毫升。肺癌患者AA含量从2.041不等 μ12.702 g / mL μ克/毫升。独立样本 t以及结果( p > 0.05 )表明,丙烯酰胺含量在肺癌患者和不吸烟记录没有显著差异。Mann-Whitney测试结果( p < 0.05 )之间的显著差异中丙烯酰胺含量的肺癌患者及其负面的空白。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

本研究为研究理事会资助和社区服务(DRPM),印尼,Depok市印尼,格兰特nkb - 0480 / UN2.R3.1 / HKP.05.00/2019数量。作者也承认Dharmais癌症医院,促进在抽样过程中研究对象的可获得性。

 印度尼西亚卫生部 印度尼西亚共和国,Pusat数据丹Informasi Kementrian Kesehatan InfoDatin“停止KANKER” 2015年 雅加达,印度尼西亚 印度尼西亚卫生部 http://www.pusdatin.kemkes.go.id/resources/download/pusdatin/infodatin/infodatin-kanker.pdf 2015年国家卫生服务、肺Cancer-Causes-NHS, https://www.nhs.uk/conditions/lung-cancer/causes/ 美国癌症协会。2019年肺癌, https://www.cancer.org/cancer/lung-cancer.html 欧文 j . M。 菲尔。 M。 克拉克 e . C。 克龙比式 即K。 史密斯 w·c·S。 评价一个便携式测量一氧化碳 预防医学 1988年 17 1 109年 115年 10.1016 / 0091 - 7435 (88)90076 - x 2 - s2.0 - 0023900197 城市 M。 Kavvadias D。 里德尔 K。 谢勒 G。 欺骗者 a。R。 尿mercapturic酸和血红蛋白加合物的剂量测定法丙烯酰胺在吸烟者和非吸烟者暴露 吸入毒物学 2006年 18 10 831年 839年 10.1080 / 08958370600748430 2 - s2.0 - 33745242875 废话 n . C。 麦克丹尼尔 l . P。 Gamboa Da Costa G。 Churchwell m . I。 Beland f。 Doerge d·R。 测定血清丙烯酰胺和glycidamide毒性动力学B6C3F1老鼠使用LC-ES / MS / MS 癌症的信 2004年 207年 1 9 17 10.1016 / j.canlet.2003.10.017 2 - s2.0 - 1842420536 Harahap Y。,Pembentukan Akrilamida Dalam Makanan Dan Analisisnya, 2006, III, 3, 107–116 Lampen 一个。 伦茨 D。 埃勒斯医生 一个。 无角的 M。 布罗尔 H。 Zagon J。 剂量依赖的分子作用的丙烯酰胺和glycidamide人类癌症细胞系和人类主要的肝细胞 毒物学字母 2013年 217年 2 111年 120年 10.1016 / j.toxlet.2012.12.017 2 - s2.0 - 84872540863 Mottram d S。 Wedzicha b . L。 道森 a . T。 丙烯酰胺与美拉德反应的产品 自然 2002年 419年 6906年 449年 450年 10.1038 / 419448 2 - s2.0 - 0037015489 芬耐尔 t·R。 萨姆纳 s . c . J。 斯奈德 r·W。 伯吉斯 J。 弗里德曼 m·A。 人类动力学消除尿代谢物的丙烯酰胺 毒物学的科学 2006年 93年 2 256年 267年 10.1093 / toxsci / kfl069 2 - s2.0 - 33748754641 金 t·H。 胫骨 年代。 金 k B。 测定丙烯酰胺,各生物矩阵由液体glycidamide chromatography-tandem质谱及其药代动力学研究中的应用 Talanta 2015年 131年 46 54 10.1016 / j.talanta.2014.07.042 2 - s2.0 - 84906080511 李 W。 张 J。 谢霆锋 f·l·S。 手册的质生物分析法 2013年 美国新泽西州霍博肯 约翰•威利& Sons . n:行情)。 Harmita K。 Harahap Y。 Supandi 年代。 液体Chromatography-Tandem质谱(质/女士) 2019年 印度尼西亚雅加达强烈阵雨 ISFI Penerbitan 1 124年 食品及药物管理局 生物分析方法验证指导 色谱法杂志》上。B,分析技术在生物医学和生命科学 2018年 1043年 25 EMEA 指导生物分析方法验证 2011年 荷兰阿姆斯特丹 欧洲药品局、社区有关医药产品代码供人类使用 https://www.ema.europa.eu/documents/scientific-guideline/guideline-bioanalytical-method-validation_en.pdf 佩尔 l • H。 Cipollini M。 中的多态性rs2480258 CYP2E1与不同比例的丙烯酰胺在人类体内的新陈代谢 档案的毒理学 2018年 92年 6 2137年 2140年 10.1007 / s00204 - 018 - 2211 - 2 2 - s2.0 - 85046718524