磁化率的加德纳菌属鞘突天然抗菌素Subtilosin生物膜,ε-Poly-L-Lysine,月桂酰胺精氨酸乙酯

文摘

细菌性阴道炎是一种常见的阴道感染与众多妇科和产科并发症有关。这种情况的特点是厚阴道附着生物膜的存在,主要由加德纳菌属鞘突。这种生物被认为是感染的主要病原学的原因为各种机会主义者在利基市场铺平了道路。以前,我们报道,天然抗菌素subtilosin,ε-poly-L-lysine,月桂酰胺精氨酸乙酯选择性地抑制这种病原体的生长。在这项研究中,我们使用板数来评估这些抗菌素对建立了生物膜的功效g .鞘突。此外,我们验证和比较两种快速方法(ATP可行性和刃天青化验)antimicrobial-treated评估细胞的生存能力g .鞘突生物膜。测试了抗菌素,月桂酰胺精氨酸乙酯有强大的杀菌作用,其次是subtilosin,克林霉素和赖氨酸表现最弱的效果。板数量相比,ATP可行性和刃天青化验大大低估了抗菌剂的杀菌作用。我们的结果表明,这些化验应该为每个新的应用程序进行验证。

1。介绍

细菌性阴道炎(BV)是最常见的阴道感染育龄妇女(1,2]。这种情况的特点是阴道乳酸杆菌的更换各种predominantly-anaerobic病原体,如加德纳菌属鞘突,普氏菌,消化链球菌属,拟杆菌spp。通常与细菌总数上涨100 - 1000倍比正常水平在阴道3- - - - - -8]。这些变化在阴道内微生物群通常(但不总是)伴随着海拔的阴道pH值和大量的阴道分泌物,有典型的胺的气味9]。除了一个主要的麻烦由于其症状,BV(甚至无症状的形式)与严重的妇科和产科并发症有关10- - - - - -13]。特别是,BV可能导致孕妇早产,围产期死亡率和发病率的主要危险因素(14- - - - - -16]。BV的发展是一个风险因素堕胎后子宫内膜炎和盆腔炎妇科手术后17,18]。也有证据表明,BV增加传输和收购的机会性传播感染,如艾滋病毒(19,20.]和HSV-2 [21,22]。

由于这种疾病的性质复杂的幼童腹壁薄弱,传统治疗BV,与抗生素克林霉素和甲硝唑,臭名昭著的低(60%)疗效和高(30 - 40%)的复发性感染(23- - - - - -27]。BV的确切病因学尚不清楚尽管经过数十年的研究,这使得一个挑战设计有效的治疗(28]。因为大多数BV-related物种经常孤立的健康女性阴道的,许多研究人员认为BV微生物失衡而非感染(29日- - - - - -31日]。相反,也有证据表明,至少有一部分BV-related病原体可传播性(32,33]。最终,大多数研究者同意,BV的病因学是复杂的,感染的结果不仅取决于本土上的病原体,还阴道微生物和宿主的免疫(28]。

从历史上看,g .鞘突被认为是这种情况的唯一病原体(34,35),但是它的角色在BV的病因学是将多年来过多的其他细菌物种逐渐与条件(28,34,36]。最近的证据再次放置g .鞘突在聚光灯下。特别是,对阴道的研究显示附着生物膜密度的活检样本g .鞘突稀疏的细胞相比,发现只有在BV患者的阴道而不是在健康女性(37]。在体外研究评估依从性、生物膜的形成能力和细胞毒性在BV-related厌氧菌表示g .鞘突潜在毒性最高(38]。最后,阴道等为主的生物膜g .鞘突被证明存在以下标准抗生素治疗(39]。据推测,生物膜内细菌作为储层的恢复BV微生物群抗生素治疗停止后导致复发的BV (39]。这些发现表明,g .鞘突可能有BV感染过程中的主导作用,为各种机会主义者在阴道铺平了道路(38]。

抗生素的不到满意的性能被认为是由于他们不能完全根除BV-associated病原体(部分原因是出现电阻),和他们对健康产生负面影响阴道微生物群(37,39,40]。出于这个原因,小说抗菌素,有选择性地针对阴道病原体的能力,尤其是生物膜,是非常必要的。

