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在妇产科感染性疾病
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在妇产科感染性疾病/2016年/文章

研究文章|开放获取

体积 2016年 |文章的ID 5293034 | https://doi.org/10.1155/2016/5293034

乔纳森•法罗马里卡米切尔Yuh-Jue陈,莎拉•卡马尔杰拉尔德·里德尔,塞巴斯蒂安·法罗, ”小说的发展同时细菌鉴定和药敏试验”,在妇产科感染性疾病, 卷。2016年, 文章的ID5293034, 7 页面, 2016年。 https://doi.org/10.1155/2016/5293034

小说的发展同时细菌鉴定和药敏试验

乔纳森·法罗,1 马里卡米切尔,2 Yuh-Jue陈,2 萨拉卡,2 杰拉尔德的谜语,1 和 塞巴斯蒂安·法罗1

1德克萨斯女子医院,7400年后者930套房,休斯顿,TX 77054,美国

2休斯顿德克萨斯大学健康科学中心在医学院,休斯顿,TX 77054,美国

学术编辑器:布莱恩·拉森
收到了 2016年5月13日
接受 2016年8月10
发表 2016年10月30日

文摘

背景。说明一种病原体的抗菌药物敏感性要求亚文化生物体后第一个孤立。这需要好几天,要求患者使用广谱抗生素。这种方法有助于细菌耐药性的发展。方法。微量滴定井被涂上一层多克隆抗体针对感兴趣的病原体。细菌悬浮液中加入存在/没有选择抗生素。洗后,捕获细菌被发现。发现。B群链球菌(GBS),粪肠球菌,淋病奈瑟氏菌各检测到10点吗5细菌/毫升20分钟后潜伏期。容易选择抗生素是明显的潜伏期长达6个(GBS和肠球菌)。敏感性增加到10−2细菌/毫升GBS, 10−1细菌/毫升粪大肠,101细菌/毫升n球菌后18-24-hour文化。结论。这部小说分析允许高度敏感和特定的识别病原体,同时测定其抗菌药物敏感性降低。

1。介绍

当面对一个病人对抗传染病,说明违规病原体的需要巨大的努力。时间是至关重要的:广谱抗生素后发起文化收集,作为违规微生物的鉴定需要24 - 48小时。增加文化的敏感性,一个浓缩的步骤可以添加(1]。检查是否完成一次病原体识别:药敏下必须确定以下额外的亚文化的存在为另一个(24 - 48小时之内选择抗生素2]。

一些技术已经开发,以帮助减少所需的时间来识别病原体。这些技术包括使用显色琼脂/肉汤和核酸扩增技术(NAAT) [3,4]。虽然这两种技术在产前筛查GBS殖民,疾病控制和预防中心仍然建议文化被执行(5]。这是一个绝对要求患者对青霉素过敏,NAAT是不能提供药敏资料。此外,执行NAAT所需的资源和高度专业化的训练不普遍可用的6]。

最近,美国传染病学会发布的一篇论文详细介绍目前临床病原体识别方法。描述的是一个过程概括为拥有不足敏感性和大量的时间延迟,从而导致更大的发展和更大的抗菌素耐药性7]。这些问题都太好说明我们的方法对治疗GBS预防,提高耐青霉素被发现,和克林霉素耐药性正在上升8,9]。此外,有人担心这种做法将有助于大肠杆菌电阻在早产新生儿(10]。我们已经见过抗菌素耐药性的影响肠球菌,医院获得性感染病原体估计每感染增加27000美元(11,12]。n球菌电阻稳步增加,和多药耐药性最近被证实13]。这三个不同的生物演示一系列微生物反应我们的指导方法来预防和治疗。

通过修改最近报道的测试中,我们已经开发出一种方法,一种病原体的同时识别和决心的抗生素敏感性[14]。我们已经修改这个测试GBS,粪大肠,n球菌可能会发现在6小时孵化后稀释浓度。此外,我们表明,GBS对克林霉素的诱导耐药可能会决定。最后,我们表明,一夜孵化后,测试生物体可能检测到PCR的浓度能发表。因为这个测试允许一个同时识别病原体并确定其药敏,这个新技术提供了一个改变医生的方法来管理传染病。

