胃肠病学研究和实践

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体积2023年| 文章的ID6973723| https://doi.org/10.1155/2023/6973723

Downregulation的LncRNA SNHG7糖分会让结直肠癌细胞抵抗Anlotinib通过调节mir - 181 a - 5 - p / GATA6

邓锅 ,^1、2 Kehe陈 ,² 平陈 ,³ 刘昱 ,² 吴迎迎 ,² 和景宁黄 ²

学术编辑器: 卢卡斯Hawinkels

收到了 2021年9月20日

修改后的 2022年10月14日

接受 2022年10月18日

发表 2023年1月14日

文摘

长非编码rna的小说类监管机构在人类癌症。据报道,小核仁的RNA hostgene 7 (SNHG7)海绵小分子核糖核酸对结直肠癌(CRC)进展。鉴于其在癌症生物学重要的监管作用,我们怀疑SNHG7参与耐药性anlotinib CRC(作为)。为了回答这个问题,我们量化的表达SNHG7定量实时PCR。我们进行细胞计数Kit-8和集落形成试验,流仪分析,RNA下拉,RNA结合蛋白免疫沉淀反应试验,和荧光素酶报告实验证实SNHG7之间的交互,mir - 181 - 5 - p和GATA6。我们发现SNHG7显著调节CRC组织和细胞系和ATB-resistant细胞系,这是穷人总生存期的患者密切相关。功能丧失的研究表明SNHG7击倒可以抑制CRC细胞增殖,增加细胞凋亡,使敏感CRC细胞抵抗作为。机械的研究表明,SNHG7作为竞争内源性RNA海绵mir - 181 - 5 - p调节GATA6的表达,从而促进ATB-resistant细胞系作为阻力。总之,作为抵抗SNHG7扮演重要的角色,它可能被用来监测在CRC作为抵抗。

1。介绍

结直肠癌(CRC)是胃肠道肿瘤发病率和死亡率第二最高第三世界(1,2]。随着现代医学的出现,越来越多的化疗药物和新型靶向治疗已被引入临床实践,改善病人的预后和总生存期(OS) (3,4]。然而,抵抗化疗药物已经成为一个棘手的CRC患者生存的威胁(5]。因此,研究耐药CRC的潜在机制为临床治疗具有重要意义。

多种肿瘤包括长非编码rna (lncRNAs),小分子核糖核酸(microrna)和功能基因(mRNA)合作形成一个复杂的监管网络(lncRNA-miRNA-mRNA)调节增殖,凋亡,肿瘤细胞的耐药性6- - - - - -8]。LncRNAs是一组超过200个核苷酸的非编码rna的长度(9]。SNHG7是一个包含2157个核苷酸的lncRNA酸(10]。主要定位在细胞质中,作为一个竞争内源性RNA(龙头)海绵microrna调节靶基因的表达(11]。例如,SNHG7高度表达和调节基因表达在多种人类恶性肿瘤,包括mir - 193 b / FAIM2在肺癌12),mir - 503 /细胞周期蛋白D1在前列腺癌(13],miR-34a / notch 1在乳腺癌[14]。有趣的是,山等。11和李et al。15)独立报道,SNHG7表达式在CRC调节调节mir - 216 b / GALNT1和miR-34a / GALNT7促进细胞增殖、迁移,在CRC入侵。鉴于,我们推测SNHG7表达明显相关的可怜的无病生存和OS的CRC患者的耐药性anlotinib(作为)是司空见惯的事了。然而,有一个缺乏研究的角色SNHG7 CRC的耐药性。

mir - 181 - 5 - p是一个多方面的microrna参与许多疾病的监管。例如,mir - 181 - 5 - p被发现调节在胰腺癌(PC)和乳腺癌16,17)而抑制在2型糖尿病(18),脑缺血性损伤(19),和前列腺癌20.]。有趣的是,mir - 181 - 5的差别,对这些发现在CRC - p。例如,mir - 181 - 5 - p被下调lncRNA CRNDE通过骗取调节Wnt /活动β连环蛋白的信号,从而调节的发展和药物抗性CRC (21]。此外,mir - 181 - 5 - p被circNSUN2擦掉,这就增加了表达ROCK2和促进CRC的发展22]。因此,它是可能的,mir - 181 - 5 - p在CRC是参与作为抵抗。

