明胶凝血酶基质组织密封剂对细菌菌落形成和盆腔感染风险的影响

摘要

客观的．凝胶凝血酶基质(GTM)组织密封剂的使用以前被确定为子宫切除术后盆腔感染的独立预测因素。我们的目的是通过评估GTM对细菌菌落形成的影响来阐明相关因素，并对出现在阴道袖带的细菌进行特征分析。方法．大肠杆菌在含或不含GTM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和盆腔清洗中孵育，以评估对菌落形成的影响。收集2015年6月至10月子宫切除术后阴道袖带的盆腔洗涤物。在体外16S rRNA基因qPCR和16S扩增子测序对阴道袖口处的细菌进行了鉴定。结果．在PBS中细菌菌落形成的平均值更大大肠杆菌在GTM (1.48 × 10⁷CFU/mL)与无CFU/mL (9.95 × 10⁵CFU/mL)孵育20小时()．61例盆腔洗液中，3例培养阳性(≥5000 CFU/mL)粪肠球菌．结论．在体外实验证明GTM对菌落形成有促进作用大肠杆菌在PBS。然而，考虑到在充分消毒后手术部位清洗的阴性结果，GTM在促进甲状腺切除术后盆腔感染方面的作用可能是有限的。盆腔清洗分析显示存在粪大肠，但结果并不确定。建议进一步研究。

1.介绍

在一项回顾性研究中，明胶凝血酶基质(GTM)组织密封剂被确定为全子宫切除术后盆腔脓肿发生和盆腔感染的独立预测因子[1］．GTM已成为外科手术中控制小出血的有效手段[2，3.］．由于这种止血剂有效且易于使用，常用于子宫切除术过程中[1］．然而，确认GTM的产品插入可能增加手术部位感染(SSIs)的发生率，并可能支持细菌增殖[4］．GTM由胶原蛋白和人凝血酶组成[4］．我们假设这些成分可能促进细菌增殖，从而导致子宫切除术后盆腔感染的发生率增加。

我们的第一个目的是研究GTM对细菌菌落形成的影响，在一个没有其他因素可能影响菌落形成的环境。分离GTM对菌落形成的影响大肠杆菌分别在含或不含GTM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育，PBS是一种缺乏基质支持菌落形成的溶液。大肠杆菌是一种在子宫切除术后盆腔感染中经常出现的病原体，因此被用于实验[5，6］．由于PBS可能不能代表阴道袖口处的微环境，第二个目的是使用阴道袖口清洗来评估GTM对清洗中细菌菌落形成的影响。定量聚合酶链反应(qPCR)检测16S rRNA和16S rRNA扩增子的基因测序提供了洗涤中细菌的多方面分析[7- - - - - -9］．由于洗涤中菌落形成率低，第三个目标是用大肠杆菌当已知有细菌存在时，评估GTM在盆腔清洗中的影响。

2.材料和方法

2．1．GTM用于实验

收集未使用的已开封或未开封的近期过期的无菌GTM用于本方案。未使用的已打开的GTM收集于手术室无菌场内的无菌标本杯中。这些GTM样品立即转移到实验室，并存储在−20°C冰箱中直到使用。未开封的GTM样品在实验使用前3个月内过期，并在室温下保存至混合使用。需氧培养证实了GTM的无菌性。实验用的GTM是将0.2 g GTM与12 mL的PBS混合制备而成。混合后，在37°C下孵育10-20分钟，然后用于实验。

2．2.盆腔清洗和病人资料

2.2.1。研究人群

阴道袖带的盆腔冲洗取自于2015年6月至10月进行子宫切除术的18-85岁患者。收集腹部和腹腔镜子宫切除术过程中的洗涤物，包括全腹部、根治性、腹腔镜和腹腔镜辅助阴道和机器人子宫切除术。排除阴道、宫颈上及剖宫产子宫切除术。非子宫切除术程序和主动感染或免疫抑制程序也被排除在外。

