生殖器取样部位对检测和定量的影响Ureaplasma妊娠期定量聚合酶链反应的物种

摘要

客观的．本研究旨在比较定量PCR (qPCR)的定性和定量重现性Ureaplasma物种(Ureaplasmaspp。）在整个怀孕期间并根据生殖器取样地点。研究设计．在妊娠5 - 14周(T1)期间，采集阴道、穹窿和两个宫颈样本。随机选取T1阳性和T1阴性孕妇，在第2 (T2)和第3 (T3)三个月重复采样。定性和定量的重复性分别用Cohen’s kappa (κ)、类间相关系数(ICC)和重复测量方差分析(log-transformed mean number of DNA copies for each sampling site)。结果．T1期间，51/127名女性阳性美国以及和8美国体(两组各4例)。在T2和/或T3时重复取样44/55名女性;43例(97.7%)在3个时间点均为阳性。κ范围为0.83 - 0.95，子宫颈样本ICC为0.86。结论．殖民的Ureaplasmaspp似乎在怀孕期间非常稳定，阴道样本的检出率最高。

1.介绍

早产(定义为37周之前分娩)是围产期死亡率的75%和幸存者中超过50%的长期发病率的原因[1]．自然早产或早产胎膜破裂发生在60-65%的早产中[2]．在有或多或少症状的异质人群中，随着特殊护理的发展和更准确地识别出早产风险明显增加的孕妇，这些结果可以得到改善。

怀孕期间阴道菌群的评估已被指出是一种潜在的有趣的筛查工具[3.，4]．尽管被认为在女性生殖道中是共生的，但是Ureaplasma物种(Ureaplasmaspp。）与临床绒毛膜炎、早产胎膜破裂(PPROM)和早产的可能性增加独立相关[5，6]．Ureaplasmasp.诱导绒毛膜和羊膜细胞的炎症反应[7并导致胶原蛋白碎裂，从而削弱羊膜[8]．

介绍了两种筛选方法Ureaplasma培养是金标准，但这种方法不提供关于不同物种的信息(解脲支原体或小支原体)，很少给出它们的数量。第二种方法，定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)，与培养法相比具有巨大的优势，能够进行分化美国体和美国以及．致病性的研究UreaplasmaSpp.在怀孕的可能性，可能有一个不同的致病性的潜在物种[9]．此外，细菌负荷也可能是提高微生物入侵潜力的一个因素[5]．基于培养的研究报告称，女性宫颈内的细菌数量与阴道内的不同，阴道菌群是一个动态的生态系统[10]．一项研究调查了负担的稳定性Ureaplasma生殖器分泌物中的sp. [11]，但没有报告分布美国体和美国以及在怀孕期间。采样位置对检测和定量的影响Ureaplasmaspp以前也没有被研究过。因此，本研究的目的是比较qPCR技术用于鉴定两者存在的定性和定量的重现性Ureaplasma根据取样地点，在同一名女性体内，在整个怀孕期间。作为次要结果，我们研究了Ureaplasma物种(以及或体)在怀孕期间的演变和殖民妇女，使用三个时间点。

2.材料和方法

这是一项前瞻性研究，于2011年2月至2015年1月在布鲁塞尔Ziekenhuis大学(UZ Brussel)产前门诊进行。并邀请怀孕无并发症的健康妇女参加。在第一次产前检查中，在妊娠14周之前，我们提供了关于研究的口头信息。从那些同意参与的人那里获得书面知情同意。本研究经医院伦理委员会批准。孕龄由最后一次月经日期和早期妊娠超声检查确定。参与者在妊娠5到14周期间接受了测试。排除标准包括18岁以下、临床阴道感染或最近服用抗生素(无论什么原因)的患者。

用无菌窥镜曝光子宫颈后，取4份样品进行PCR定量美国以及和美国体，依次为:阴道、穹窿和两个(外)子宫颈(cx1和cx2)。取样轻柔，以避免(宫颈)出血。样品在“通用运输介质系统”(UTM) (Copan Italia, Italy，包含3 ml液体介质)中运输，并使用qPCR方法进行处理，该方法在以前的出版物中有描述[12]．

我们招募了怀孕前三个月的女性，如果四个生殖道样本在qPCR中有反应，她们就被认为是阳性。我们打算在妊娠中期(18 - 27周，T2)和妊娠晚期(28 - 39周，T3)对这些阳性妇女重复同样的采样。由于缺乏有关这一特定研究课题的出版物，因此无法准确计算所需的样本量。