GATA6 GATA家族中的一员,坐落在整个胃肠道上皮细胞有增殖腺窝室水平特别高。删除的GATA6小肠导致受损的隐窝细胞增殖,crypt-to-surface上皮细胞迁移,血统成熟,成熟小鼠结肠上皮细胞的基因表达(23,24]。GATA6 microrna的目标基因,可以调节癌症恶化。在结肠癌,GATA6过度调节的表达urokinase-type纤溶酶原激活物(uPA)基因,导致结肠直肠肿瘤发生和肿瘤入侵(25]。在人类结肠癌,GATA6 upregulation减少15-LOX-1的表达水平26]。考虑其基因表达的监管机构的角色,我们推测GATA6可能导致电阻作为。

作为一个高度选择性多靶向酪氨酸激酶抑制剂,已广泛应用于非小细胞肺癌的化疗,软组织肉瘤、肾癌、肝癌、胃癌(27,28]。作为抑制血管生成、转移、细胞增殖和多药耐药性在CRC (29日]。作为能有效抑制VEGFR的活动,PDGFR, FGFR, c - kit,和其他激酶,从而抑制肿瘤血管生成和增长。作为一个潜在的三线治疗,作为安全有效治疗转移性CRC患者(30.]。作为抵抗肺癌已成为限制因素的临床疗效31日]。考虑在CRC的广泛处方作为治疗,理解作为抵抗CRC的潜在机制将有利于提高涉及作为临床治疗的疗效。在这项研究中,我们发现SNHG7在CRC调节,这表现出反向与预后相关。此外,我们表明,SNHG7可能充当龙头、海绵mir - 181 - 5 - p GATA6上调表达,导致CRC作为抵抗细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类CRC细胞系,包括HCT116、HT29 HCT8, lovos, SW480, SW620, DLD1,和人类上皮细胞系NCM460从美国获得类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。在rpmi - 1640细胞培养(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)含10%胎牛血清(的边后卫,热费希尔科学),100年μ克/毫升的链霉素(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),和100 U /毫升的青霉素(表达载体)湿润孵化器在37°C公司为5%₂。细胞融合60%被用于后续的实验。

2.2。组织样本

CRC患者共50岁的男性和23个女性(27)39 - 67年招募从2019年6月到2021年7月在广西人民医院,中国南宁。没有一个病人接受手术前化疗和抗癌治疗。所有CRC组织和邻近的正常组织(5厘米的肿瘤病灶)是在手术过程中收集的,和CRC诊断验证了由两个独立病理学家。立即组织标本在液态氮冷冻,储存在−80°C。所有的病人提供书面知情同意。本研究通过广西人民医院的机构审查委员会(没有批准。gxnn - ky - 2175)。

2.3。建设ATB-Resistant CRC细胞

HCT116、lovos细胞( )暴露在100毫克/毫升N乙基-N亚硝基脲(Sigma-Aldrich,伯灵顿,妈,美国)的24小时,接着用一个梯度浓度作为诱导作为阻力。在第一个五天,HCT116和lovos细胞暴露于作为(4μg / mL),每天都中了。在接下来的两个月,6、8、10和12μ克/毫升的作为被用来治疗细胞(32]。最后,大约100个变量细胞暴露于作为(12μg / mL)恢复。扩散大约一个月后,ATB-resistant HCT116和lovos细胞,命名HCT116 /作为和lovos /作为分别被用于功能化验。

2.4。细胞转染

siRNAs瞄准SNHG7, mir - 181 - 5 - p模仿,和mir - 181 - 5 - p抑制剂被上海GeneChem有限公司设计有限公司,上海,中国。超表达结构,oe-SNHG7 oe-GATA6,由上海GenePharma有限公司有限公司,上海,中国,克隆的开放阅读框GATA6到表达载体pcDNA 3.1 (+) (Sigma-Aldrich;默克公司,达姆施塔特,德国)。空向量[(pcDNA3.1(+))是用作GATA6负控制过度。总共20 nM的每个构建转染到细胞在37°C 15分钟后使用Lipofectamine 3000(热费希尔科学)制造商的协议。48小时后,转染细胞收获进行后续实验。序列如下:

si-NC: 5 - - - - - -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ;

si-SNHG7: 5 - - - - - -UUAGCAGAGUAAUUUGCACUU-3 ;

mimics-NC: 5 - - - - - -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ;

mir - 181 a - 5 - p模仿:5 - - - - - -AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3 ;

inhibitor-NC: 5 - - - - - -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ;

mir - 181 a - 5 - p抑制剂:5 - - - - - -ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU-3 。

