同时测定Bergapten、Imperatorin Notopterol, Isoimperatorin鼠血浆通过高效液相色谱荧光检测及其应用的口服后的药代动力学和排泄研究羌活incisum提取

文摘

特定的、敏感的和可靠的高效液相色谱法和荧光检测(HPLC-FLD)首先优化,然后用于同时量化bergapten, imperatorin, notopterol, isoimperatorin鼠血浆使用osthole作为内部标准。与乙酸乙酯液液萃取是用于治疗大鼠血浆样品。进行了分离与常春藤™ODS(4.6×250毫米,5列μ米),在40°C的温度梯度洗脱。激发和发射的荧光检测器是设置为300和490海里,分别。量化的下限bergapten、imperatorin notopterol,和在大鼠血浆isoimperatorin 4, 40岁,4 ng和2毫升⁻¹,分别。盘中,interday精密度和准确度的四个香豆素类在可接受标准。的恢复方法是令人满意的范围为80.3 -114%。验证方法已成功用于同时测定的四个香豆素类羌活incisum提取和药代动力学和排泄研究bergapten, imperatorin, notopterol, isoimperatorin老鼠。

1。介绍

近年来,草本植物被广泛研究由于其使用新的功能性膳食微量营养素和植物化学物质的来源可能是重要的治疗慢性疾病(1]。草本植物作为替代疗法由于其来源一致有效性水平和负担得起的价格2- - - - - -4]。草本植物也包含许多化合物协同作用给他们他们的治疗效果5,6]。

羌活incisumTing例h . t . Chang(家庭伞形科)是一种重要的传统中草药与根状茎被称为“Qianghuo。“这是分布在中国的高海拔地区(即。,2500 - 4000),其中最引人注目的是西藏。这种草药的根状茎和根一直用于治疗炎症性疾病,如风湿性关节炎,作为止痛剂用于治疗头痛、发汗的,等等7- - - - - -10]。“Qianghuo”作为原料的一部分用于超过13中国处方用于疾病的治疗11]。

香豆素类、精油的主要化学成分和phenoloids发现的根和根茎n incisum(12- - - - - -14]。这些例子包括isoimperatorin、notopterol imperatorin, bergapten,阿魏酸,p-hydroxyphenethyl anisate,和亚油酸6,15]。许多药理研究已经完成n incisum和报告各种治疗效果。正在进行很多研究香豆素在最近一段时间由于他们拥有巨大的药理作用16]。研究表明,香豆素类,如isoimperatorin notopterol, bergapten具有抗炎,镇痛,和抗癌活性11,17- - - - - -19]。这些对5-lipoxygenase香豆素类也有抑制作用,环氧酶(9,11,19]虽然notopterol的抗炎效应是由于其抑制活性的血管通透性(20.]。Bergapten据报道,刺激黑色素瘤细胞和黑素原生成可以作为anti-gray头发代理(21)和imperatorin已被证明是活跃在调制的γ-氨基丁酸(GABA)受体(22]。

同时一些分析方法已经发展到确定的组成n incisum以控制其质量。这些方法中有HPLC-UV [23],HPLC-DAD [6),LC-ESI-MS /女士[7],HPLC-DAD-ESI-MS [9]。Bergapten、imperatorin notopterol, isoimperatorin被用作标记指纹分析和质量控制的根和根茎n incisum(23,24]。此外,反相高效液相色谱法用于量量化内容,bergapten, notopteroln incisum和n forbesii评估这种草药的质量获得了来自中国不同地区的(24]。另一方面,小已报告在这个中药药代动力学研究。p-hydroxyphenethyl anisate作为唯一使用RP-LC方法分析物(15]。这种化合物可能并不代表整个草,因为它是唯一的复合研究在许多不同的化合物存在于草。虽然UPLC-MS /女士是用来确定香豆素在等离子体25),它是昂贵的常规分析。为了获得进一步的信息在药理和临床效果n incisum药代动力学和定量研究需要一个相对便宜,具体,敏感、可靠的方法同时测定的香豆素类在这中医扮演重要的角色。