细菌素的subtilosin BV是一个有前途的替代治疗,尤其是当用作multiple-hurdle方法的一部分,这一战术众所周知大大阻碍微生物耐药机制(41,42]。Subtilosin (Subtilosin)是一个循环34-amino酸肽dairy-derived产生的应变,芽孢杆菌amyloliquefaciensKATMIRA1933。这种肽抑制BV-associated的生长g .鞘突,Mobiluncus curtisii,消化链球菌属anaerobius(41]。Sutyak诺尔et al。41)报道,天然抗菌剂ε-poly-L-lysine(赖氨酸)和月桂酰胺精氨酸乙酯(莱城)主体性subtilosin抑制g .鞘突。重要的是,subtilosin-based抗菌配方涉及赖氨酸和莱城没有抑制阴道乳酸杆菌菌株的生长(41]。赖氨酸是阳离子25至35赖氨酸残基组成的多肽。众多在活的有机体内研究表明,该抗菌对人类食用安全,目前在日本的商业市场作为食品防腐剂(43- - - - - -45]。莱城是月桂酸的衍生物,精氨酸,和乙醇46)通常被认为是安全的(GRAS)状态用于肉类、家禽和其他食品(肝注意到没有。入库单000164)。这一点,只有subtilosin的抑制活性,赖氨酸,莱城评估反对BV-related病原体。预防致病增长模型反映BV的预防治疗,但不一定,因为这种情况的特点是已经存在的致病阴道生物膜(37]。由于胞外基质和其他因素,保护生物膜细胞通常比浮游同行(抗压力47,48]。因此,浓度对生物膜有效的抗菌素预计将高于对浮游细胞有效浓度。

本研究评估subtilosin的杀菌性能,赖氨酸,对建立莱城g .鞘突生物膜相比,克林霉素。每个抗菌素的活动是由三种不同的评估方法(板计数、ATP可行性和刃天青化验)来确定每种方法的优势和局限性,当用于研究g .鞘突生物膜。

2。材料和方法

2.1。媒体、品种、生长条件

g .鞘突写明ATCC 14018−80°C存储在脑心浸液(BHI)中(Difco火花,MD)补充3%马血清(JRH生物科学,KS)和甘油添加到总量的15%。这些细胞被传播在37°C BHI厌氧3%马血清。对于实验过程,g .鞘突亚文化至少一次在BHI汤补充葡萄糖(BHIG)为1%。媒体用于所有程序g .鞘突preincubated一夜之间在37°C在厌氧环境中细胞(即最小化任何压力。、氧、低温)。

冻结的股票乳酸菌鞘突写明ATCC 49540,加氏乳杆菌写明ATCC 33323,乳杆菌写明ATCC 39268−80°C存储在夫人汤含有15%甘油(v / v)。DeMan细胞传播,Rogosa沙普(夫人)汤在37°C在有氧条件下,亚文化前至少两次被用于实验。

2.2。准备的抗菌素

使用的抗菌素subtilosin,ε-poly-L-lysine(赖氨酸)、月桂酰胺精氨酸乙酯(莱城),和克林霉素。Subtilosin是通过发酵产生的b . amyloliquefaciensKATMIRA1933和纯化如前所述42]。的水原液subtilosin含有2.65毫克/毫升的蛋白质,由微BCA。蛋白质分析工具包(热科学,罗克福德,IL)和产生一个乐队在银染色sds - page凝胶指示其纯度。赖氨酸(250毫克/毫升)和莱城(100 mg / mL, MIRENAT-CF)礼物Chisso美国,Inc .(美国纽约黑麦)和Vedeqsa Inc .(西班牙巴塞罗那),分别;克林霉素磷酸购买来自美国TCI(波特兰,或美国)。所有的抗菌素的水溶液filter-sterilized通过0.2μm注射器过滤器(耐尔根,罗切斯特,纽约,美国)之前使用。然后连续稀释了抗菌素BHIG肉汤达到理想的浓度。

2.3。Minimial抑制浓度

测试的最小抑制浓度(麦克风)抗菌素使用描述的分析测定Sutyak诺尔et al。41与一些细微的修改。短暂,连环二倍稀释抗菌准备在96孔酶标(BD,富兰克林湖,新泽西)拨款细菌生长介质被用作稀释剂。然后,一夜之间文化被添加到每个板的总量(200的1%μL)。g .鞘突板块在厌氧孵化24小时37°C。乳酸杆菌板块在孵化37°C在有氧条件下24小时。细菌生长潜伏期后评估通过一个端点在OD阅读_595年标仪(型号550、Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。

