抗菌和抗真菌活性的人类子宫内膜流体在自然循环

文摘

目的。一些微生物群模式与预后良好的体外受精和其他相关病理条件。子宫内膜流体吸入(脂肪酸)包含抗菌蛋白质丰富的implantative试管受精周期,但电弧炉的抗菌效果尚未解决。我们旨在评估人类子宫内膜的抗菌活性液体在自然循环。方法。电弧炉是通过胚胎移植导管在38岁女性,18-40岁,与普通周期参加生育诊所。抗菌活性的必需脂肪酸对两菌株进行了测试金黄色葡萄球菌;一个应变的链球菌agalactiae,粪肠球菌,大肠杆菌,肺炎克雷伯菌;和三个酵母(白色念珠菌,假丝酵母glabrata,假丝酵母krusei)。结果。所有的样品表现出对抗菌活性金黄色葡萄球菌。此外,32.4%的必需脂肪酸是积极与其他微生物化验,对其中四对二16.2%,5.4%。相比之下,没有表现出对抗菌活性大肠杆菌或k .肺炎。电弧炉样品之间的抗菌活性显著不同,我们未能观察cycle-related模式。结论。电弧炉提出了两种抗菌活性模式:(a)一个共同所有的样品,展示活动金黄色葡萄球菌和缺乏活动大肠杆菌和k .肺炎和(b)一个个性化的模式,展示活动对其他微生物测试。电弧炉样品之间的抗菌活性强度不同。我们的数据表明,子宫微生物群通过子宫内膜流体控制组件。

1。介绍

胚胎植入是一种最低效的辅助生殖的步骤1]。着床率一般小于70%,即使整倍体胚胎转移(2]。在这种情况下,越来越多的兴趣调查在植入子宫的作用。早期作品以来,诺伊斯et al。3),众所周知,子宫内膜发生组织学变化对胚胎植入的关键。

近年来,大量的不同的微生物已报告在不同的器官,如肠道、皮肤、肺(4),膀胱(5),和阴道6]。一些报道集中在子宫内膜微生物群。据报道,子宫内膜和阴道微生物群可以不同结构和组成(7,8]。的确,微生物群模式有利于在体外受精胚胎移植(IVF)周期被描述(8]。

此外,人工培养的子宫内膜细胞的分泌物显示抗菌活性(9- - - - - -11],抗菌肽在他们(已报告12- - - - - -14]。然而,这一活动的体内含义仍然未知。

我们以前显示子宫内膜液可以很容易地吸气(15)在不影响怀孕率,即使执行的同时,胚胎移植(16]。根据不同的分析方法和应用标准,有些超过800 (17]甚至超过2200个蛋白被发现在子宫内膜流体吸入(脂肪酸)和电弧炉的一些内源性肽抗菌活性(18]。另一方面,我们已经表明,试管婴儿抗菌肽的浓度在电弧炉是在周期着床高于那些植入失败(19]。

然而,实际的抗菌活性可能会是不同的抗菌蛋白质之间的相互作用的结果与内源性肽甚至与其他分子出现在子宫内膜液体。因此,我们试图分析脂肪酸的整体抗菌活动期间获得自然卵巢周期。

2。材料和方法

2.1。人口

人口正在研究由38个白人种族的女性参加十字形大学医院辅助生殖单位。入选标准如下:(我)年龄在18 - 40年;(2)正常的子宫超声;(3)28 - 30天的周期长度;(iv)以前正常宫颈细胞学;(v)输卵管条件的缺失;(vi)没有宫颈感染的历史,性传播疾病,盆腔炎,子宫内膜异位症、多囊卵巢疾病;(七)没有以前流产;(八)0 - 2前体外受精周期;(九)没有抗生素或激素治疗在过去的4个月; (x) normal ovarian reserve; (xi) day of endometrial cycle 5-28; and (xii) body mass index 。

病人特点如下:平均年龄 年,不孕的持续时间 年,体重指数 公斤/米²之前,94.4%的人没有孩子,没有以前的试管受精周期66.7%,22.2%的吸烟者。在42%的情况下,指示为体外受精是男性因素。