2.5。RNA提取和定量实时PCR(存在)

总RNA提取使用试剂盒试剂(热费希尔科学),评估和量化使用NanoDrop ND2000显微分光光度计(热费希尔科学)。随后,相反的总RNA转录成cDNA根据协议的反转录系统(WI Promega,麦迪逊,美国)。存在分析使用SYBR绿色主人混合(CWBIO,北京)。本研究中使用的引物合成了Sangon生物技术,上海,中国。相关基因的表达水平是由2^−ΔΔCt方法。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)和U6被用作内部参考基因(33]。实验进行了一式三份。使用的引物中存在:

SNHG7:

转发:5 - - - - - -GTGACTTCGCCTGTGATGGA-3 ,

反向:5 - - - - - -GGC CTCTATCTGTACCTTTATTCC-3 ;

mir - 181 a - 5 - p:

转发:5 - - - - - -GGGCAGCCTTAAGAGGA-3 ,

反向:5 - - - - - -GGC CTCTATCTGTACCTTTATTCC-3 ;

GATA6:

转发:5 - - - - - -AGCAAGATGAACGGCCTCAG-3 ,

反向:5 - - - - - -GTTGTGGTGTGACAGTTGGC-3 ;

GAPDH:

转发:5 - - - - - -TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3 ,

反向:5 - - - - - -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC 3 ;

U6:

转发:5 - - - - - -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ,

反向:5 - - - - - -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 。

2.6。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

CCK-8试验是用来探测技术的扩散HCT116 /作为和lovos /作为细胞。简单地说,100年μL细胞悬液接种于96孔板( /)和细胞培养在37°C, 5%的公司₂。在那之后,10μL CCK-8解决方案(Sigma-Aldrich)添加到细胞培养(0)24、48和72小时。最后,光密度值被记录在450 nm使用标仪(美国BioTek Winooski, VT)。

分析技术作为HCT116 /作为细胞毒性和lovos /作为细胞,添加不同浓度的作为细胞培养。然后,盘子里是培养48小时37°C, 5%的公司₂。然后,10μL CCK8的解决方案是添加到每个好,和细胞进一步培养1 - 4小时。作为HCT116 /作为细胞毒性和lovos /作为细胞测量使用标(BioTek)。

2.7。集落形成实验

HCT116 /作为和lovos /作为细胞( )在对数生长阶段不同治疗方法接种在菜包含杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)中含有10%的边后卫。细胞培养在37°C 2 - 3周,直到克隆形成。克隆与4%多聚甲醛固定(Sigma-Aldrich)和沾GIMSA解决方案(Sigma-Aldrich)在室温下10 - 30分钟。分析了殖民地使用ImageJ软件v1.8.0(美国国立卫生研究院)。克隆形成率评估的公式:“克隆形成率=数量的克隆/细胞数量×100%。”

2.8。荧光素酶报告实验

分析的规定SNHG7 mir - 181 - a - 5 - p,记者质粒是由融合SNHG7 cDNA荧光素酶基因的3’utr区域。分析的规定GATA6 mir - 181 a - 5 - p,记者质粒是由融合GATA6 cd光盘的荧光素酶基因。合成mir - 181 - 5 - p和记者质粒co-transfected进HCT116 /作为和lovos /作为细胞。荧光素酶活动测量使用荧光素酶检测系统(Promega)反映荧光素酶的降解:SNHG7或荧光素酶:GATA6。

2.9。RNA下拉

PCR产品验证通过凝胶电泳和纯化苯酚:氯仿提取。Biotin-labeled mir - 181 - 5 - p和反义杂交探针获得的感觉在体外转录(罗氏、巴塞尔、瑞士)。探针与胞质提取物孵化HCT116 /作为还是lovos作为细胞形成miRNA-lncRNA化合物,分离使用磁珠(热费希尔科学)与亲和素标记。最后,存在分析确定了浓缩免疫沉淀反应的SNHG7 RNA。