荧光检测是最敏感的,选择性,具体检测方法分析有机和无机化合物。香豆素是有趣的荧光团的荧光发生极大的变化取决于取代基的化学结构和职位介绍了他们在26]。在这项研究中,我们开发了一个相对便宜的,具体的,敏感、可靠HPLC-FLD方法同时测定大鼠血浆和应用四个香豆素类的药代动力学和排泄研究这个方法n incisum口服后提取的老鼠。

2。材料和方法

2.1。植物材料

的根茎和根n incisum草药是来自中国四川的购买。这个物种被识别和验证Lin-Ma博士(天津中医药大学、天津、中国)。凭证标本都需要在天津中医药大学。

2.2。化学药品和试剂

成都必须生物科技有限公司(中国)成都提供参考标准,即bergapten, imperatorin, notopterol isoimperatorin和内部标准(是)osthole。HPLC-grade乙腈和甲醇、乙酸乙酯、甲酸是获得天津市康科德科技有限公司(天津)。Milli-Q学术系统(美国微孔,米尔福德,MA)是用于净化去离子水用于高效液相色谱流动相。

2.3。器和色谱条件

高效液相色谱法分析了安捷伦1100液相色谱(美国安捷伦科技)配备了四元泵、脱气器,一个autosampler,列恒温器室和二极管阵列检测器(爸爸)。一个安捷伦荧光探测器耦合到安捷伦系统。常春藤ODS柱进行分离(4.6毫米×250毫米,5μ米),在40°C的温度梯度洗脱。激发和发射的荧光检测器被设置为300 nm和490 nm,分别。分析涉及到一个恒定的流速为1.0毫升分钟⁻¹和注射量30μl (A)的流动相组成水甲酸(0.1%,v / v)和(B)乙腈脱气后通过声波降解法使用梯度洗脱的15 - 30% B在0到10分钟,30 - 42% B在10到20分钟,42% B在20到65分钟,42 - 80% B 65 - 70分钟,和80 - 90%,70 - 75分钟。梯度洗脱的reequilibration时间是10分钟。由于相似的极性imperatorin notopterol,这是基本保持42%的乙腈45分钟,确保两个化合物分离。

2.4。的制备n incisum提取

1公斤的干草药的n incisum制备和提取8 L 2 h使用的90%的乙醇回流提取方法。乙醇部分被收集和残渣进一步根据与8 L(60%乙醇回流提取2 h。然后解决方案相结合,允许冷却,过滤,提取集中。提取收益率是20.16%。

2.5。股票的解决方案和校准标准的准备

在股票的解决方案,准备适量bergapten, imperatorin, notopterol, isoimperatorin分别和每个被溶解在甲醇达到1.0毫克毫升的浓度⁻¹。四个香豆素类的化学结构如图所示1。股票的解决方案的四个分析物被混合,然后工作解决方案的混合标准由适当的连续稀释原液与甲醇混合使用40 - 10000 ng毫升的浓度⁻¹ng bergapten, 400 - 100000毫升⁻¹ng imperatorin, 40 - 10000毫升⁻¹ng notopterol, 20 - 5000毫升⁻¹isoimperatorin。股票的解决方案也被溶解在甲醇和甲醇稀释的最终浓度1µ克毫升⁻¹和所有的解决方案都储存在4°C到分析时被带到室温使用前。

10微升整除的混合标准bergapten, imperatorin notopterol, isoimperatorin工作解决方案添加到100人μL无毒鼠血浆获得最终的浓度有一系列4 ng - 1000毫升⁻¹ng bergapten, 40 - 10000毫升⁻¹ng imperatorin, 4 - 1000毫升⁻¹ng notopterol, 2 - 500毫升⁻¹isoimperatorin准备混合校准标准。

2.6。样品预处理和质量样品

100年的一项μL整除的血浆样本,10μ我的解决方案是添加。提取的样本vortex-mixed 2分钟,1000年μL乙酸乙酯,然后在18000×g离心10分钟。上层清液被转移到另一个离心管和蒸发干燥使用氮气。干残留于100年重组通过添加μL甲醇。的解决方案是动摇和ultrasonicated 2分钟。当时在18000×g离心10分钟。30μL解决方案的运行和高效液相色谱法进行分析。

