文摘

宫颈癌是一种常见的癌症造成全球女性。尽管持续感染致癌人类乳头状瘤病毒(HPV)的类型被认为是最重要的风险因素宫颈癌发展,不到5%的女性宫颈癌与人类乳头瘤病毒最终将发展支持其他分子事件,像methylation-dependent肿瘤抑制基因的失活,可能在颈cocontribute致癌作用。我们分析了三个候选基因的启动子甲基化(p16、管理和hMLH1) 403年液态细胞学样本。一般确认了甲基化在良性和病理损伤等级较高的样品和相关由细胞学,colposcopical,或与人乳头状瘤病毒DNA和组织学结果,信使rna特定HPV类型和p16的积极性INK4A蛋白表达。总体甲基化精度远低于传统的诊断测试排名作为一个辅助技术和更多的数据需要确定甲基化状态的精确值在宫颈致癌作用。

1。介绍

诊断宫颈癌仍然是第三个最常见的癌症类型的女性在世界范围内,尤其是在发展中国家,有超过500000个新病例估计和估计超过250000人死亡1]。宫颈癌发展的主要原因是感染人类乳头状瘤病毒(人类乳头瘤病毒)2),小的DNA病毒的致癌特性(3- - - - - -5]。有超过100个不同的人乳头状瘤病毒类型,但只有大约40中发现了宫颈上皮和大约20视为发展的癌症的高危因素(6,7]。尽管持续感染致癌人类乳头状瘤病毒(HPV)的类型被认为是最重要的风险因素宫颈癌发展,不到5%的女性宫颈癌与人类乳头瘤病毒最终将发展(8),支持其他分子事件cocontribute颈癌形成的概念。

肿瘤抑制基因的失活已被证明是一个关键的步骤在肿瘤发展9]。除了well-monitored抑制突变失活机制,染色体缺失,杂合性丢失,表观遗传失活的肿瘤抑制基因是一个最近发现,肿瘤抑制基因的启动子甲基化废除其表达式(10]。大量的研究已经证明,肿瘤抑制基因的启动子甲基化与颈致癌作用[11- - - - - -13),甚至与特定的病变的严重程度(14]。

Methylation-specific聚合酶链反应(MSP)是一个敏感的技术广泛用于识别启动子甲基化,主要是由于其成本低(15]。MSP,启动子甲基化被发现在不同的肿瘤抑制基因p16与细胞周期调控INK4A和DNA修复机制作为人类MutL同族体1 (hMLH1)和O6-Methylguanine DNA甲基转移酶(管理)11,13,16,17]。p16INK4A是一种蛋白质是在高档病变由于HPV癌蛋白表达,而抑制DNA修复机制已被证明发生在许多类型的癌(4,5,9,13]。

在本研究中我们使用MSP识别启动子甲基化三种以上提到的肿瘤抑制基因在正常和病理颈液态细胞学样本,为了评估他们使用识别病变。接下来,我们评估人乳头瘤病毒启动子甲基化的关系存在,mRNA表达,p16INK4A蛋白表达和临床病理的特性,为了澄清甲基化是否与人乳头状瘤病毒存在,病变进展。

2。材料和方法

2.1。标本

样本的一部分的样本主要筛查宫颈癌在希腊。总共有403液态细胞学(LBC)涂片女性能接受阴道镜被纳入本研究。这些包括340和63个样本与正常细胞学,组织学证实样品添加为了增加正常值负样本的数量和有一个更好的基线的启动子甲基化在“正常”的样本。研究人口由女性平均为36.8岁(min-max: 18 - 81),在18.9岁开始性交(13-30)和性伴侣平均值为3.9 (1 - 16)。细胞学涂片收集在液态媒体(美国马尔伯勒ThinPrep, Hologic),一个单层涂片制备通过自动化手段(TP2000处理器),根据Papanikolaou染色,和诊断是根据熟练cytopathologist[贝塞斯达系统18]。所有分子测试进行剩余LBC标本。组织学诊断是由技术熟练的histopathologist和用于统计目的CIN-I列为LSIL,而CINII和CINIII列为HSILs。