2.10。RNA结合蛋白免疫沉淀反应(RIP)测定

RIP进行确认SNHG7之间的交互和mir - 181 - 5 - p使用EZMagna RIP工具(美国微孔,伯灵顿,MA)。简而言之,HCT116 /作为和lovos /作为细胞细胞溶解在一个完整的RIP裂解缓冲。然后,细胞溶解产物孵化了RIP缓冲区包含磁珠涂anti-Ago2或anti-IgG抗体4小时在4°C。最后,执行中存在确定SNHG7的浓缩和mir - 181 - 5 - p免疫沉淀反应的RNA。

2.11。流仪分析(FITC-PI)

HCT116 /作为和lovos /作为细胞( )培养在six-well盘子然后收获在离心管。贴壁细胞治疗与trypsin-Ethylene二胺四乙酸(EDTA)解决方案(J&K科学,北京)和被转移到新的离心管。离心收集的细胞5分钟,紧随其后的是一个用胎牛血清(PBS)。然后,这些细胞被resuspended在195年μ10 L绑定缓冲和孵化μg / mL膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC;Sigma-Aldrich)在室温下10分钟在黑暗。离心收集的细胞5分钟,resuspended在190年μL具有约束力的缓冲区,并保持在冰上。然后,10μL (propidium碘(π,Sigma-Aldrich)添加到绑定缓冲。细胞凋亡的HCT116 /作为和lovos /作为分析使用一个FACScan流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)。

2.12。免疫印迹分析

HCT116 /作为和lovos /作为细胞用PBS缓冲。然后,细胞resuspended和细胞溶解使用radioimmunoprecipitation化验裂解缓冲(热费希尔科学)收集总蛋白。蛋白质的浓度是衡量bicinchoninic酸的方法。总的来说,50μ克蛋白质分离12.5%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide-polyacrylamide凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Sigma-Aldrich)。阻塞后1%牛血清白蛋白(BSA)为1小时,孵化了PVDF膜的主要特殊抗体bcl - 2 (1: 1000;春秋国旅),caspase-3 (1: 1000;春秋国旅),GATA6 (1: 1000;春秋国旅),GAPDH (1: 1000;春秋国旅)在4°C 24小时。然后,相对应的膜是孵化HRP-labeled山羊Anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L) (Abcam,剑桥,英国)。最后,PVDF膜染色使用电视台/ BCIP试剂盒(热费希尔科学)和量化使用ImageJ软件。GAPDH是作为内部控制。实验做了三个生物一式三份。

2.13。动物模型建立

雄性BALB / c裸小鼠( ,4 - 5周大,15 - 25 g)购买国家实验动物中心(中国,北京)和在特定的无菌条件与调节昼夜周期。总共转染HCT116 /作为细胞皮下注射到裸鼠的侧翼。肿瘤大小是由双边卡尺测量每7天直到28天注射。肿瘤体积的计算是基于公式(长×宽2/2)。随后,老鼠被麻醉下颈椎脱位牺牲。然后,确定肿瘤体积。所有的实验都遵守制度动物保健的广西人民医院,中国,和实验动物伦理委员会批准广西人民医院,中国(批准号ir - d - 2022 - 2 - 18)。

2.14。统计分析

三个生物复制的数据分析和画GraphPad棱镜的软件。所有数值数据被当作手段±标准差(SD)。学生的t以及和单向方差分析图基的紧随其后事后测试被用来分析两个和多个组,分别。SNHG7的表达之间的相关性,mir - 181 - 5 - p和GATA6被斯皮尔曼相关分析确定。操作系统利率计算生存率较使用kaplan meier方法。被认为是统计学意义。

3所示。结果

3.1。SNHG7是CRC组织和调节ATB-Resistant细胞系

首先,我们检查的表达SNHG7在基因表达数据下载的癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合(GEO)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。SNHG7 CRC的表达高于正常组织(数字1(一)和1 (b))。然后,我们分析的相关性SNHG7表达式由kaplan meier CRC患者的预后分析。的操作系统的高表达患者SHNG7是短比低表达患者(图1(一))。然后,我们执行中存在量化SHNG7成绩单在50对crc和paracancerous组织。SHNG7 CRC组织中的表达明显高于健康组织(图1 (c))。此外,的表达SHNG7 inHT29, HCT116、HCT8, lovos, SW480, SW620细胞DLD1 CRC(图1 (d))高于控制。此外,我们检查的表达SHNG7 ATB-resistant细胞系,HCT116 /作为和lovos /作为。两ATB-resistant SHNG7细胞系的表达高于控制(图1 (e))。这些结果表明,SNHG7表达式是调节在CRC,这可能有助于抵抗作为。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