这项研究是通过我们的制度伦理和调查委员会(亚洲经济数据库代码11/45)。

2.2。子宫内膜液体收集器

病人被要求参与捐赠一个电弧炉的研究样本模拟胚胎移植过程中,通常表现为pre-IVF协议的一部分。书面知情同意。

无菌一次性阴道窥器放置不使用阴道润滑剂。颈在白带杜绝的情况下访问外部操作系统,排放是用无菌纱布轻轻删除。脂肪酸收集方法最近报道(16,19]。导管的胚胎移植导管(·弗莱德曼,医学院Instrumentos Esteriles, SA,西班牙)是通过子宫颈管插入,在无菌条件下,不接触阴道壁或ectocervix。腹部超声指导是为了方便使用通过子宫颈(1)和防止导管接触子宫底。与温和的负压吸气应用的示例10毫升注射器连接到导管和50 - 200μL必需得到[16,19]。与宫颈液防止污染,抱负在颈的内部操作系统中断,特别注意被送往避免伤害子宫底或子宫颈和子宫内膜组织或血液样本污染脂肪酸。大量血迹样本被丢弃。

因为没有一个标准化的技术获得电弧炉进行抗菌活性分析,我们使用两种方法。在研究的第一部分,样品( ;EF-01 EF-19 EF-26)排入标准低温管,导管尖端是,把切成相同的管。在第二部分的研究中,驱逐电弧炉后,里面的导管与1毫升无菌生理盐水冲洗。样本立即冻结在−80°C到处理。在实验室里被处理之前,第一组的样本被填满1毫升最终用无菌盐水体积和导管尖端涡流15秒后被删除。第一种方法进行拖动子宫颈管的一些细菌的风险可能产生一些抗菌物质。在第二种情况下,导管将避免这种潜在的内部清洗污染的样本。

电弧炉两种方法收集的样本并不在同一个病人因为电弧炉是非常稀缺的,有一个风险,获得第一个样品的操作会影响质量的第二个。

2.3。评估从电弧炉样品的分离和鉴定微生物的增长

十μL每个稀释的样本,从“削减提示”样本组和“刷新导管”集团被接种到哥伦比亚与5%琼脂补充羊血(美国BD)和孵化 °C。另一个10μ每个样本接种到人的L整除,Rogosa和夏普琼脂(夫人;美国Sigma-Aldrich)和孵化 °C公司5%₂的气氛。

细菌的DNA来自最常见的菌落类型隔离样品受到16 s rRNA基因的PCR扩增使用细菌通用引物27 f和1522 r被康et al。20.]。扩增子序列比较与存储在NCBI数据库来识别孤立的细菌。

2.4。抗菌活性必需的样品:汤采用微量测定

电弧炉样本轻轻的在均质旋转轮在4°C为30分钟,然后离心机在2500克15分钟消除细胞碎片。

澄清的电弧炉对三个样本化验假丝酵母压力(白色念珠菌SC 5314,假丝酵母glabrata写明ATCC 90030,假丝酵母krusei写明ATCC 6258)和6个菌株(大肠杆菌434年摄影,肺炎克雷伯菌144年摄影,链球菌agalactiae摄影183 t,粪肠球菌481年摄影和两个金黄色葡萄球菌细胞壁摄影435参考应变和临床分离耐甲氧西林)。写明ATCC代表美国类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和摄影Coleccion de Cultivos诺拉蒂波(Paterna,瓦伦西亚,西班牙)。假丝酵母种虫害是常规种植Sabouraud琼脂(BD)的维护 °C 24 h,而细菌生长在营养琼脂(Sigma-Aldrich)在相同的条件下。

估计抗菌活性必需在96 -孔板,在指南的临床和实验室标准协会(CLSI)协议M-27-A3酵母(21[],M07-A9细菌22),适应我们的环境。简单地说,假丝酵母菌株接种在100年μL RPMI-MOPS,细菌生长在Mueller-Hinton误事。每个被补充了25μL相应的澄清电弧炉样品。板还包括一个正增长控制微生物(没有电弧炉样品)和消极的培养基控制(没有电弧炉样品和微生物),以及与不添加微生物增长控制电弧炉样品。盘子被孵化 °C,增长抑制参照相应的积极控制评估视觉在24 h (48 h金黄色葡萄球菌)使用以下范围:-,没有抑制;+,轻微抑制减少(少于50%的细胞颗粒);+ +,中度到高抑制(≥50%);和+ + +,抑制经济增长。成长总是盲目地评估相同的调查员(MB-V)。

2.5。统计分析

分类变量的统计协会与卡方分析或确切概率法,和值< 0.05被认为是统计学意义(IBM®SPSS统计v.24®)。

3所示。结果

3.1。在月经周期分布的电弧炉抽样

大多数电弧炉样品(28/38)收集在中间天13到19岁之间的周期(EF-12,采样16天,被排除在后续研究抗菌活性),而只有五个是收集5和12天之间,另一个五黄体期后期,天24至28(表1)。