对于那些在第一次取样时呈阴性的人，我们决定在第二和第三个月期间对他们中的一些人进行随机测试，以确认他们的阴性Ureaplasmaspp在整个怀孕期间保持不变。

通过比较每个采样点的qPCR阳性检测与Fisher精确检测的比例，对所有样品(T1、T2和T3)的前三个月和第二次分析进行定性重复性评估。科恩kappa系数(κ)来评估不同采样点之间的一致性程度。两项观察结果的一致性通常被认为是极好的κ> 0.75 [13]．

在发现阳性的患者中，对该试验的定量重现性进行了两个水平的评估:（1)我们计算了每个采样点的平均DNA拷贝数。为了使我们的结果归一化和最小化离群值效应，我们使用了(基数10)对数变换数据。除其中一个宫颈样本为阴性外，其余两个宫颈样本的计算平均对数用于与其他取样点的样本进行比较;在这种情况下，我们只考虑正结果的值。采用重复测量方差分析，结合两两比较(Bonferroni校正)，分析位置之间的数量差异以及T1、T2和T3之间的携带电位差异。（2）为了检验从同一位置同时采集的两个样本之间的定量一致性程度，我们考虑了所有三个月期间从宫颈采集的两个重复样本(当它们都是阳性时)，并计算了类间相关系数(ICC)及其95%置信区间(95% CI)。所有计算均使用IBM SPSS 22.0版本进行。总结各组基线数据并进行比较(两比例或两平均值的比较，95% CI)。未配对-测试、双侧Fisher精确测试和95% CI在适当时使用。一个值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

我们招募了139名女性，她们在怀孕5到14周之间接受了测试。其中3例失访，并被排除在我们的分析之外(图)1）.9名女性在怀孕6至13周期间流产，其中6名为阳性美国以及所有部位，包括一名相关阳性的患者美国体穹窿和阴道。另外三名妇女在所有取样地点的结果均为阴性。

在其余127名女性中，72名(56.7%)所有位点的qPCR结果均为阴性，55名(43.3%)在前三个月至少有一个位点的qPCR结果为阳性。72例阴性女性中有23例从三个不同的地方采集随访样本;15例在妊娠中期进行检测，另外8例在妊娠中期和妊娠晚期同时取样。所有这些女性在所有采样时间点都呈阴性。

在55例阳性qPCR的女性中，51例(92.7%)为阳性美国以及8例(14.5%)阳性美国体；这些女性中有4人(7.2%)两种阳性。

在51名阳性的女性中美国以及其中43例在所有部位均为阳性，2例仅在阴道内为阳性，4例在阴道和穹窿内为阳性(但两个宫颈样本均为阴性)，2例在宫颈内结果不一致。有统计上显著的降低意味着细菌负荷(5.08日志拷贝/毫升(95%置信区间:4.58—-5.59))在八国集团(g8)妇女不积极的位置,与平均值相比细菌负荷的43个女性来说,所有四个样本阳性(5.95日志拷贝/毫升(95%置信区间:5.70—-6.20))(= 0.008)。

在八名阳性的女性中美国体其中1例仅在阴道阳性，3例在子宫颈阳性;其他四个在所有地方都是正面的。同样的趋势较低美国体在四个妇女的阴道负荷被注意到不一致的结果(如观察美国以及)，但差异没有达到统计学意义，可能是由于组小(4.58 log copies/mL (3.87-5.30) vs . 5.43 (4.08-6.79))，．

在55名在妊娠前三个月显示+qPCR的妇女中，44名在妊娠后期进行了重新检测，要么在妊娠中期(15名妇女)，要么在妊娠晚期(10名妇女)，要么在妊娠中期和妊娠晚期(19名妇女)。在所有这些阳性妇女中，只有一名怀孕顺利的妇女在怀孕期间的定性测试结果不一致。该患者T1、T2 qPCR阳性(log转换平均值与其他患者无统计学差异)，T3 qPCR阴性，同时无抗生素治疗史。

妊娠期阳性样本根据采样地点和采样时间点的分布情况见表1．

利用Cohen’s kappa系数对qPCR结果进行定性分析(κ)显示高度一致，与κ值在0.83和0.95之间(表2）.阴道和穹窿样本的结果显示最高的一致性。

84例宫颈重复取样阳性(T1:；T2:；T3:)，以检验两个宫颈取样点之间的定量一致性。根据文献，ICC值为0.86 (95% CI: 0.73-0.92)，应该认为这表明良好的一致性[13]．

妊娠期定量qPCR结果的演变如图所示2使用每个采样点的平均对数变换值美国以及在T1、T2和T3。这个分析不是为了美国体因为积极的结果太少了。

每三个月的平均DNA拷贝数美国以及阴道取样最高;宫颈取样数量最低。穹窿负担显示中间结果。在排除宫颈qPCR阴性的女性后，仍观察到这一具有统计学意义的趋势，证实宫颈微生物负荷较低。观察到一种趋势，显示为增加的对数变换值美国以及在怀孕期间。这在所有样本地点都可见，但没有达到统计学意义。