图1

SNHG7调节在CRC的表达。(a)基因表达分析交互式分析(GEPIA) TCGA的数据评估SNHG7表达直肠癌(红色列)。(b) SNHG7 GSE75970表达的地理数据集。(c)中存在测量检查SNHG7的表达水平在50对crc和paracancerous组织。(d)中存在的分析,以确定在CRC SNHG7细胞系的表达水平,HT29, HCT116、HCT8, lovos, SW480, SW620, DLD1 NCM460以及正常细胞线。(e)中存在的分析检测SNHG7表达ATB-resistant细胞系HCT116 /作为和lovos /作为。统计学意义上的差异是由学生的评估t以及(* ,* * ,和* * * )。

3.2。击倒SNHG7抑制CRC细胞增殖和作为阻力在体外和在活的有机体内

我们推测SNHG7超表达会增加电阻的CRC细胞作为。为了验证这一点,我们首先在CRC细胞过表达SNHG7。图2(一个)报告SNHG7表达水平的增加与oeSNHG7细胞转染。然后,我们使用CCK-8试验作为评价oe-SNHG7细胞系的易感性。结果表明,SNHG7超表达显著增加细胞的存活率和IC50处理不同浓度的作为(图2 (b))。鉴于肿瘤的抗凋亡能力的重要性,在发展中许多肿瘤的耐药性,我们评估细胞增殖能力和细胞凋亡在ATB-resistant细胞系(34,35]。与对照组相比,细胞的可行性oe-SNHG7细胞系显著增加(图2 (c))。接下来,我们开始着手研究SNHG7的功能丧失的功能分析。我们沉默的表达SNHG7 HCT116 /作为和lovos /作为细胞系在抵抗作为进一步研究其作用。如图2 (d),SNHG7在si-SNHG7细胞系的表达水平下降了约50%。CCK-8结果表明SNHG7击倒显著减少的存活率和IC50 ATB-treated细胞(图2 (e))。与控制相比,si-SNHG7细胞株的细胞生存能力明显降低(图2 (f))。集落形成试验表明,si-SNHG7细胞系克隆形成少比控制(图2 (g))。这些结果表明,si-SNHG7击倒显著ATB-resistant细胞株细胞增殖能力的减退。相比之下,细胞凋亡率明显高于控制(图2 (h))。caspase-3和bcl - 2 apoptosis-related蛋白质。据报道,昆虫Sf9 caspase-3可以诱导细胞凋亡的细胞,它可以被bcl - 2 (36]。我们确定这两个蛋白的水平si-SNHG7细胞系用免疫印迹。结果表明,caspase-3水平增加,而bcl - 2的水平是减少si-SNHG7细胞系(图2(我)),这也许可以解释ATB-resistant细胞系的抗凋亡能力。研究SNHG7在肿瘤生长的作用,HCT116 /作为细胞转染与si-SNHG7注入小鼠建立异种移植肿瘤模型。肿瘤细胞来源于与SNHG7击倒一个小得多的规模(图展出S1A)。总的来说,这些结果表明,SNHG7击倒抑制CRC细胞增殖和作为阻力在体外和在活的有机体内。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(我)

图2

击倒在CRC SNHG7反转作为抵抗细胞。(a)中存在暴露的SNHG7 upregulation oe-SNHG7细胞系(HCT116 / ATB-oeSNHG7和lovos / ATB-oeSNHG7细胞株)。(b)的存活率SNHG7-overexpressing HCT116 /作为和lovos /作为细胞系处理0,2、5、10和20μM作为。(c) CCK8化验检查oeSNHG7细胞株的细胞生存能力。(d)中存在测量检查在siSNHG7 SNHG7细胞系的表达(HCT116 / ATB-siSNHG7和lovos / ATB-siSNHG7击倒细胞株)。(e)的存活率HCT116 /作为和lovos /作为细胞系SNHG7击倒,对待0,2、5、10和20μM作为。(f) CCK8化验显示siSNHG7细胞株的细胞生存能力下降。(g) Clone-forming HCT116能力/作为和lovos /作为细胞系SNHG7击倒。(h)流仪分析检测siSNHG7细胞株凋亡水平和控制。下调的SNHG7 HCT116 /作为和lovos /作为细胞系细胞凋亡增加。(我)免疫印迹蛋白质水平的确定caspase-3和bcl - 2。caspase-3的表达水平增加,而bcl - 2是减少siSNHG7细胞系。统计学生的差异进行评估t以及(* ,* * ,和* * * )。