二十个样品包括导管的尖端,而其余18从导管子宫内膜液体被刷新。在这两种情况下,电弧炉样本由1毫升最后用无菌盐水体积之前在实验室正在处理。

3.2。微生物生长必需的样品

样品没有微生物增长约50%的脂肪酸在哥伦比亚琼脂(17/38)或琼脂(21/38)(表夫人2)。与微生物增长情况下的比例明显高于导管尖端的电弧炉样品存储相比,那些被刷新了哥伦比亚琼脂(80%比27.8% ( ; )和60%比27.8%琼脂夫人( ; ))。分析16 s rRNA基因序列的殖民地从15电弧炉样品显示最丰富,经常孤立的微生物革兰氏阳性杆状细菌(乳酸菌spp。,主要是加氏乳杆菌),其次是殖民地的革兰氏阳性coagulase-negative葡萄球菌(葡萄球菌epidermidis)在5个样本(EF-04 06年10、12和26)。相比之下,其他殖民地EF-02 10和30只长在哥伦比亚琼脂被确定为放线菌urogenitalis和棒状杆菌属spp。

积极的微生物增长的频率高2 - 3倍样品保留导管尖端的比那些只包含内部清洗液体的导管。此外,从三的五液体培养液没有导管,但正增长琼脂夫人只取得了1 - 2殖民地。相比之下,一个样本,包括导管(EF-12,收集了16天的月经周期)产生了无数的殖民地;因为过度干扰微生物的抗菌活性分析,这对进一步的分析样本丢弃。

3.3。抗菌活性必需的样品

抗菌活性显示在表的数据1总结了在图1。几乎所有的电弧炉样品研究(34/37;91.9%)抑制增长金黄色葡萄球菌压力测试,其余三只样品抑制其中之一;没有电弧炉样品表现出完整的生长抑制金黄色葡萄球菌(表1)。除了抑制金黄色葡萄球菌,32.4%(12/37)的样本对只有一个活跃的其他微生物测试,对两个微生物,16.2%(6/37)和5.4%(2/37)和四个微生物(表1)。

样本总体而言,40.5%(15/37)必需减少的增长至少三种之一假丝酵母,其中五个实现完整的生长抑制。一些其他的必需脂肪酸是活跃的反对美国agalactiae(13.5%)或粪大肠(13.5%)。相比之下,没有稀释中的表现活跃大肠杆菌或k .肺炎(表1;图1)。

关于收集天必需在月经周期期间,所有样品表现出一定程度的活动金黄色葡萄球菌独立的日子(表集合1)。四个五个样本,减少了增长粪大肠得到中央的周期(第14 - 17天)和第五天25(表吗1)。而c . glabrata和/或c . krusei抑制了一些液体在不同地点采集的周期(表吗1),白念珠菌电弧炉是抑制只有四个样本天13和14;因此,活动白念珠菌有统计学关联( )与电弧炉的第一部分样本周期(天1 - 14),而第二部分(天14-28)。电弧炉三samples-EF04、EF06 EF26-were积极反对两种假丝酵母(c . glabrata和c . krusei)和two-EF01和EF27-against所有三个物种测试(白念珠菌,c . glabrata,c . krusei)。

虽然被小心地避免上皮出血在样本收集、抗菌活性美国agalactiae只有注册5个20样品中含有血液的痕迹(EF-01 05年11、14和25;表1)。

至于根据抗菌活性必需的存在可耕种的微生物样品,我们没有发现反的差异金黄色葡萄球菌活动:所有样品抑制的增长至少一两株(表进行测试1)。然而,抗菌活性与其他微生物测试有点更频繁的在电弧炉情况下微生物文化的夫人和/或哥伦比亚琼脂是积极的(15/23;65.22%)比那些没有可耕种的细菌(5/14;35.71%)( ; )(表1)。关于收集和存储方法,样本,包括导管尖端更频繁地与对微生物以外的活动金黄色葡萄球菌(14/19;73.68%)比那些只包含导管内的冲洗液(6/18;33.33%),这个协会是统计学意义( ; )。

4所示。讨论

描述了微生物种群的不同成分与人体的不同解剖位置(23]。主机和微生物群之间的相互作用已被证明在许多方面起着关键作用的人体生理学(24- - - - - -26]。

更少的了解比胚胎植入子宫的一面。调查植入子宫的一面的挑战包括子宫内膜周期性变化,控制周期变化,和卵巢刺激子宫内膜变化的影响,以及植入子宫内膜活检的潜在不利影响,如果接近胚胎移植的时间执行16]。在这种背景下,我们有我们的研究集中于电弧炉,可同时获得胚胎移植,在不影响植入率(16]。