所有患者术前30分钟至2小时给予围手术期抗生素(1 g头孢唑啉IV)，并用聚维酮碘制剂进行5分钟的手术部位擦洗。在对头孢唑林过敏的情况下，静脉使用的替代抗生素为900毫克克林霉素和120毫克庆大霉素，按护理标准。提供者没有对细菌性阴道病进行常规的术前筛查。科罗拉多多机构审查委员会(COMIRB)批准该方案为“非人类受试者研究”，不需要患者同意。

2.2.2。盆腔洗液的收集

阴道袖带闭合后用0.9%生理盐水冲洗盆腔。在无菌标本杯中收集大约50-100毫升这些洗涤液。虽然洗涤物是在无菌区域内以无菌方式收集的，但大部分洗涤物是在真空容器中收集的，并转移到无菌区域外的无菌标本杯中，但在手术室内。无菌标本杯盛有盆腔洗涤液，置于无菌标本袋中，从手术室运送到管理办公桌，在送到实验室之前，它们在冷却器中保存大约0-8小时。在每个洗涤样本中收集已确定的患者信息。利用一个非附属的运输小组将样本和患者数据表从手术室转移到行政办公桌，以确保患者数据保持匿名。一旦进入实验室，样品在处理前被放置在10°C冰箱中长达24小时。

2.2.3。样本大小

Culligan等人(2003)的一项研究认定52%的阴道手术部位为“受污染的(≥5000 CFU/mL)， 41%的病例在阴道子宫切除术后90分钟内。基于这些发现，我们预计全子宫切除术中阴道袖带闭合后41-52%的盆腔冲洗将是“积极的文化(≥5000 CFU/mL)， 48-59%为无菌(<5000 CFU/mL) [10］．我们决定收集至少60名患者的盆腔洗液，以提供阴道袖带闭合后手术部位细菌的准确表现。

2．3.实验

2.3.1。目标1和3:蚁群的形成大肠杆菌在PBS和盆腔清洗中

我们比较了大肠杆菌在PBS或无菌洗涤中加入或不加入GTM，以评估对菌落形成的影响。大肠杆菌W3110菌株培养后制备原液大肠杆菌37°C LB肉汤18-20小时。的平均浓度大肠杆菌连续稀释为3 × 10后确定库存⁹CFU /毫升。大肠杆菌用混合料接种PBS或带有和不带有GTM的洗涤液，最终浓度为10⁶CFU /毫升。培养物在37℃摇床培养箱中培养20小时。每一种培养物在孵育期间的不同时间点取样，用PBS连续稀释，并在LB琼脂上重复三次。琼脂平板孵育18-20小时，计数菌落，测定各时间点CFU/mL培养物浓度。

2.3.2。目的2:阴道袖口处细菌的特征

(1)有氧文化．进行有氧培养以确定GTM对盆腔洗液中细菌菌落形成的影响。将含有或不含GTM的洗涤液混合成三份，置于37°C的摇瓶培养箱中18-20小时。单独的PBS和在PBS中混合的GTM以类似的方式孵育并作为对照。将混合物连续稀释，置于LB琼脂上，37℃孵育18-20小时。人工菌落计数法测定CFU/mL混合溶液的浓度。最初，在进行上述实验之前，不进行零时间盆腔清洗的基线培养。当发现遗漏时，使用LB琼脂平板对其余洗涤样品进行基线培养。

(2)培养阳性洗涤物细菌基因测序[11，12］．对培养阳性洗涤物产生的菌落进行基因测序，以确定存在的生物体。收集琼脂平板上产生的菌落，在−80°C下冷冻，以便稍后进行基因测序。16S rRNA扩增子的测序由Quintara (Denver, CO)的DNA测序和分析服务机构进行。