混合质量控制(QC)样品在高、中、低、激增和LLOQ浓度是由适当的混合标准溶液为空白的大鼠血浆,给等离子体浓度范围,600年60岁,12日和4 ng毫升⁻¹bergapten, 6000、600、120年,ng 40毫升⁻¹imperatorin, 600年,60岁,12日和4 ng毫升⁻¹6 notopterol,到300年,30日,ng和2毫升⁻¹分别为isoimperatorin,紧随其后的是上述相同的样品制备和提取方法。

2.7。方法验证

2.7.1。特异性

特异性的血浆样品评估通过比较空白血浆样品从六个不同的批次,空白血浆样品掺入了4个化合物,和等离子体后口服n incisum提取。

2.7.2。校准曲线和LLOQ

标定样本准备将每个混合标准储备溶液加入空白血浆样本获取最终浓度范围的4 ng - 1000毫升⁻¹ng bergapten, 40 - 10000毫升⁻¹ng imperatorin, 4 - 1000毫升⁻¹ng notopterol, 2 - 500毫升⁻¹isoimperatorin。情节的分析物和内标峰面积的比值(是)(由相应的浓度()毫升,⁻¹)是用于获取每个复合使用的校准曲线加权因素。量化的下限(LLOQ),这是最低的浓度标准曲线的信噪比(S / N)是大于5,相对标准偏差(RSD为,)和准确度在20%在美国食品药物管理局指导下80%到120%的范围,确定了。

2.7.3。精密度和准确度

准确度和精密度都是使用了6批混合QC样品在四层在同一天(盘中),在三个不同的日子(interday),最后确定使用校准曲线。盘中和interday精度表示的相对标准偏差(RSD)和定义的精度是比较测量浓度使用校准曲线的理论浓度化合物添加到空白血浆。

第2.7.4。恢复和稳定

经济复苏的决心通过比较提取血浆样品中观察到的峰面积的位飙升样本。在等离子体的稳定性分析物评估通过分析质量控制样品(高、中、低和LLOQ)在下列条件:三个冻结/解冻周期,postextraction稳定(12 h在室温下存储),并长期稳定(存储在−1个月80°C)。

2.8。应用程序在老鼠药代动力学研究

PK的研究按照指南进行护理和使用实验动物和动物伦理委员会批准天津中医药大学。八公Sprague-Dawley老鼠重180 - 220克都保存在天津中医药大学动物中心(天津)与控制条件(温度25±2°C和相对湿度55±5%)。他们被允许免费获取食物、水和环境适应实验之前7天到12 h。根据临床剂量每天用于人类,老鼠服用口服剂量的4.2 g公斤⁻¹n incisum提取悬浮在0.5%羧甲基纤维素钠盐溶液(CMC-Na)和一个血液样本(200μL)收集在时刻0,0.083,0.167,0.25,0.5,0.75,1、1.5、2、3、4、6、8、12、24小时到heparin-pretreated管从窝orbitalis每个老鼠口服后提取。血浆立即通过离心法收集的血液在3300 g×10分钟和储存−20°C到分析。

2.9。排泄研究大鼠尿液、粪便和胆汁

十六岁男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(200±20 g)分为两组(组1在代谢笼收集尿液和粪便样本,而第二组从胆管收集胆汁样品使用聚乙烯管)。组1,老鼠口服n incisum提取溶解在0.5%的剂量CMC-Na 4.2 g公斤⁻¹和置于代谢笼单独启用收集的尿液和粪便样本。收集的尿液和粪便样本的时间间隔0 - 4,4 - 8人,8 - 12,12 - 24,24-36 36-48,48-60,60 - 72 h。组2,老鼠与水合氯醛麻醉剂量的0.3 g公斤⁻¹管理的腹腔内。用聚乙烯管在胆管插管确保连续流的胆汁。老鼠被管理的提取剂4.2 g公斤⁻¹和胆汁样品被收集在不同的时间间隔(0 - 1、1 - 2、2 - 3、3 - 4、4 - 5、5 - 6、6 - 7、7 - 8,和8 - 9 h)。后获得的尿液和胆汁的量测量,这些样本在−储存20°C到分析。尿液和胆汁样品的制备与上述等离子体样品制备。另一方面,粪便样本收集后在烘箱干40°C。测量粪便样本的权重后,他们被迫击炮实现统一的粉;0.1克粪便测量粉和1毫升甲醇添加在1.5毫升聚乙烯管,3分钟充分混合,超声提取30分钟。他们然后在18000×g离心10分钟。上层清液转移到使用HPLC-FLD瓶进行分析。