2.4。生物膜的增长

,除非另有说明,所有biofilm-related程序在37°C在厌氧手套箱(腼腆的实验室产品,公司,青草湖,MI,美国)是提供包含10%的气体混合物氢、5%的二氧化碳,和85%的氮气。生物膜生长,BHIG肉汤接种一夜文化(1%)和分发96 -微型板块(200μL在每个)。透明的微量组织培养板与平坦的底部(BD)被用来种生物膜实验涉及抗菌素。生物膜是生长在不透明的组织培养板(BD)比较完整的ATP含量和破坏生物膜。盘子被孵化25或50小时(根据实验目的)生长介质每25小时所取代。

抗菌素的活动是评估使用25-hour生物膜。的浮在表面的生物膜被使用微量吸液管,并且每个板轻轻洗了200μL BHIG肉汤。200μL (BHIG肉汤包含所选抗菌素是在每个生物膜。25小时后孵化antimicrobial-containing介质被微量吸液管。每个轻轻洗了200年μL BHIG肉汤,200μL BHIG汤是在每个生物膜。每个生物膜的细胞生存能力量化使用以下三种方法。

2.5。板计数

生物膜被剧烈的移液第一次中断。然后细胞悬液是连续稀释使用BHIG肉汤和10μ每个稀释的L镀在四个复制(40μL总共)BHI琼脂板上使用降板方法描述Hoben和Somasegaran50)和Herigstad et al。51]。殖民地的盘子被数72小时的厌氧条件下孵化后37°C。

2.6。ATP可行性分析

ATP可行性分析进行了使用由帕特森等描述的方法。48与一些细微的修改。简单地说,生物膜被有力的吸量转化为细胞悬浊液。每个悬挂与BHIG肉汤稀释10倍和270年μL的稀释是转移到一个白色不透明细胞培养板(BD)。板是离心5分钟(1238克,22°C)和液体在每个小心翼翼地移除微量吸液管。然后轻轻地洗井和200μL (PBS缓冲。在这个过程之后,50μBacTiter-Glo L (WI Promega,麦迪逊,美国)试剂是分配在每个细胞。五分钟后孵化环境温度,发光读数(积分时间500毫秒)被使用Luminoscan上升(美国IL热科学、巴林顿)。除了实验样本,每个板包含标准被用来构造有关的标准曲线的测量发光活细胞计数(VCC)。这些标准是由大力吸量未经处理的生物膜,通过连续的细胞悬液稀释。

2.7。刃天青化验

描述的分析是使用方法进行Extremina et al。52)和佩蒂特et al。53)做了一些调整。破坏了生物膜移液,24μL 2μ刃天青的解决方案是添加到170μL细胞悬液。在OD吸光度的变化_595年监控每120秒使用一个Bio-Rad微型板块读者,500型(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。动力学曲线生成和微型板块经理5.2.1软件(Bio-Rad)。这个软件也被用来确定逆斜率(OD的变化_595年随着时间的推移,AU /秒)的每个曲线在600年第二次孵化时间间隔。逆坡预测是可行的细胞的数量成正比,因为它对应于刃天青的速度减少。

2.8。显微镜

显微成像、细胞生长在Lab-Tek II有房间的系统(NUNC盖玻片^TM美国罗彻斯特,纽约)25小时。生物膜处理如上所述,然后沾住/死BacLight细菌生存工具显微镜(分子探针,尤金,或者美国)按照制造商的指示。LSM的成像进行了710年共焦显微镜(卡尔蔡司,纽约,纽约,美国)在1000 x放大使用波长488纳米的激光和两个检测通道光谱范围在493 - 526和598 - 633 nm,分别。

2.9。数据分析和统计

所有实验至少重复三次。标准差是表示数据的误差。抗菌素的功效(图2)是评估使用累积数据从三个独立的实验。同时每个生物膜的细胞生存能力评估的三种方法。方法比较在一个实验中(图4)。除非另有规定,Microsoft Excel进行计算,结果画使用SigmaPlot 11.0 (Systat软件公司,芝加哥,美国)。统计分析了SigmaPlot 11.0 (Systat软件Inc .)使用学生的以及()。

