利用下一代测序技术对16S核糖体RNA基因进行焦磷酸测序，分析妇科肿瘤淋巴结切除术后感染淋巴囊肿中的致病菌

抽象的

背景．妇科肿瘤手术结合淋巴结切除术和盆腔放疗可产生淋巴囊肿，有时合并感染，导致脓肿。脓肿的真正致病菌并不总是能被发现，因为由于给药抗生素的假阴性结果和难以发现，包括厌氧菌。通过16S核糖体DNA的下一代测序(NGS)分析细菌群，可以揭示脓肿中真正的致病菌。这是第一个关于感染性淋巴囊肿病原体使用这项技术的报告。方法．研究对象为2015年7月至2016年9月在我院妇科肿瘤术后发生感染性淋巴囊肿的患者。使用-80°C保存的标本进行细菌菌群的NGS分析。对纯化的DNA样品进行两步PCR，以获得序列库。对序列数据进行处理，包括操作分类单元(OTU)定义、分类分配和OTU BLAST搜索。所有患者均给予书面知情同意，本研究由机构研究伦理委员会批准。结果．6例患者接受了穿刺引流。大多数病例的结果表明有单一病原体，包括葡萄球菌鹿斑菌，链球菌脱盐，链球菌等分，肠球菌糖酸盐，和大肠杆菌。结论．NGS显示淋巴囊肿感染的病原菌通常是单一菌株，如表面革兰氏阳性球菌或肠道细菌。应选择适当的抗生素来消除这些细菌。

1.介绍

妇科肿瘤手术加淋巴结切除加盆腔放疗可引起淋巴充血并产生淋巴囊肿。淋巴囊肿本身并不是一个临床问题，但有时会因感染而复杂化，导致脓肿。肿瘤治愈的患者出现这些问题可能会降低生活质量，这些发作可能在手术后立即发生到10年以上[1］．

在手术后开发的传染性淋巴细胞特别被认为是由侵入下肢和阴部的伤口侵入的细菌引起的，类似于蜂窝织炎;但是，大多数此类淋巴细胞没有识别的触发。因此，一种传染性淋巴细胞被认为具有与胃肠道源自胃肠道的骨盆脓肿的病因，其涉及不同致病性细菌[2，3.］．抗菌治疗和引流是推荐的，但脓肿存在于骨盆深处。相对安全的手术包括计算机断层扫描(CT)引导引流已经建立，但并发症的风险仍然存在。因此，应谨慎选择适应症。最初通常使用抗生素保守治疗，然后在病人没有恢复时进行穿刺[4，5］．

保守治疗后病情好转的患者，其病原菌往往是未知的。此外，从脓肿收集的液体通常通过革兰氏染色、培养试验和敏感性分析进行检查;然而，由于使用抗生素导致的假阴性结果以及包括厌氧菌在内的检测困难，真正的致病菌并不总是能被发现。在以往的个案报告中，常规培养测试的识别率从46%至100%不等[2，4，6］．

最近开发的下一代测序（NGS）现在可以用于检测脓肿中的真正致病细菌[7，8］．这与微生物组的研究方法相同。在NGS中，用16S核糖体DNA分析细菌菌群。也可以检测到死亡的细菌，这意味着在开始抗生素治疗后可以检测到细菌，而脓肿中真正的致病菌即使在正常培养试验中不太敏感，也可以检测到。本文首次报道妇科肿瘤治疗后感染性淋巴管瘤用NGS检测到致病菌。

2。材料和方法

2.1。耐心

受试者是在2015年7月至2016年7月在我们医院进行妇科癌症手术治疗的患者。感染淋巴细胞被诊断出在发烧，局部自发性疼痛，痛苦，血液试验数据中的炎症发现以及炎症基于周边地区增强的成像效应。患者仅患有抗生素治疗，然后如果没有发生改善，则经过经皮排水。通过基于缓解血液测试数据的疼痛，发热和炎症发现，通过参加医生来判断改进。在常规培养试验中使用排水样品，并且每个样品的一部分立即储存在-80℃。基于常规培养试验的结果，临床治疗患者，所有感染均已汇总。将储存在-80°C的样品进行NGS分析。因此，治疗不依赖于来自这些样品的数据。所有患者在收到对该研究的口头解释后，所有患者都提供了书面知情同意书。本研究经机构研究伦理委员会批准（批准编号20140406）并在Umin临床试验登记处注册（http://www.umb.ac.jp/ctr/index-j.htm）。