2。方法

2.1。细菌菌株和抗体

B群链球菌临床分离株12386年和01.12.76显示磁盘扩散敏感或耐克林霉素,分别。粪肠球菌写明ATCC 29212被证实是由磁盘扩散对万古霉素敏感,并写明ATCC 51299被证实是耐药菌株。淋病奈瑟氏菌写明ATCC 31426菌株对青霉素耐药。临床分离菌株1279,被证明是容易青霉素。大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,白色念珠菌,和β链球菌组A、C、F和G都临床分离株。

兔多克隆抗体anti-GBS (1521), HRP-conjugated兔多克隆抗体anti-GBS(1524),兔多克隆抗肠球菌抗体(3711),和HRP-conjugated兔多克隆抗肠球菌抗体(3714)都是来自Virostat(缅因州波特兰)。兔多克隆抗n球菌抗体(pa1 - 7233)和HRP-conjugated兔多克隆抗n球菌抗体(pa1 - 73144)买来ThermoFisher(沃尔瑟姆,MA)。

2.2。细菌检测和竞争实验

96孔Immulon微量滴定板(ThermoFisher沃尔瑟姆,MA)涂上指定的抗体。GBS化验,anti-GBS抗体首先稀释1:30碳酸氢盐缓冲(σ,圣路易斯密苏里州)。为n球菌或肠球菌化验,抗体稀释1:200或1:100年,分别。100年μL的抗体稀释被放置在各自的井,和盘子在一夜之间在4°C的环境中。井被洗了三次磷酸盐(PBS,西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)补充0.05% Tween-20(费舍尔科学、匹兹堡、PA)。板块与200年被封锁在室温下30分钟μL (StartingBlock™(ThermoScientific,罗克福德,IL)之后,在室温下与PBS-Tw洗涤三次。

细菌分离株的浓度大约10有单独的准备8细菌/毫升基于0.5麦克法兰和证实了OD600年nm。整除镀在适当的琼脂(哥伦比亚粘菌素萘啶酸血琼脂,GBS和肠球菌和巧克力琼脂n球菌,费舍尔科学、匹兹堡、PA)和集落形成单位(cfu)测定后24-48-hour文化。孕生准备进一步稀释10倍到10−3细菌/毫升。为零的时间测试,隔离在PBS稀释和孵化在室温20分钟。增长的实验,挑剔的肉汤(Remel Lenexa, KS)代替PBS,和孕生在试管稀释,孵化之前被转移到井。竞争生物体是准备在10的浓度8细菌/毫升。添加不同浓度的孕生管包含一定量的生物竞争稳定保持在108细菌/毫升挑剔的肉汤。一个预定的孵化时间点(6小时后与GBS和药敏试验肠球菌9小时GBS对克林霉素的诱导耐药,或一夜之间检测极限的确定这三个生物体或抗生素敏感性测定n球菌)生物被转移到微量滴定井和盘子被孵化20分钟在室温下。零化验,这转移的步骤被忽略,孕生在井中直接就做好了准备。增长的实验中,10μL孵化的细菌悬浮液添加到90年μL PBS的好。20分钟的孵化后,井与PBS洗了三次。辣根过氧化物酶(合)共轭抗体是100年补充道μL整除和盘子被孵化在室温下10分钟。HRP-conjugated抗体稀释了所有测试1:100年的PBS。

与PBS-Tw洗涤三次后,三甲过氧化物酶底物(KPL,马里兰州)在100年被添加到井μL整除。板在室温下孵化了3分钟。反应是终止使用停止解决方案(热科学,罗克福德,IL)。盘子被读入ELX 808 BioTek (Winooski,佛蒙特州)板读者在450海里。