3.3。SNHG7海绵mir - 181 - CRC - 5 - p

据报道,SNHG7本地化细胞细胞质和功能为龙头、海绵microrna的调节基因的表达(11]。因此,我们预测SNHG7 microrna的监管。Startbase3分析显示一个潜在的结合位点的mir - 181 a - 5 - p在SNHG7(图3(一个))。然后,我们实现了荧光素酶记者分析,RNA下拉,把研究之间的交互mir - 181 a - 5 - p和SNHG7。过度的mir - 181 - 5 - p抑制荧光素酶活动HCT116 /作为和lovos /作为细胞系;被废除的效果可能mir - 181 - 5 - p在SNHG7结合位点突变(图3(一个))。RNA拉结果表明更多SNHG7碎片丰富了mir - 181 - 5 - p探针比控制探针(图3 (b))。把结果表明SNHG7和mir - 181 - 5 - p碎片都使用磁珠免疫沉淀反应涂层与anti-Ago2而anti-IgG抗体(图3 (c))。因为SNHG7调节在CRC组织(图1),我们预计,microrna - 181 - 5 - p应该CRC组织中表达下调。事实上,我们发现mir - 181 a的表达水平- 5 - p是减少在50 CRC组织相对于相邻组织(图3 (d))。TCGA数据同时显示,在相同的表达式模式(图3 (e))。此外,斯皮尔曼相关分析之间表现出显著的负相关的表达SNHG7和mir - 181 - 5 - p(图3 (f))。在一起,这些结果说明mir - 181 - 5 - p被SNHG7擦掉和监管。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

图3

mir - 181 a - 5 - p是直接由SNHG7监管。(a)的潜在结合位点mir - 181 - 5 - p在SNHG7预测StartBase3和荧光素酶报告实验证实了HCT116 /作为和lovos /作为细胞系。过度的mir - 181 - 5 - p可以抑制荧光素酶活性,但抑制潜在的网站是突变时被废除。(b) RNA拉试验表明SNHG7碎片丰富有效使用mir - 181 - 5 - p探针技术在HCT116 /作为和lovos /作为细胞系。(c) RIP-qRT-PCR显示SNHG7和mir - 181 - 5 - p片段被Ago2 HCT116 /作为丰富和lovos /作为细胞系。(d)中存在的表达分析mir - 181 - 50 - 5 - p对crc和邻近组织。(e) StartBase3表达式的分析mir - 181 - 5 - p TCGA的数据。(f)斯皮尔曼相关分析揭示SNHG7之间显著负相关和mir - 181 - 5 - p在50个CRC的病例。统计学生的差异进行评估t以及(* ,* * ,和* * * )。

3.4。SNHG7调节GATA6表达式通过骗取mir - 181 - 5 - p

我们使用TargetScan筛选潜在目标基因受mir - 181 - 5 - p,发现GATA6包含一个结合位点的mir - 181 a - 5 - p(图4(一))。我们采用荧光素酶报告实验来验证之间的交互mir - 181 a - 5 - p和GATA6。超表达mir - 181 - 5 - p的荧光素酶活性抑制HCT116 /作为和lovos /作为细胞的细胞系,但没有mir - 181 - 5 - p结合位点突变(图4 (b))。接下来,SNHG7之间的关系,mir - 181 - 5 - p和GATA6探索。CRC组织的表达水平CRC GATA6较高的组织比健康的邻近组织。的表达水平GATA6 SNHG7呈正相关,而负面mir - 181 a - 5 - p(图4 (d))。此外,我们研究了SNHG7能否调节GATA6的表达。ATB-resistant细胞系,下调SNHG7 GATA6的表达减少,由附加的部分恢复mir - 181 a - 5 - p抑制剂(图4 (c))。上述结果表明,SNHG7调节GATA6表达式通过骗取mir - 181 - 5 - p。此外,我们发现的蛋白质水平GATA6用免疫印迹技术在HCT116 /作为细胞转染OE GATA6(图印地)。结果,GATA6表达水平显著增加,表明转染的过度构建是成功的。