使用16S rRNA基因引物SSU27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和SSU1391R (GACGGGCGGTGWGTRCA: W, T，和R代表在此过程中扩增基因宽度的核苷酸混合物)进行核酸扩增。聚合酶链反应(PCR)包括15μNovaTaq母粉(Millipore Inc.， Billerica, MA)， 0.4μM的正向和反向16S靶向rRNA引物μL的纯化寡核苷酸(30μL总量)。热循环条件如下:初始放大在94°C 6分钟，30个循环在94°C 30秒，53°C 30秒，72°C 1 min 20秒，最后延伸在72°C 10分钟，然后保持在4°C。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳显示，用溴化乙啶染色，直接放入zymo清洁浓缩器(zymo Research Inc.， Irvine, CA)。PCR产物稀释至50 ng/μL，并使用Qubit荧光计2.0 (Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA)进行量化。利用phrap软件对端序列进行组装。通过NIH GenBank非冗余数据库的基于web的BLAST搜索，将组装好的序列与已知序列进行比较。

(3) 16S rRNA的qPCR检测[11，12］．离心后的盆腔洗样等份在−80°C下冷冻，以便稍后用于PCR。对12个盆腔清洗样本进行了16S rRNA的PCR定量，包括产生细菌菌落形成的混合样本在体外还有一些没有产生殖民地。

在罗氏MagNA Lyser (Roche Inc.， Basel, Switzerland)上打珠后，使用PowerViral Environmental RNA/DNA Isolation kit (Mobio Inc.， Carlsbad, CA)提取核酸。为了检测16S rRNA，将提取的核酸作为模板，在Biorad CFX96仪器(Biorad Inc.， Hercules, CA)上使用特异性细菌靶向的通用16S总细菌引物和6-羧基荧光素标记的TaqMan探针进行qPCR。PCR反应包括10个μL Dynamo ColorFlash PCR母料(Thermoscientific Inc.， Waltham, MA)， 0.2μM的TaqMan 16S总细菌引物寡核苷酸μ纯化的靶核酸(20μL总量)。qPCR条件为95℃扩增10 min, 95℃扩增15秒，60℃扩增1 min 30秒，共40个循环。

2.4。终点和数据分析

Aims 1和3的连续变量是每毫升CFU的平均细菌浓度，由平均需氧细菌菌落计数计算得出。每毫升cfu中细菌的平均浓度在不同组和时间点使用配对进行比较-测试和重复测量方差分析与Bonferroni事后测试。使用IBM SPSS version 23进行描述性统计。

端点在体外目的2的实验包括两个范畴变量。经有氧培养20小时后产生<5000 CFU/mL的盆腔清洗被归类为"无菌“(10］．20小时培养后产生的细菌浓度≥5000 CFU/mL的洗涤液被分类为“积极的文化“(10］．

第三个目的中的连续变量是周期阈值(Ct)值，定义为16S rRNA qPCR检测中荧光信号越过阈值从而超过本底水平所需的周期数[11］．Ct值< 25为非常强烈的阳性反应，提示标本中16S rRNA丰富;25-29表示中度强烈的积极反应;30-35为阳性反应;36值表示存在最小靶核酸的弱反应;37-40为阴性反应，表示样本中无靶核酸[11］．

3.结果

3．1.目标1和3:蚁群的形成大肠杆菌在PBS和盆腔清洗中

在PBS中孵育20小时后，平均细菌菌落形成更大大肠杆菌与无GTM相比(1.48 × 10⁷CFU/mL vs 9.9 × 10⁵CFU /毫升,)．在浓度上没有差异大肠杆菌在带有或不带有GTM的PBS中，时间为零(7.9 × 10⁶CFU/mL vs 6.7 × 10⁵CFU /毫升,)．平均浓度大肠杆菌PBS中GTM浓度为1.48 × 10⁷CFU/mL±3.56 × 10⁶CFU/mL, 9.9 × 10⁵CFU/mL±3.5 × 10⁵分别CFU /毫升。

浓度没有变化大肠杆菌随后用GTM (4.3 × 10)进行盆腔清洗20小时⁵CFU/mL，时间零vs 4.46 × 10⁶CFU/mL - 20小时;(4.3 × 10⁵CFU/mL，时间零相对于8.29 × 10⁶CFU/mL - 20小时;)．平均浓度大肠杆菌GTM和GTM孵育20小时后盆腔冲洗的发生率为4.46 × 10⁶±7.14 × 10⁶CFU/mL, 8.29 × 10⁶±1.08 × 10⁷分别CFU /毫升。