莫雷诺et al。8)发现了一个有利的模式成功植入胚胎的子宫内膜微生物群在体外受精,以一个高的比例乳酸菌。在最近的一项研究关注的蛋白质成分脂肪酸的同时获得胚胎移植,我们从试管受精周期表明,电弧炉,植入发生(“implantative”周期)是丰富的抗菌蛋白质比电弧炉从“nonimplantative”周期19]。这是同意非常最近的数据从一个内生peptidomics-focused描述存在的质谱分析必需的与潜在的抗菌活性肽在这种液体18]。符合这一点,在网上选择预测抗菌肽合成和测试的体外抗菌活性。初步结果表明,事实上,这些肽抗菌活性(18]。以同样的方式,它最近暗示其为病原体感官先天免疫系统的分子模式,这可能会产生抗菌肽的释放到子宫腔(27]。

在目前的研究中,我们评估电弧炉的抗菌活性,其中包含许多不同的抗菌蛋白质和多肽,其合作甚至对立仍然未知。事实上,一些微生物存在于电弧炉也可以发挥抗菌作用。例如,乳酸菌属生产乳酸和短链脂肪酸,酸化环境在阴道的pH值≤4.5,禁止其他致病或dysbiotic细菌的生长在健康女性28,29日]。然而,关于子宫内膜,没有观察到的相关性之间的pH值和子宫内膜微生物群(8]。

样品污染的可能性是一个重大障碍调查子宫微生物群(30.]。没有标准化的方法研究人类子宫微生物群(30.]。在大多数的研究中,收集到的样本通过宫颈30.]。一些作者使用子宫内膜活检(31日),其他使用transcervical愿望通过胚胎移植导管(8,32- - - - - -34),然后把内容(没有冲洗导管),其他人用双腔导管,没有愿望,和分析转移导管的远端部分(7,35),和一些结合双腔导管等与灌洗和子宫内膜活组织检查36]。EF的愿望在无菌条件下已被证明是一种安全、有效的方法来评估子宫内膜微生物群(8,37]。我们进行这项工作,以评估潜在的抗菌活性子宫内膜流体的38岁女性在生育年龄。脂肪酸样本收集通过与一个愿望胚胎移植导管穿过宫颈操作系统,采取预防措施以避免污染微生物群与子宫颈。使用了两种不同的收集方法:(i)清空导管内容和存储样例导管尖端和(2)与生理盐水冲洗导管的内部。样品在我们的工作中,大约有一半的脂肪酸包含可耕种的微生物,在协议与数据说明在大多数健康女性子宫内膜腔不是无菌的(38]。

两倍的积极文化得到样品存储与导管尖端相比,样品没有它。殖民地的葡萄球菌epidermidis只有识别出这些样品存储与导管。它可以推测的外部表面导管保留子宫颈管的微生物数量,因此,微生物分析,似乎明智的收集只有内部液体的导管。然而,可行的样本类型主要包括细菌鉴定乳酸菌种虫害和在一个小得多的程度上放线菌urogenitalis和棒状杆菌属spp。乳酸菌种虫害是最常从脂肪酸分离出细菌样本,与之前的报道相一致的凌晨et al。39和莫雷诺和西蒙37]。尽管显著差异在阴道和子宫微生物群已报告8,33,34,40),据我们所知,宫颈癌和子宫微生物群没有比较。塞尔曼等人研究了子宫和ectocervical样本以及内部的导管,但是他们没有吸入样品和每个本地化的结果并不比(35]。

还有一个争论的方法分析子宫微生物。关于文化的可行的微生物,不到1%的样品中细菌生长,形成殖民地;此外,一些人可能包含样品数量有限的微生物(41]。另一方面,下一代测序样品(上天)分析必需包含少量的微生物可能扭曲了丰富的污染阴道微生物群(30.]。此外,挥动读数不区分生活和死亡的微生物,因此,子宫微生物种群可能高估了。

子宫已报告微生物群与月经周期波动时间(42[],卵巢刺激43,少数民族44),某些病理条件(42),和试管婴儿的预后37]。在我们的研究中,在自然循环执行的白人女性在生育年龄,我们一直未能建立一个明确的联系样品和可行的微生物群必需在月经周期采样的时间。然而,我们承认,只有少量的样本研究中央外循环的一部分。