(一)

(b)

(c)

(d)

图4

SNHG7促进GATA6表达式通过骗取mir - 181 - 5 - p。(一)潜在的结合位点mir - 181 - 5 - p在TargetScan GATA6发现。(b)荧光素酶报告实验来验证之间的交互mir - 181 - 5 - p和GATA6 HCT116 /作为和lovos /作为细胞系。mir - 181 - 5 - p过度抑制荧光素酶活性,但抑制消失在GATA6结合位点突变时。(c)免疫印迹和存在的GATA6差别显示了对这些SNHG7击倒的转染和GATA6 upregulation mir - 181 - 5 - p HCT116 /作为和lovos /作为细胞系。(d)中存在测量检查GATA6的表达水平在50对crc和邻近组织。GATA6之间显著负相关和mir - 181 - 5 - p和GATA6之间显著正相关,SNHG7被斯皮尔曼相关分析观察CRC的50例。统计学生的差异进行评估t以及(* ,* * ,和* * * )。

3.5。SNHG7调节CRC CRC的技术进展和作为阻力调节GATA6表达式通过骗取mir - 181 - 5 - p

证明SNHG7, mir - 181 a - 5 - p,在CRC GATA6共同形成一个监管网络,我们开始探索的角色SNHG7 / mir - 181 - 5 - p / GATA6轴作为阻力。与对照组相比,SNHG7击倒ATB-resistant CRC细胞的存活率降低处理不同浓度的作为,这是部分恢复了overexpressing GATA6或添加mir - 181 a - 5 - p抑制剂(图5(一个))。此外,GATA6过度或mir - 181 - 5 - p抑制可以恢复si-SNHG7细胞株的细胞增殖能力(图5 (b))。流仪分析表明,GATA6过度或mir - 181 - 5 - p细胞凋亡的抑制增强si-SNHG7细胞系(图5 (c))。相应地,caspase-3的表达减少,而bcl - 2的表达增加si-SNHG7细胞overexpressing GATA6或mir - 181 a - 5 - p抑制(图5 (d))。这些结果说明SNHG7 / mir - 181 - 5 - p / GATA6轴中扮演一个重要的角色在CRC作为阻力。

(一)

(b)

(c)

(d)

图5

SNHG7击倒提高了CRC的ATB-sensitivity通过调节mir - 181 - a - 5 - p / GATA6。(a)的存活率HCT116 /作为和lovos /作为细胞系处理0,2、5、10和20μM作为。SNHG7击倒存活率下降,部分恢复了overexpressing GATA6或mir - 181 - 5 - p抑制剂。(b) siSNHG7细胞株的细胞生存能力。减少细胞生存能力得到部分恢复了overexpressing GATA6或mir - 181 - 5 - p抑制剂。(c)流仪分析细胞凋亡水平。下调的SNHG7 HCT116 /作为和lovos /作为细胞系细胞凋亡增加,部分逆转的overexpressing GATA6或mir - 181 - 5 - p抑制剂。(d)免疫印迹确定caspase-3的水平和bcl - 2, apoptosis-related蛋白质。Caspase-3表达增加,但在siSNHG7细胞系bcl - 2表达减少,部分逆转的overexpressing GATA6或mir - 181 - 5 - p抑制剂。是由学生的统计比较t以及(* ,* * ,和* * * )。