56%的文化大肠杆菌盆腔清洗+ GTM (/9)和33%的无GTM培养物(/9)孵育20小时后无菌落形成。不同文化间的菌落形成无差异大肠杆菌在有GTM和没有GTM的洗涤2小时(2.3 × 10⁵CFU/mL vs 6.1 × 10⁵CFU /毫升,)和4小时(5.6 × 10⁵CFU/mL vs 1.28 × 10⁶CFU /毫升,)．与GTM盆腔冲洗相比，GTM PBS孵育20小时后的平均菌落形成更大(1.48 × 10)⁷CFU/mL vs 4.46 × 10⁶CFU /毫升,)．上述针对Aims 1和3的结果如表所示1和图1．

３．２．目的2:阴道袖口处细菌的特征

3.2.1之上。有氧培养和患者资料

共收集了61例患者的盆腔冲洗和患者资料，年龄29 - 83岁(平均=岁)。两种培养阳性洗涤显示有GTM和没有GTM的菌落形成;第三种培养阳性洗涤仅在无GTM培养时产生菌落。零时间基线培养对三种培养阳性洗涤中的两种是无菌的，对第三种不进行。其余58份洗涤样品经GTM和不经GTM孵育后均未出现菌落形成，属于无菌。一个洗涤样品在零时间培养中培养呈阳性，但在GTM和不GTM孵育时均未出现菌落形成。

三分之二的培养阳性洗涤物来自于术前诊断为子宫内膜癌并有阑尾切除术史的患者。61例患者中有29例被诊断为癌症，最常见的是子宫内膜癌()，其次是卵巢()、子宫颈癌或发育不良()．大部分患者有持续性子宫出血(),肌瘤()或子宫内膜异位症()作为手术指征。大多数手术是全腹部和机器人子宫切除术(和)．全腹腔镜()、激进的()及腹腔镜辅助阴道子宫切除术()占少数。2例患者有盆腔感染史，26例患者有盆腔手术史，最常见的是剖宫产术(病人)。外科医生的术中印象显示有10例患者出现盆腔粘连，其中大多数患者有盆腔手术史()．

3.2.2。培养阳性洗涤中细菌的基因测序

对所有三种培养阳性盆腔洗液产生的菌落的16S rRNA扩增子测序显示存在粪肠球菌．一个培养阳性的洗涤样品也含有未培养的棒状杆菌属物种。

3.2.3。16S rRNA的qPCR检测

盆腔洗液亚群qPCR实验结果显示，12种洗液的Ct值均为> 37。这些结果与纯试剂对照的结果没有区别，表明洗涤物中存在的任何细菌都低于qPCR检测的检测限。

4.讨论

明胶凝血酶基质组织密封剂是一种有效的止血剂，在许多手术场景中都很有用[2，3.，13］．如导论所述，GTM以前被认为是全子宫切除术后盆腔脓肿的独立预测因子[1］．Anderson等人(2014)的研究发现11例患者发生盆腔脓肿，其中9例接受GTM治疗(82%)。Anderson等人研究的所有患者都接受了与我们研究的患者相同的术前抗生素和手术部位擦洗。在体外本研究的实验可能支持GTM促进菌落形成的作用大肠杆菌在PBS。然而，考虑到手术部位消毒后洗涤的阴性结果，GTM在促进术后盆腔感染的作用可能是有限的。未来的研究可能包括一个类似的实验，包括在GTM中加入广谱抗生素，以评估菌落的形成大肠杆菌在PBS中可以减少或消除。

正如Culligan等人(2003)的论文所见，在阴道子宫切除术中，手术擦洗后阴道内可存活细菌长达90分钟。这些细菌可能存在于阴道袖口，尽管根据我们的发现，其浓度低于阴道内。我们预计41-52%的盆腔洗液(-32)， 48-59% (-36)将是无菌的[10］．在我们的研究中5% ()为培养阳性。Culligan等人(2003)认为术前抗生素和手术部位擦洗可能是整个手术过程中观察到的细菌菌落形成的逐渐下降的原因。在我们的研究中，围手术期抗生素和手术部位擦洗也可能是导致培养阳性洗涤和不同生长速率的意外低的原因大肠杆菌在骨盆洗液。此外，部分样本的基线培养缺失可能限制了我们从洗涤中培养细菌的能力。