3所示。结果

3.1。零时间测试

连续稀释的细菌是准备入手0.5麦克法兰和稀释101细菌在PBS /毫升。当处理pathogen-specific elisa, B群链球菌,粪大肠,n球菌每个单独显示检测10的范围2-10年8细菌/毫升20分钟后孵化(数据1(一)- - - - - -1 (c))。GBS检测到102细菌/毫升,粪大肠下降到105细菌/毫升,n球菌下降到103细菌/毫升。为了确定测试的特异性,悬浮液的细菌进行测试,以确定被稀释,但竞争水平的细菌是10点保持不变8细菌在PBS /毫升。测试的几个常见阴道cocolonizers与感兴趣的细菌混合显示没有干扰化验(补充图1 (A) 1(左)在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/5293034)。

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图1
确定检测极限的测试时间为零。GBS (a),肠球菌(b)n球菌0.5 (c)准备在麦克法兰在PBS和连续稀释。20分钟后在室温下孵化,井洗然后HRP-conjugated抗体针对感兴趣的细菌用于检测任何生物。三种不同的菌株GBS的测试,两株肠球菌,和n球菌每一个。结果显示GBS临床孤立01.12.76 (a),肠球菌写明ATCC 29212株(b)n球菌菌株19424 (c);每项研究进行了一式三份,代表三个不同的实验。细菌浓度经cfu在琼脂镀后24 - 48小时。
3.2。检测极限

下在挑剔的肉汤稀释细菌首先准备一个0.5麦克法兰。检测测试机体大量的稀释能力增加时,孵化时间延长。GBS检测到102细菌/毫升小时潜伏期后,1016小时后细菌/毫升,10−2细菌/毫升孵化后一夜之间(图2(一个))。

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图2
孵化后的检测极限的确定在37°摄氏度。GBS (a),肠球菌(b)n球菌0.5 (c)准备在麦克法兰在挑剔的肉汤和连续稀释。GBS,样本孵化为0.5,1,2,4,6或24小时37°摄氏度(a)。粪大肠一夜之间,样本孵化在37°摄氏度。管被指出是浑浊的100每毫升细菌,这个样例和以下两个稀释,10−1和10−2每毫升细菌,准备进一步稀释在PBS 1: 1000。为n球菌0.5麦克法兰的样本准备好挑剔的肉汤,然后孵化一夜之间在37°摄氏度(c)。遵循这些孵化为每一个研究中,跨度为10μL(每个样本都被转移到微量滴定包含90井μL PBS和允许在室温下站了20分钟。任何绑定的器官被HRP-conjugated抗体检测到特定的病原体。与图1GBS的三个不同的菌株进行了测试,两株肠球菌和n球菌每一个。结果显示GBS临床孤立01.12.76 (a),肠球菌写明ATCC 29212株(b)n球菌菌株19424 (c),每执行一式三份,代表三个单独的实验。再次,细菌浓度经cfu在琼脂镀后24 - 48小时。

一系列的稀释粪大肠从0.5开始麦克法兰准备同样的GBS,孵化后一夜之间(18小时)在挑剔的肉汤,浊点周围的管是化验。观察浊度下降到10−1细菌/毫升。这管直接化验,以及一系列的稀释的样本。同样的程序进行后续nonturbid稀释,所以10−2和10−3细菌/毫升管都化验直接当进一步稀释。粪大肠检测到10点−1细菌/毫升,当这个示例进一步稀释了,细菌能够被发现后稀释10倍和100倍(图2 (b))。在一夜之间nonturbid文化管,不粪大肠检测(10−2和10−3细菌/毫升)。

n球菌在挑剔的肉汤稀释了连续,第一次从0.5麦克法兰。隔夜孵化后,试验运行。n球菌检测到强在高浓度时,以及在非常低的浓度,102和101细菌/毫升(图2 (c))。检测细菌的测试是不能小于101细菌/毫升后24小时孵化。

3.3。测定抗菌药物敏感性

隔离单独准备在选择抗生素的存在与否。培养6小时后,进行试验和敏感性资料。GBS对青霉素敏感的菌株培养的浓度增加以下抗生素:青霉素、头孢唑啉、红霉素和克林霉素。青霉素浓度测试,GBS的应变增长被抑制,没有检测到10 gb5细菌/毫升(图3(一个))。孵化的GBS头孢唑啉浓度的增加显示出剂量效应,观察的增长更稀释浓度的抗生素,0.005μg / mL,但当越来越多被使用(补充图2 (A))。类似的结果时观察到的相同的应变测试的克林霉素或红霉素(补充图2 (B)和3 (C))。