2.2。下一代测序

脓性排水样品在-80℃温度下储存直至DNA提取。使用核磷脂微生物DNA套件（Macherey-Nagel，Düren，德国）分离出基因组DNA。提取方案是根据制造商的指示进行的。从约500中提取DNA样品µ但病例4的样本DNA浓度太低，无法进行后续分析。因此，再次使用病例4中所有剩余的样本进行提取。

2.3。测序16s rRNA基因

对纯化的DNA样品进行两步PCR，获得序列库。首次进行PCR扩增使用16 s (V3-V4)宏基因组图书馆建设装备门店(Kusatsu豆类生物有限公司,日本)与引物对341 f(5‘tcg GCA GCG柠檬酸手枪GTG答亚美大陆煤层气有限公司AGA CAG有条件现金援助ACG GGN GGC WGC AG-3”)V3-V4对应区域的16 s rRNA基因。第二次PCR使用Nextera XT index Kit (Illumina, San Diego, CA)将Illumina测序仪的索引序列与条形码序列一起添加。用MiSeq Reagent Kit v.3在Takara Bio的MiSeq (Illumina)上对250对端碱基进行测序。使用CD-HIT-OTU 0.0.1、QIIME ver. iso对序列数据进行处理，包括OTU定义、分类分配和OTU BLAST搜索。1.8、DDBJ 16S rRNA数据库。

3.结果

在研究期间，9名患者接受了感染性淋巴囊肿的治疗。其中3例患者通过单独使用抗生素的保守治疗得到改善，6例患者接受了穿刺引流。收集所有患者的血液培养，并对引流患者进行常规培养试验。年龄、基础疾病、手术史、手术时间、化疗等免疫抑制、引流前使用抗生素、引流时间、MRI脓肿大小、抽吸物状态、发病时血培养、菌群NGS结果见表1．在6例中，脓肿的发展在手术后立即从手术后超过10年。在回收阶段，两个受试者接受化疗和发育脓肿。没有病人的3级或更高患者。只有一个主体在血液文化中是阳性的。大多数吸气均为黄色，透明，很少有表现出明显的脂肪。在这种脓肿中经常发现透明的黄色液体。诊断传染性淋巴细胞是基于发烧，局部自发性疼痛，烦躁，炎症发现的成像，以及引流症状的快速改善，即使没有脓性含量。

使用BLASTN执行同源性搜索，其中具有OTU的代表性序列作为DDBJ 16s RRNA数据库中的查询（从2018年3月6日获得）。顶部命中率被鉴定为细菌名称。结果显示在表格中2．通过PCR扩增16S小规模相关细菌的DNA，这允许识别环境和污染细菌。在消除环境和污染物中经常鉴定的细菌后，发现5例中的5例是由于单一感染葡萄球菌，肠球菌Saccharolyticus，大肠杆菌，链球菌功能性，和链球菌等分．这些结果表明，单个菌株如表面革兰氏菌或肠溶细菌的许多感染病例类似于使用常规培养测试检测到的致病细菌的研究中的那些[2］．使用NGS的分析没有发现隐藏的致病细菌;因此，在妇科癌症手术后，包括厌氧细菌的双重感染很少发生在传染性淋巴细胞中。

4。讨论

在这项研究中，不常规地进行排水，并通过参加医生来判断临床调查结果的指示。因此，在所有受试者中进行了先发制人抗生素，由于9个受试者中6种受试者的控制而进行刺穿。在常规培养测试中，由于先发制人抗生素的效果，一半受试者是阴性的。相比之下，在所有情况下，在NGS中检测到细菌。从发病的所有受试者收集的血液培养只在一个情况下是阳性的，这表明在这种传染病中检测血液培养中的致病细菌的困难。

本研究旨在鉴别真正的致病菌，并在收集所有患者样本后进行回顾性NGS。本研究结果将为感染性淋巴囊肿经验性治疗中抗生素的选择提供有用的资料。此外，病原体的高检出率提示了NGS的实用性。目前，使用NGS对每个患者进行细菌检测仍很昂贵，但该程序能迅速提供正确的结果，可用于治疗期间的临床诊断[8］．未来，减少NGS的成本和时间可能允许使用这种方法临床判断。然而，确定常规培养测试以确定抗微生物易感性。