3所示。结果与讨论

3.1。一般的描述g .鞘突生物膜

g .鞘突支流形成多层生物膜对聚苯乙烯和玻璃表面。显微镜检查的单层地区附近的边缘滑动显示细胞胞外多糖密集的在一个矩阵(图1)。正如所料,暴露在氧气和环境温度有不利的影响g .鞘突(54]。成熟的(25小时)g .鞘突生物膜的清洗和镀在板凳上所描述的帕特森et al。48](在有氧条件下环境温度)少100倍可行的细胞相比,生物膜在37°C的厌氧处理室;在这两种情况下琼脂板厌氧孵化。因此,细胞减少压力,所有程序,除了发光测量,进行厌氧室在37°C。

3.2。四种抗菌素对生物膜的杀菌效果g .鞘突

抗菌素的最小抑制浓度在我们系统类似报道g .鞘突在文献中(表1)。之前报道麦克风之间的差异价值观和我们测量的差异可以归因于细菌生长媒体和其他条件的分析。对于每个抗菌素,三个浓度范围覆盖100倍进行了测试g .鞘突生物膜。抗菌素之间的比较是在10 x麦克风浓度在文献中报道。

25小时后VCC的孵化g .鞘突生物膜达到10⁸CFU /厘米²。VCC并未改变以下额外的25小时的孵化BHIG肉汤(抗菌暴露的持续时间(图)2)。因此,任何减少VCC后暴露的生物膜抗菌素意味着细胞死亡。

克林霉素和赖氨酸生产的VCC₂减少g .鞘突(数据3 (b)和3 (c)、职责)。克林霉素的影响保持不变在测试范围内(16 - 1600μg / mL)表明它达到阈值的活动。只有最高浓度的赖氨酸(2500μg / mL) VCC减少了超过1日志。赖氨酸的抗菌活性与细胞表面的静电吸附导致细胞聚集并最终停止蛋白质合成(55]。同样,克林霉素是一种蛋白质合成抑制剂(56]。细胞功能受到这两种抗菌素可能不是建立了生物膜的基本生存在没有其他的压力。

克林霉素和赖氨酸相比,生物膜的VCC莱城减少g .鞘突通过5记录一个明确的剂量反应在测试范围内(10 - 1000μg / mL)(图3 (d))。很可能对生物膜的莱城的有效性g .鞘突至少是部分相关洗涤剂这种化合物的性质(46]。剂量反应在测试范围内(1 - 100μg / mL)也观察subtilosin浓度约为减少3-log VCC 10 x麦克风(图3(一个))。尽管subtilosin和莱城目标细菌细胞质膜,这两种抗菌素有不同的分子机制的行动46,57]。相比10 x麦克风,subtilosin少是有效地减少可行的生物膜细胞的数量比莱城但比克林霉素更有效和赖氨酸。

大多数研究者都认为,有效治疗BV应该有选择地目标BV-related病原体,同时允许健康阴道微生物群增殖和恢复。Swidsinski et al。37)报道,体内阴道乳酸杆菌没有形成汇合的生物膜;相反,他们在阴道上皮分布稀疏。因此,体外研究涉及乳酸杆菌生物膜体内可能不反映情况。由于这些原因,在我们的初步调查评估的安全选择抗菌素对常见孤立的阴道Lactobacilliusspp。(l .养狐场l . gasseri和l .杆菌)通过确定麦克风值。

中等收入国家之间的克林霉素大大不同的乳酸杆菌的物种,从0.78 > 50μ克/毫升(表2)。先前的报告还指出,克林霉素(灭滴灵)一样可以有害健康阴道微生物区系40]。相比之下,subtilosin不抑制任何选择乳酸菌种虫害即使在最高的测试浓度(100μg / mL)。

中等收入国家的赖氨酸和莱城测试物种之间的这种差别很大。一般来说,这两种抗生素的浓度,对生物膜的适度有效g .鞘突当单独使用也抑制阴道乳酸杆菌。因此,高浓度的莱城和赖氨酸可能影响女性阴道微生物平衡恢复受到BV的影响。然而,莱城和赖氨酸可用于低浓度结合代理代理如subtilosin增效剂。