关于抗菌活性,电弧炉样品在当下工作的体外生长抑制金黄色葡萄球菌在某种程度上,和可耕种的之间没有明显差异,nonculturable样本,样本之间,甚至在月经周期收集在不同的时间。许多潜在的抗菌肽已报告从人类子宫内膜组织培养(12- - - - - -14]。我们的结果是一致的同文化的子宫上皮细胞(45),显示生产抗菌因子,有效地杀死金黄色葡萄球菌和相关分泌白细胞蛋白酶抑制剂浓度。然而,在同一个子宫上皮细胞培养的研究[45),抗菌活性大肠杆菌也观察到,一个类型的活动,从我们的研究没有观察到任何病人。我们也无法找到任何活动k .肺炎在我们的病人的样本。另一方面,超过一半的电弧炉的样本研究女性(54.1%)表现出对其他微生物包括抗菌活性白念珠菌,c . glabrata,c . krusei,美国agalactiae和/或粪大肠。此外,我们的研究结果有关白念珠菌在协议与Wira et al。46),报告说,从上层女性生殖道分泌物的文化细胞抑制酵母和菌丝的形式的白念珠菌。

必须强调,有一个显著的异质性抗菌活性模式:(i)抗菌活性的强度明显不同样本之间的不同,和(2)除了金黄色葡萄球菌总是抑制,抑制比例必需的一些剩余的微生物化验从24.3%至10.8不等。此外,除了金黄色葡萄球菌电弧炉,32.4%的样本积极反对唯一剩下的微生物化验,16.2%两个微生物,对四种微生物只有5.4%。另一方面,它必须强调,许多微生物,尤其是厌氧细菌,在我们的研究中没有评估。

关于抗菌化合物的来源,除了子宫内膜组织,所建议的组织培养的研究中,一个不能排除一个关联效应来自子宫内膜腔的微生物群。同意这个,除了反金黄色葡萄球菌活动在每个样本,我们发现对其他测试抗菌活性微生物更频繁的样品中微生物文化是积极的。王等人。47认为抗菌活性乳酸菌种虫害产生乳酸和过氧化氢,在其他化合物,可以抑制潜在致病菌的生长,以及丝状形成的白念珠菌。尽管如此,子宫内膜的厌氧环境并没有促进过氧化氢生产乳酸菌。事实上,我们已经记录反假丝酵母活动超过三分之一的电弧炉样品,即使在情况没有增长乳酸菌在女士中被记录。关于收集和存储的方法,样品只包含液体冲从导管与最频繁有关积极的文化和抗菌活性。虽然样本数量有限,我们无法评估一系列的混杂因素,后一种方法可能是一个能够提供最可靠的信息对子宫微生物群及其抗菌活性。

在这项研究中,我们已经表明,电弧炉育龄妇女的样本具有抗菌活性对一些微生物可能影响体外受精结果。所有脂肪酸样品测试体外降低的增长金黄色葡萄球菌其中,许多抑制假丝酵母spp。粪大肠和/或美国agalactiae,但不是大肠杆菌或k .肺炎。我们所知,这是第一次报告的直接抗菌活性子宫内膜流体吸入样品在人类。

进一步的研究是必要的”来形容女性的子宫内膜流体做试管婴儿手术,以评估是否有原始生态足迹的抗菌活性之间的关系和植入成功。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

这项研究是通过我们的制度伦理和调查委员会(亚洲经济数据库代码11/45)。

同意

病人被要求参与捐赠一个电弧炉的研究样本模拟胚胎移植过程中,通常表现为pre-IVF协议的一部分。书面知情同意。

的利益冲突

作者报告无利益冲突。

作者的贡献

M Bregon-Villahoz负责样品分析,数据收集,手稿写作。MD Moragues分配给该协议开发、数据分析和手稿写/编辑。我Arrieta-Aguirre负责样品和数据分析。L期间,M Diez-Zapirain, M·伊格莱西亚斯,Exposito, MB -普列托分配给患者选择和样本收集。F Elortza Matorras,和M Azkargorta做了数据分析。R Matorras负责项目开发,病人的选择、样本收集、数据管理和分析,手稿写/编辑。

确认

本研究部分由格兰特生育创新从默克公司(- 2011),达姆施塔特,德国。m . Bregon-Villahoz接受者的大学的博士前的格兰特del Pais Vasco-Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV / EHU) (PIF19/316)。作者感谢DNA银行提供的技术和人力支持服务(SGIker)大学的巴斯克地区(UPV / EHU)和欧洲资金(ERDF和养)。中投董事长bioGUNE认证与奥乔亚的卓越奖西班牙Ministerio de y Competitividad隐藏MINECO (, 2016 - 0644)。

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