4.讨论

殖民与Ureaplasma43.3%的女性患有spp。殖民与美国以及比与美国体(40.2%对6.3%)，这与之前的研究非常吻合[12，14，15]．诺克斯和蒂姆斯用不同的方法得出结论Ureaplasmaspp。(前身Ureaplasma体再细分为不同的血清)通常是从怀孕中期到妊娠晚期的下生殖道持续的殖民者[11]．我们的研究，使用了最新发展的qPCR技术，证实了这一点，并提供了更多关于稳定性和密度的信息Ureaplasma从妊娠早期到妊娠结束，在不同的采样点，生殖器官分泌物中的spp。

在我们的研究中，积极的和消极的Ureaplasmaspp的携带在怀孕期间几乎是不变的，没有任何干预。所有阴性的女性在整个妊娠过程中都保持阴性，98%的前三个月qPCR结果阳性的女性在T2和/或T3被证实为阳性样本。这些发现对临床医生至关重要，因为它意味着，为了研究致病性Ureaplasma在怀孕期间，没有必要使用一个标准化的筛查时间点在一定的妊娠年龄。因此，我们可以推测，在没有服用抗生素的情况下，妊娠期间某个时间呈阳性的患者在整个妊娠期间都是或将是阳性的。我们的研究不足以分析早产或新生儿并发症等结果，但为了避免偏见，我们只测试了低风险孕妇。

实时定量pcrUreaplasmaspp在任何取样地点均表现出良好的定性一致性(κ值在0.81和0.95之间)。然而，与其他采样点相比，阴道样本qPCR阳性的概率明显更大。这种特殊的趋势在所有三个月期间都被观察到美国以及至少在怀孕的前三个月美国体．8例(14.5%)女性阴道qPCR阳性，宫颈qPCR阴性。分析这些不一致样本中的细菌载量，我们发现与在所有部位阳性的女性相比，阴道的平均细菌载量更低。值得注意的是，在随后重新检测的4/8名女性(T2和/或T3)中，3/4显示出相同的特征:阴道和穹窿的qPCR阳性，但子宫颈仍然为阴性。我们可以得出结论，阴道负荷对宫颈定植有影响:阴道细菌负荷越高，宫颈定植阳性的风险越高。阴道定植应被认为是一个“水库”，允许继发定植宫颈和进一步上升感染的功能不同的局部条件，如怀孕期间pH变化或孕产妇免疫力下降。

定量分析的Ureaplasma在T1、T2和T3定殖的sp.没有发现显著的变化模式:观察到的怀孕期间增加的趋势仍然低于1 log美国以及．少量阳性病例为美国体阻止了对这个物种的任何确定结论。

总的来说，殖民化是美国以及在数量上，阴道样本大于子宫颈样本(图2）.这些差异几乎在所有病例中都达到了1 log(或非常接近1 log)，这可能解释了为什么在一些病例中，qPCR在阴道中呈阳性，而在子宫颈中呈阴性。这些具有挑战性的发现可能具有临床意义，特别是如果我们希望优化使用qPCR技术对晚期流产或早产高风险孕妇的识别。

因此，有几个问题值得提出:我们需要对阴道、子宫颈取样，还是两者都取样?我们应该如何解释阴道样本阳性与宫颈样本阴性之间的关系?尽管阴道样本呈阳性，子宫颈未被定殖，这一事实可能反映了更好的免疫反应，降低了由于Ureaplasma殖民。这是一个有趣的假设，将使用宫颈qPCR阴性和阴道样本阳性的孕妇群体进行检验。我们的研究还不能回答这个临床问题，但我们打算基于这些发现开发一个新的实验设计。根据这些未来的结果，可以评估两种筛查方法:阴道筛查方法(更容易，不需要窥器)招募更多阳性女性和子宫颈筛查程序，技术上更困难，但招募潜在风险更高的患者。

我们相信筛查Ureaplasma妊娠期结合物种鉴定和量化应是更好地了解早产过程的一个新的研究方向。我们的研究表明，该方法简单易行，可靠性高，重现性好。有效的筛查与有效的干预相结合，可能为预防包括早产在内的妊娠并发症开辟新的前景。

附加分

冷凝．生殖器取样部位对Ureaplasma种虫害qPCR结果。

相互竞争的利益

所有作者声明在这篇文章中没有竞争利益(经济或个人)。

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