本研究中所有样本均采用抗生素治疗后引流法采集。如果检测到16S rDNA, NGS可以识别死亡细菌，其敏感性远高于常规培养试验。然而，不能排除治疗导致假阴性结果的可能性，因为治疗减少了reads的数量[8］．

结果表明，具有多种病原体的复杂感染，包括厌氧细菌，似乎是罕见的。然而，在一个情况下，NGS检测到多种细菌。案例6具有淋巴细胞，其在包括肠道切除后立即产生的淋巴细胞。两侧开发的大尺寸的囊肿。在环境中通常检测到壳体6中的细菌菌株，并且可以是污染物。然而，淋巴细胞与肠道是理论上连续的。在这些情况下，在选择验证治疗和确定给药持续时间的选择抗生素时，保持复杂感染是重要的。实际上，在案例6中，在常规培养测试中没有检测到致病细菌;然而，由于症状爆发，包括发烧，需要长期施用口服左氧氟沙星。

在例4中,链球菌agalactiae在常规的文化测试中被发现，但是链球菌dysgalactiae在NGS中检测到。ProLX（Pro-Lab Diagnostics，Richmond Hill，On，Canada）用于使用B组链球菌进行胶乳凝集试验中的B抗原。链球菌dysgalactiae基于NGS的一致性率，占前5名菌株，这表明常规文化测试中的失败。Acinetobacter Johnsonii.在这种分析中也发现了在许多情况下，这可能是由于穿刺，储存，运输和分析期间的污染。

结论

应用NGS对感染性淋巴囊肿的真致病菌进行分析。与以往使用常规培养试验的研究一样，NGS显示淋巴囊肿感染的病原菌是单一菌株，如表面革兰氏阳性球菌或肠道细菌。应选择适当的抗生素来消除这些细菌。

数据可用性

用于支持本研究结果的NGS结果数据包括在文章中。

利益冲突

在这项研究中，所有作者都没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了JSPS KAKENHI基金18K16779号的支持。

参考

1. V.Weinberger，D. Cibula和M. Zikan，“淋巴细胞：妇科恶性肿瘤中的患病率和管理，”《癌症治疗专家评论》第14卷第2期3, pp. 307-317, 2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术
2. I. Kawamura, Y. Hirashima, M. Tsukahara等人，“妇科恶性肿瘤淋巴结切除术后盆腔淋巴囊肿感染的微生物学”，手术感染，卷。16，不。3，pp。244-246,2015。查看在：出版商的网站|谷歌学术
3. A. Hamada, C. Hwang, J. Fleisher等，“机器人前列腺切除术后感染盆腔淋巴囊肿的微生物学评估:培养阳性的潜在预测因素和最佳经验抗菌治疗的选择，”国际泌尿和肾脏学，卷。49，没有。7，pp。1183-1191,2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
4. K. Hiramatsu, E. Kobayashi, Y. Ueda等，“妇科肿瘤淋巴结切除术后感染淋巴囊肿引流的最佳时机”，国际妇科癌症杂志，卷。25，不。2，pp。337-341,2015。查看在：出版商的网站|谷歌学术
5. M. X. Pan，Y. Wang，Y. Yan等人，“患有子宫内膜癌患者骨盆淋巴结切除术后淋巴细胞感染的危险因素分析和最佳时间。中国国家医学杂志第97卷第1期23，第1765-1768页，2017。查看在：谷歌学术
6. N. Takeuchi, N. Toyota, Y. Nakamura等，“术后盆腔淋巴囊肿经皮导管引流术”，IVR：介入放射学，卷。25，不。2，pp。476-482，2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术
7. Y. G. Song, S. G. Shim, K. M. Kim等，“通过16S rRNA基因焦磷酸测序分析致化脓性肝脓肿的细菌，”微生物学杂志号，第52卷。6, pp. 504-509, 2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术
8. L. Guo，W. feng，X. Guo等，“下一代测序技术在检测到不同来源的脓肿，”杂志的感染第78期1, pp. 75-86, 2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术

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