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图3
细菌鉴定和示范的易感性选择抗生素后长达6个文化。后首先准备0.5麦克法兰挑剔的肉汤,然后稀释细菌隔离,抗生素被添加到井给最终的浓度表示。12386 (a)稀释GBS应变(确认由磁盘扩散)对青霉素敏感,在0,0.06,0.12,0.25μ青霉素g / mL。(b)粪大肠被稀释在挑剔的肉汤(4μ克/毫升)或缺乏万古霉素。粪肠球菌写明ATCC 29212菌株被证实是由磁盘扩散对万古霉素敏感。(c)n球菌准备和稀释,如上所述,在0,0.5,还是1μ青霉素g / mL。临床分离菌株1279的n球菌,对青霉素敏感的磁盘扩散。一式三份和执行每个测试数据显示代表三个不同的实验。再次,细菌浓度经cfu在琼脂镀后24 - 48小时。

接下来,GBS菌株对红霉素对克林霉素耐药但敏感准备,如上所述。补充图 (D)表明,在0.25μg红霉素,GBS应变的增长被抑制在105细菌/毫升。抗生素浓度选择基于CLSI断点。相反,克林霉素浓度测试,发现GBS水平相似,没有抗生素控制应变的GBS(补充图2 (E),菌株165)。

粪肠球菌测试GBS的方法类似。当万古霉素敏感粪大肠稀释了万古霉素的存在,没有检测到增长10点吗5细菌/毫升(图3 (b))。当一个万古霉素耐药菌株在测试条件下被替换下场,不过,这种生物检测到10点5细菌/毫升后6小时孵化(补充图2 (F))。

菌株的n球菌准备,如上所述,稀释在青霉素或头孢曲松钠的存在。24小时孵化后,紧张的n球菌对青霉素敏感是化验。这10点应变检测5细菌/毫升时测试没有青霉素,但未发现细菌培养液在井接受青霉素(图3 (c))。当一个抗n球菌测试、细菌强烈发现105细菌/毫升在井24小时孵化后接受小于2μ在2 g / mL,轻微的检测μ克/毫升(补充图2 (g))。的应变n球菌对头孢曲松钠敏感是下一个测试和显示出类似的结果:在缺乏头孢曲松钠的细菌培养检测到10点5细菌/毫升,但不是在培养0.0625μ0.125 g / mL或μg / mL头孢曲松钠在这个培养液(补充图2 (H))。使用抗生素的浓度都低于0.25的推荐水平μg / mL决定耐头孢曲松钠(15]。

3.4。GBS对克林霉素的诱导耐药

GBS株之前决心展示要么noninducible(隔离)或克林霉素诱导(隔离B)阻力的红霉素见到孵化后进行测试。在noninducible电阻应变(隔离),GBS只发现在井没有收到克林霉素(表1)。当一个应变能力显示诱导阻力测试,发现GBS 103细菌/毫升稀释,很强的10点检测6细菌/毫升,温和的10点检测5细菌/毫升,光探测在104细菌/毫升。
107细菌/毫升 106细菌/毫升 105细菌/毫升 104细菌/毫升
隔离 隔离B 隔离 隔离B 隔离 隔离B 隔离 隔离B
克林霉素0μ克/毫升
红霉素1.0μ克/毫升		 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
克林霉素0.5μ克/毫升
红霉素1.0μ克/毫升		 + + + + + + + +
克林霉素0.05μ克/毫升
红霉素1.0μ克/毫升		 + + + + + + + + +
克林霉素0.005μ克/毫升
红霉素1.0μ克/毫升		 + + + + + + + + +
表1
检测GBS见到孵化后的红霉素和克林霉素的稀释。隔离(克林霉素noninducible阻力)与隔离B(诱导抗性能力)。+ + + + OD > 3.0。+ + + OD 2.0 - -2.9。+ + OD 1.0 - -1.9。+ OD 0.1 - -0.9。−OD 0 - 0.099。