以前,subtilosin显示与赖氨酸和莱城协同交互抑制的增长g .鞘突(41]。由于这些物质的主要作用方式不同(46,55,57,subtilosin莱城和赖氨酸也将对生物膜的协同工作g .鞘突相互结合在一起使用时,可能与传统抗生素。我们未来的工作将集中在组合这些物质对生物膜的影响。然而,它在技术上具有挑战性测试大量的样品使用平板计数。因此,我们评估和比较两个简单枚举的方法可行g .鞘突antimicrobial-treated细胞生物膜。

3.3。比较ATP可行性和刃天青化验板计数

帕特森et al。48]报道的使用ATP可行性分析研究的生物膜g .鞘突。然而,我们所知的分析还没有验证,对于这个特定的微生物,对其他方法。分析快速和方便,它依赖于假设细菌的人口成正比的ATP含量可行的细胞的数量(58]。这个假设通常适用于人口指数增长细菌。然而,众所周知,抗菌素可能有非常不同的ATP含量的影响靶细胞(28,57,59]。此外,由于独特的细胞壁结构,g .鞘突因很难溶解而臭名昭著。因此有可能溶解成分的化验设备不能有效地用于从细胞中提取ATP。细胞溶菌作用可能会进一步阻碍了生物膜矩阵。

最初,我们使用了BacTiter-Glo分析工具来比较完整的生物膜的ATP含量和细胞悬液源自相同的生物膜通过激烈的移液。可行的细胞的估计在完整的生物膜和派生细胞悬液可比(数据未显示),这表明生物膜矩阵不干扰测定。此外,连续的生物膜细胞悬液稀释ATP含量成正比的活细胞计数10之间的线性范围³-10年⁸CFU /毫升(图4(一))。相比之下,减少刃天青(图的线性范围4 (b))很窄(10⁷-10年⁸CFU /毫升)。我们所知,使用刃天青化验g .鞘突还没有被报道。

ATP可行性和刃天青化验显示相同的趋势作为抗菌剂的活动板计数。然而,实际的日志减少这两种方法估计不同于获得的数字板计数(图5)。一个主要差异是100倍的方法减少造成的VCC克林霉素没有透露的ATP可行性分析(图5 (b))。克林霉素抑制蛋白质合成(56]。差异的合理的解释是,克林霉素的活动并不影响细胞ATP含量。

subtilosin的影响也被严重低估了ATP的可行性分析(图5(一个))。这低估了可能是有关事实subtilosin(麦克风)诱发只有轻微流出的从细胞ATP (< 25%)g .鞘突,不诱导细胞内ATP水解(57]。很类似可能适用于其他抗菌素;即抗菌素可能杀死靶细胞没有消耗ATP,因此给假阴性也可能导致ATP可行性分析和刃天青化验。

同样重要的是要记住,尽管板计数是一个普遍接受的方法列举可行的细胞,它具有一定的局限性,特别是用于antimicrobial-treated生物膜。这种方法是基于假设每个活细胞产生一个殖民地,这可能不是真的由于细胞聚集。不同的细胞生物膜用抗菌素治疗可能丛比未经处理的生物膜。此外,细胞因抗菌素可能可行的但不是可耕种的(VBNC),这将导致低估了使用平板计数(60]。

最终,信息收集的所有三种方法互为补充。ATP可行性和刃天青化验都是简单和快速的方法。然而,这些方法提供的估计可行的细胞可以从板计数明显不同。我们建议验证这些方法对于每一个新的应用程序。尽管如此,这两种方法都可能仍然是有用的快速,保守(相对于板计数)抗菌活性的评估,特别是在大量样本必须被评估。

4所示。结论

板计数显示,10 x麦克风,biofilmsof莱城有强大的杀菌作用g .鞘突。Subtilosin稍微不那么有效,而赖氨酸和克林霉素诱导VCC只有轻微的减少。板数量相比,ATP可行性和resazurine化验可以大大低估某些抗生素的杀菌作用g .鞘突。因此,这些化验必须验证每一个新的应用程序。

确认

这项工作是由比尔和梅林达•盖茨基金会支持,探索大挑战(5轮,第一阶段给予m . l . Chikindas OPP1025200 y Turovskiy, t . Cheryian和p . j . -)和美国国立卫生研究院/国家过敏症和传染病研究所(1 r01ai084137 y Turovskiy, m . l . Chikindas和p . j . -)。

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