2.2。亚硫酸氢转换MSP

硫酸氢转换和PCR扩增的商用工具使用(Amplicolon、鸟类生存研究实验室,锡耶纳,意大利)来识别p16的启动子甲基化INK4A、hMLH1和管理。PCR产品在2%的琼脂糖凝胶进行了分析,在紫外光照射下与溴化乙锭染色和可视化。如果PCR产品只发现在unmethylated反应,unmethylated样本特征,而存在的PCR产物甲基化反应特征样本作为甲基化,无论unmethylated反应的结果。没有一个产品从反应特征样本为无效。unmethylated DNA控制包含在套件,而DNA甲基化控制是治疗后unmethylated控制拟建甲基转移酶(美国马萨诸塞州内)(见图1)。


图1
琼脂糖凝胶电泳的PCR产品(a)基因启动子甲基化的管理,(b) hMLH1, p16 (c)INK4A。李:DNA梯50个基点,+ ctl: DNA处理拟建,−ctl: unmethylated DNA控制,s1, s2:临床样品对甲基化管理和hMLH1不利。s2是p16阳性甲基化。
2.3。人乳头状瘤病毒类型和E6 / E7 mRNA的表达

DNA HPV类型进行使用商用设备(泥土HPV2, Genomica,马德里,西班牙),根据制造商的指示。工具包可以识别不同35人乳头状瘤病毒类型,分为低风险(40人类乳头瘤病毒6,11日,42岁,43岁,44岁,54岁,61年,62年,71年,72年,81年,83年,84年和89年)和高风险(人类乳头瘤病毒16,18岁,26岁,31岁,33岁,35岁,39岁,45岁,51岁,52岁,53岁,56岁,58岁的59岁,66年,68年,70年,73年,82年和85年)根据流行病学在特定等级的病变(6]。E6 / E7 mRNA表达被确认使用商用Nuclisens EasyQ HPV工具包(Biomerieux SA、马西l 'Etoile、法国),也就是说,能够发现mRNA的五种高危人乳头状瘤病毒类型(HPV16, HPV18、HPV31 HPV33,和HPV45)。积极和没有纳入所有模板控制实验。

2.4。p16INK4A蛋白表达

蛋白p16的表达INK4A被免疫细胞化学鉴定按照制造商的指示使用商业套装(CINtec细胞学,mtm实验室AG,海德堡,德国)。评价积极的染色是由一位有经验的cytopathologist。

2.5。统计分析

所有统计测试进行了使用IBM SPSS统计19 (IBM公司、纽约、美国)使用χ2分析,一对t以及和双变量相关分析。所有的分析试验是正反意义为95%。总体精度估计ROC分析使用组织学(HSIL +)作为黄金标准。

3所示。结果与讨论

启动子甲基化状态成功403个样本的分析管理,372个样本为p16 hMLH1和290个样本INK4A。p16INK4A蛋白表达是用于358个样本,HPV DNA打字398个样本和mRNA表达355个样本。colposcopical细胞学,组织学研究结果以及相关的曲线下的面积(AUC)值细胞学(0.863)和阴道镜(0.861)而组织学。

3.1。启动子甲基化和临床病理的发现

启动子甲基化状态总结在表的结果1。管理甲基化是最异常甲基化基因p16紧随其后INK4A最后通过hMLH1。管理甲基化与病变严重程度显著增加由细胞学( ),colposcopical ( )或组织( )发现。hMLH1甲基化,另一方面,显示显著增加与病变严重程度只与细胞学( )和colposcopical ( )发现,而p16INK4A甲基化显示无显著差异。任何的三个基因在统计学上更多的甲基化更严重的病变,由细胞学( ),colposcopical ( )或组织( )发现。