4所示。讨论

微生物对抗生素的耐药性的发展一直困扰当代临床医生。每个新抗生素的引入后,发现耐药隔离,阻力葡萄球菌甲氧西林指出2年1960年的第一次使用抗生素后,抵抗的肠球菌万古霉素是指出16岁1972年推出后,和阻力葡萄球菌指出出利奈唑酮只是在1996年首次使用后1年(16]。的发展,微生物对抗生素的耐药性已经成为常态,和预期的阻力又被证实在2011年与耐药n球菌应变在日本报道(17]。

抗菌素耐药性发展和继续这样做并不奇怪。有关的是方法管理疑似感染患者/殖民一直保持静态的,实际上这种方法继续恢复,最近的例子产时GBS预防推荐2010年CDC (5]。同意,减少产时GBS预防导致早发性GBS败血症:然而,有人担心这种做法可能促进耐药菌株大肠杆菌(13]。万古霉素耐药的发生率增加肠球菌在住院病人是另一个例子。像Enterococci很大程度上耐头孢菌素,使用这类抗生素手术预防允许过度生长肠球菌在网站以前殖民cephalosporin-sensitive生物和相关的医院数量的增加可能导致手术部位感染(18]。也许这种病原体和杀微生物剂比更明显n球菌。从第一次使用磺胺类药在1940年代,这种细菌反击耐药菌株的发展(19]。之后显示这个病原体能够抵抗任何抗生素针对它发展,包括磺胺类药、青霉素、四环素、壮观霉素,喹诺酮类、大环内酯类,头孢菌素,很明显,需要新方法超出了去年反击推荐两种药物(20.]。

我们最近开发了一个免疫测定涂膜抗体GBS的暴露在细菌悬浮液,和一系列的跨度为孵化后,检测到绑定GBS (14]。这个试验是测试病人的vaginal-rectal标本和被发现有高度的敏感性和特异性,能够检测的好处nonbeta溶血性链球菌菌株GBS (21]。为了减少interobserver变异与点状化验,我们测试一种ELISA格式转换。在这项研究中,我们用anti-GBS抗体代替了那些针对n球菌或肠球菌。我们表明,这些多克隆抗体提供了大量的非选择性肉汤灵敏度,一般以小干扰其他孤立cocolonizers图1和补充图1。

经过6个小时的潜伏期后,检测极限增加到101细菌每毫升GBS(图2)。此外,我们表明,抗生素敏感性可能决定(补充图2)。从这个可能设想一个面板,一系列的井中设置多个临床相关抗生素进行测试,为临床医生提供有针对性的治疗方法大大减少了时间(图3)。

中央方面的分析涉及到细胞生存能力:细菌的浓度出现在孵化相关倍使用。通过孵化一夜之间,测试的敏感性显著增加活细菌继续生长和分裂,与GBS被发现在10−2每毫升细菌,肠球菌检测到10点−1每毫升细菌,n球菌检测到10点1细菌每毫升(图2)。这允许发布的敏感性大于结果几个pcr的方法检测一个浓缩的步骤后,有独特的优势,这个测试能够检测可行的细胞(22- - - - - -25]。

本试验提供的独特方法针对一个特定的临床相关病原体的生长通过使用捕获抗体。立即绑定分析表明是否存在一种病原体。那时培养有机体的存在与否选择抗生素,可能表明,细胞是可行的和容易受到特定的抗菌素,从而允许临床医生更迅速地作出明智的决策。

相互竞争的利益

作者报道在Nanologix没有经济利益,Inc .乔纳森博士法命名的coinventor ELISA方法在这项研究中,利用专利9034583,5月19日,2015年。所有作者报告没有利益冲突。

补充材料

在补充图1,GBS(ⅰ),肠球菌(J和K),或n球菌(L)对常见孤立cocolonizers型号进行测试。测试细菌被稀释,而竞争生物体是保持不变的。显示在图2补充,GBS是敏感或者头孢唑啉(A)、克林霉素(B),或红霉素(C) 6小时后孵化。面板D和E GBS抵抗克林霉素。面板F显示肠球菌对万古霉素耐药。最后,电池板G和H n球菌耐青霉素或头孢曲松钠敏感,分别。

  1. 补充材料

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