4所示。讨论

作为,multikinase血管生成抑制剂,能有效抑制VEGFR PDGFR, FGFR, c - kit,和其他激酶,可以诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖通过Erk和Akt通路37]。在2018年,它被批准临床治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌的国家医疗产品管理局(GYZZ H20180002, GYZZ H20180003,和GYZZ H20180004)。然而,像这种情况与其他靶向治疗药物,耐药性作为在多个肿瘤发展。内在或获得性耐药是一个复杂和多因子的事件和操作系统仍然是一个重大挑战的先进的CRC患者接受药物治疗。抗凋亡能力的提高,如抗凋亡基因的表达或失去pro-apoptotic基因,在肿瘤细胞耐药的重要机制(34,35]。在过去的几十年中,许多特异表达lncRNAs已经发现与致癌作用和各种恶性肿瘤的进展38]。SNGH7据报道是调节在多个肿瘤,包括CRC,这增强了细胞增殖和抑制细胞凋亡10,13- - - - - -15),这表明在CRC SHNG7可能参与作为抵抗。在这项研究中,我们发现SNHG7显著上调CRC和ATB-resistant CRC细胞株比控制。此外,SNHG7的高表达水平显著相关的可怜的操作系统。因此,这些结果表明,SNHG7扮演着一个重要的角色在CRC阻力作为。

进一步阐明SNHG7的角色作为阻力,SNHG7表达沉默RNA干扰在ATB-resistant细胞系HCT116和lovos细胞。低表达的细胞SNHG7表现出减少细胞增殖和细胞凋亡增加。此外,SNHG7击倒的敏化CRC细胞抵抗作为。SNHG7通常充当龙头、海绵各种microrna和调节目标基因的表达在不同的恶性肿瘤,包括CRC。在这项研究中,我们发现mir - 181 a - 5 - p是SNHG7的直接目标。我们的结果显示SNHG7之间的负相关和mir - 181 - 5 - p。此外,我们发现SNHG7和GATA6 CRC之间的正相关关系。超表达GATA6或添加mir - 181 - 5 - p抑制剂可以部分逆转SNHG7击倒的效果,如细胞增殖能力下降,增加了细胞凋亡,对作为增加。总之,我们的结果说明,SNHG7 upregulation导致CRC的阻力作为规范mir - 181 a - 5 - p / GATA6轴。值得注意的是,SNHG7海绵已经报告给其他microrna和调节相关基因的表达。 Shan et al. [11和李et al。15)报道,SNHG7可以调节mir - 216 b / GALNT1和miR-34a / GALNT7促进细胞增殖、迁移,在CRC入侵。因此,SNHG7可以调节目标基因多个microrna /轴在CRC促进肿瘤发生和作为抵抗。

然而,通路的下游SNHG7 / mir - 181 - 5 - p / GATA6轴仍然难以捉摸。GATA6可以绑定uPA激活其表达式的催化剂(25]。在CRC, GATA6超表达可以直接激活的表达富亮氨酸repeat-containing G protein-coupled受体5和随后的Wnt信号通路(39],以及REG4 [40),从而促进CRC的开发和发展。GATA6也可以激活Wnt信号途径的负调节Wnt拮抗剂Dickopf-1促进PC发展(41]。因此,在未来,我们将测试是否SNHG7 / mir - 181 - 5 - p / GATA6轴激活Wnt信号促进细胞增殖,在CRC作为抵抗。此外,Tankyrase抑制Wnt /β连环蛋白通路可以恢复抵抗PI3K和AKT抑制剂治疗CRC (41]。作为可以诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖通过ERK和AKT通路(37]。因此,它是合理的推测Tankyrase抑制也能恢复在CRC作为抵抗。在这种背景下,SNHG7能否调节Tankyrase值得未来研究的表达。

总之,我们的研究显示,SNHG7是调节组织和细胞系的CRC和ATB-resistant CRC细胞。SNHG7充当龙头、促进细胞增殖、抗凋亡能力,作为抵抗通过调节mir - 181 - 5 - p / GATA6 CRC的轴。我们的研究结果提供了一个新颖的洞察潜在的分子机制在CRC SNHG7促进作为抵抗。

数据可用性

所有支持数据的工作,不可以在公共场合由于道德的限制,可从相应的作者。

伦理批准

书面知情同意了所有的参与者。的伦理委员会批准的项目是广西壮族自治区的人民医院,中国南宁。实验涉及人类样本进行的处理,按照1975年的赫尔辛基宣言。

的利益冲突

所有作者同意出版。

承认

我们感谢那些评论家的建设性意见。

补充材料

图S1。(A)肿瘤大小在异种移植模型测量每7天直到后28天。(B)的表达水平明显增加免疫印迹检测GATA6与OE GATA6 HCT116 /作为细胞转染技术。(补充材料)

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