表1
启动子甲基化的结果。
3.2。启动子甲基化和分子/采用发现

p16的积极性INK4A与管理和p16蛋白表达增加INK4A甲基化( 和 )。与人乳头状瘤病毒DNA甲基化的管理增加积极性( ),整体mRNA积极性( ),HPV16 mRNA的表达( ),为HPV16 DNA积极性,HPV18、HPV68 ( )。hMLH1甲基化增加对低风险HPV DNA(与积极性 ),HPV16 mRNA ( )和DNA HPV40积极性,HPV51和HPV61 ( )。p16的甲基化INK4A与整体mRNA积极性增加( ),HPV16 mRNA的表达( ),HPV33 mRNA ( )HPV16、HPV43 HPV85 DNA积极性。要么HPV16, HPV45、HPV53 HPV61, HPV68积极性和HPV16 DNA HPV45 mRNA积极性是与增加甲基化基因的数量( )。

3.3。人乳头状瘤病毒状态,p16INK4A蛋白表达与临床病理的发现

病变的严重程度,是否由细胞学、阴道镜,或组织学与p16在统计学上更高INK4A蛋白表达、mRNA表达和存在高危HPV DNA的类型( )。HPV DNA积极性可能是只从高危类型与低风险或混合类型。低风险的存在HPV DNA只有与低级别病变( )。人乳头状瘤病毒DNA积极性更常见于年轻女性(35.5和39.3, )有更多的性伴侣(4.3和2.8, ),而p16INK4A蛋白表达是更常见的在老年女性(39.6和36.8, )和过早开始性生活(17.8和19.5, )。

3.4。讨论

提出了启动子甲基化是一个重要的辅助因子在致癌作用,尤其是在nonhereditary癌。肿瘤抑制基因的表观遗传失活作用已被证明是常见的许多类型的癌,而最近的证据支持其在宫颈癌症发展的贡献(10- - - - - -14]。

研究发现,增加启动子甲基化在病变进展而言,是部分与以前的研究一致11,12,14,19]。当前研究的主要区别是明显更大数量的样本包含在我们的研究和更高的积极性的甲基化率在我们的研究中。至于诊断或筛查工具的启动子甲基化,没有基因显示组织学的AUC超过0.6时,与HSIL截止,它作为一种辅助技术和更多的数据需要确定甲基化状态的精确值在宫颈致癌作用。

像预期的那样人乳头状瘤病毒DNA检测显示较低的高灵敏度特异性ROC曲线(图中所示2AUC 0.641),信使rna特异性高灵敏度较低(AUC 0.767)。p16INK4A蛋白表达显示显示比信使rna测试更好的特异性,但更糟糕的是灵敏度(AUC 0.694)。上述研究结果与之前的研究相一致,表明这些技术的使用进行女性(6,7,20.- - - - - -23]。


图2
ROC曲线分析。斜段是由关系。

p16的存在INK4A蛋白表达和启动子甲基化是确定HSILs和癌。由于细胞学样本的异质性,这可能反映了不同的路径在特定类型的细胞或激活可能是由于可以被识别的部分甲基化MSP但不足以废除蛋白表达(24]。管理甲基化是与之前报道严重病变的危险因素(7,20.,21,25),而有趣的是hMLH1甲基化与低风险合并感染人乳头状瘤病毒类型特别是低风险和高风险。

4所示。结论

管理异常的DNA基因启动子甲基化、hMLH1和p16INK4A是一种常见的发现在液态宫颈细胞学样本。尽管有统计上显著的增加DNA甲基化随着病变的严重程度增加,或者一个基因,或甲基化基因的总数,启动子DNA甲基化在识别严重病变的准确性较低。由于广泛使用在筛查项目是不被推荐的,因为更多的研究与更大的甲基化面板之前应该进行甲基化的确切意义颈致癌作用的阐明。

承认

本研究项目是由科研补助金从希腊Development-GSRT、项目AKAKOS ATT.95(代码)。