2.10。数据分析

DAS软件(药物和统计1.0,皖南医学院,中国),一个计算机程序,用于计算管理后的药代动力学参数n incisum提取。Bergapten, imperatorin, isoimperatorin分析使用单舱分析notopterol加工时使用两舱制分析基于Akaike (AIC)估计的信息标准。

3所示。结果和讨论

3.1。优化内部的荧光光谱和选择标准

激发和发射波长的四个香豆素类检查获得优化的山峰有更好的信号/噪音(S / N)。经过测试,维护不同激发波长和发射波长,反之亦然,300海里的激发波长和发射波长490 nm的被选择为优化荧光检测波长的同时测定四种香豆素类。完成调查的适用性osthole内部标准。这是一个furocoumarin和香豆素类结构相关研究。此外,osthole有合适的保留时间和没有干扰内源性矩阵。此外,香豆素类和osthole很容易通过高效液相色谱分离。尽管osthole组件之一n incisum在先前发表的文献,提取osthole中没有检测到老鼠后等离子体口服剂量的4.2 g公斤⁻¹n incisum提取。因此,osthole被选为内部标准来确定四个香豆素类n incisum。

3.2。四个香豆素的量化n incisum

盛名的方法也被应用于确定比例四个香豆素类的内容n incisum提取和,随后,每个香豆素的老鼠。bergapten的内容,imperatorin、notopterol isoimperatorin是0.04%,1.10%,0.14%,和0.57%,分别。每日剂量的n incisum准备在诊所10 g用于一个成年人,而真正的剂量鼠4.2 g公斤⁻¹。因此,每个香豆素在老鼠的数量剂量为1.68毫克公斤⁻¹bergapten, 46.2毫克公斤⁻¹imperatorin, 5.88毫克公斤⁻¹notopterol, 23.9毫克公斤⁻¹isoimperatorin。

3.3。方法验证

3.3.1。特异性

图2显示了色谱空白血浆,空白血浆样品中掺入混合标准化合物,和真正的血浆样品的口服后从一只老鼠n incisum提取一个剂量的4.2 g公斤⁻¹。分析物之间的良好分辨率实现,也没有干扰来自几个不同的观察大鼠血浆来源破坏四个香豆素类的分离和定量。在真正的药代动力学研究中样本,没有代谢物或内源性物质干扰所有分析物的决心。

3.3.2。校准曲线,降低量化的极限

数据校正曲线、线性范围和LLOQ的回归方程提供了四种香豆素类表1。

3.3.3。萃取效率

提取复苏的四个香豆素类范围从80.3%到114%的rsd为不到15%在所有四个混合浓度(表进行了研究2)。提取的效率直接依赖于浓度。因此,液液萃取乙酸乙酯是非常有效的从血浆中提取四个香豆素类样本。

3.3.4。准确度和精密度

盘中,interday精度包括精度值如表所示3。分析物的精度范围从86%到113%,盘中interday和精度从3%到17%不等的四个香豆素类研究。因此,再现性、准确性和可靠性试验的证实。

3.3.5。稳定

从稳定性测试结果如表所示4。发现,在一段时间内24 h,在大鼠血浆稳定混合标准autosampler也经过三冻结和解冻周期。降低大鼠血浆中的四个香豆素类的内容在任何条件下观察后不显著。这一结果表明,四种香豆素类可以同时确定大鼠血浆使用高效液相色谱方法开发。