在我们的研究中，其他因素可能会导致培养阳性洗涤的意外低百分比。Culligan等人(2003)将厌氧培养作为他们方案的一部分，而我们由于资源优先考虑而没有进行。有氧培养、qPCR和基因测序最初被认为足以提供洗涤中存在的细菌的全面特性。事后看来，由于qPCR实验中遇到的局限性，厌氧培养是有益的。Culligan等人(2003)使用有氧/厌氧运输系统收集阴道拭子，并在运输到实验室后立即进行培养。在进行培养前，我们收集了用0.9%生理盐水冲洗阴道袖带，将样品装入无菌标本容器中，并将样品冷藏长达24小时。洗涤样品被冷藏，并在第二天作为批次处理，以使实验室工作人员在正常工作时间内执行该规程。因此，洗涤物中一部分活菌可能在运输和储存过程中丢失。此外，我们的手术团队在进行盆腔清洗时经常使用超过200毫升，从而稀释了可能存在于手术部位的细菌。

所有三个积极的文化清洗样品生产粪大肠大肠内生的一种生物，是阴道菌群的组成部分[6，11］．粪大肠是盆腔脓肿的主要病原体[6，14］．一个未受教育的棒状杆菌属Sp.在一个培养阳性样本中出现，对阴道、其他粘膜(如口咽)也是内源性的，也可在皮肤表面(如手)发现[6，15］．这种微生物已被确认为盆腔感染的病原体[14，15］．

这些微生物可能是在实验中受到污染的结果，因为三个阳性样本中有两个基线培养是阴性的，而第三个则没有进行基线培养。然而,葡萄球菌epidermidis是手上最主要的微生物吗?如果实验室工作人员污染了样本，人们会认为这个物种会存在[15］．三种培养基均呈阳性粪大肠，这似乎更有可能是这种生物存在于阴道切开后的阴道袖口。这是可能的粪大肠在低浓度的洗涤中存在，因此被基线培养所遗漏。此外，如果清洗确实包含围手术期抗生素和手术擦洗准备，这是可能的粪大肠可能会对抗生素产生耐药性，并随着时间的推移产生菌落。为了进一步了解，可以分析盆腔清洗是否存在抗生素和手术擦洗准备。此外，可以进行全基因测序来确定是否存在抗生素和手术擦洗准备粪大肠由于在实验中受到污染而来自同一个人(即实验室工作人员)，或者细菌来自不同的人，表明手术部位受到了阴道菌群的污染。

3中有2个积极的文化16S rRNA的qPCR发现Ct值> 37，解释为可忽略或没有生物量存在。由于血液在洗涤过程中抑制荧光，对第三个培养阳性样品的测定不成功。虽然qPCR检测结果表明洗涤物中没有细菌，但体积小(500μL)的洗涤液用于qPCR实验，因此可能错过了活菌。然而，当培养阳性洗涤物产生≥5000 CFU/mL时，qPCR似乎可以检测到目标核酸，尽管使用的量很小。总的来说，qPCR检测的结果是不确定的。

5.结论

在体外实验证明GTM对菌落形成有促进作用大肠杆菌在PBS。然而，考虑到在充分消毒后手术部位清洗的阴性结果，GTM在促进甲状腺切除术后盆腔感染方面的作用可能是有限的。盆腔清洗分析显示存在粪大肠，但结果并不确定。建议进一步研究。GTM的使用应谨慎，仅根据制造商的说明，以最大限度地降低感染风险。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

作者要感谢Randy Ross和科罗拉多大学医学院的研究小组;科罗拉多大学医院的妇科/ONC和妇产科/妇科手术团队;Lubna Qamar和安舒茨医学院Spillman实验室的工作人员;查尔斯·安德森，安舒茨医学院妇产科/ONC医学博士。

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