3.4。药代动力学研究

方法被验证是反过来应用于药代动力学研究的四个香豆素类管理后的4.2 g公斤⁻¹大鼠口服。计算药代动力学参数的四个香豆素类1.0借助DAS药代动力学软件单舱模型提供了一个最佳适合的浓度时间曲线获得的数据除了notopterol香豆素类口服后表现为两舱制模型n incisum提取。平均浓度时间曲线如图3和药代动力学参数在表表示5。口服后n incisum提取、吸收()notopterol, imperatorin, isoimperatorin从鼠胃肠道被发现与所有化合物快速峰值低于2 h除了bergapten也达到了在大约3 h。平均最大浓度()bergapten, imperatorin、notopterol isoimperatorin在大鼠血浆分别为183.5±171.4,1667±1504,23.31±6.87,145.1±75.9 ng毫升⁻¹,分别。香豆素是重要的植物成分已知各种药理作用。从结果,大部分的香豆素类表现出迅速吸收进入血液的老鼠notopterol有最快的时间完全被吸收到血液根据。Bergapten展出的消除半衰期长12 h这意味着需要更长的时间Bergapten在大鼠组织被清除。Bergapten可以强烈蛋白结合的血液占这一观点。需要做进一步的调查说明原因。另一方面,imperatorin、notopterol isoimperatorin表现出较短的半衰期6 h内;因此这些化合物是消除血液中的速度与bergapten相比。imperatorin的半衰期为4.99±3.02 h是类似于观察以前的报告(26]。总药物在老鼠暴露在超过24小时,11955年,10975年是1638±2490±101.6±34.8,830.5±762.4 ng毫升⁻¹bergapten h, imperatorin、notopterol isoimperatorin,分别。

3.5。分析物的排泄研究鼠尿液,粪便,胆汁

bergapten累积排泄,imperatorin、notopterol isoimperatorin尿液,粪便,胆汁决心如图4。后口服n incisum提取一个剂量的4.2 g公斤⁻¹老鼠,香豆素类可能在大鼠尿液中发现直到72 h。四个香豆素胆汁的量逐渐增加,直到大约6 h和保持稳定的时间除了imperatorin和isoimperatorin让整个时间逐渐增加胆汁的排泄。

在尿液,bergapten水平被观察到的快速增加从12至48 h。bergapten累积排泄的尿液是9.5724 + 1.6891%。那些imperatorin、notopterol isoimperatorin 0.2759 + 0.0493%, 0.1171 + 0.0096%,分别和0.0084 + 0.0016%。Imperatorin和notopterol水平迅速增长从36到48 h,然后趋于稳定72 h。在粪便样本,bergapten表现出最高的累积与约80%的原型排泄bergapten排泄粪便样本。所有化合物的含量迅速增加从12 h 48 h,然后锥形72 h。累计排泄物23.4595 + 2.2545%,54.1083 + 4.4359%,和7.7284 + 2.2114% imperatorin, notopterol和isoimperatorin分别。结果表明,这些化合物通过粪便排泄大大路线。

4所示。结论

一个特定的、敏感的和可再生的HPLC-FLD方法同时测定的新开发bergapten, imperatorin, notopterol,反过来,isoimperatorin这是应用于药代动力学和排泄研究bergapten imperatorin, notopterol, isoimperatorin老鼠口服后n incisum提取物。该方法是准确和精确的使用一个简单的液液萃取治疗大鼠血浆。药代动力学和排泄的研究四个香豆素类(bergapten, imperatorin、notopterol isoimperatorin)可应用于评估的临床效率n incisum,望着药物的相互作用,以及这些化合物引起他们的协同效应。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

宰相谢安Yu和约翰Teye Azietaku这项研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项研究受到了中国国家自然科学基金(81503213和81503213),国家科技支撑计划项目(2014 ba105b01)项目的创新研究团队在大学天津(td12 - 5033)、PCSIRT (IRT-14R41)和国家科技委员会的大部分中国(2014 zx09304307001)。

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