文摘

背景。坏死性小肠结肠炎(NEC)通常与夸张的激活炎症反应有关。虾青素已被证明在研究抗炎反应积极有利的影响。因此,它具有重要意义在NEC疾病研究虾青素的保护作用及其分子机制。客观的。本研究调查是否虾青素变弱NEC老鼠和探索其潜在机制。材料和方法。Hematoxylin-eosin染色被用来观察肠道组织病理改变的NEC老鼠。随后,我们确定了氧化压力、抗凋亡、抗炎与酶联免疫吸附试验包虾青素,TUNEL染色法、免疫印迹和免疫组织化学鉴定。此外,我们添加了nucleotide-binding寡聚化域2 (NOD2)抑制剂证明老鼠NEC的虾青素的分子途径。结果。虾青素改善肠道组织的病理变化。它抑制炎症、氧化应激和细胞凋亡保护肠道组织和血清的NEC老鼠。此外,虾青素增强NOD2,而抑制toll样受体4 (TLR4),核因子-κB (NF -κB) pathway-related蛋白质。除此之外,NOD2抑制剂抵消虾青素的保护作用对NEC老鼠。结论。目前的研究表明,虾青素缓解氧化应激、炎症反应、细胞凋亡在NEC老鼠提高NOD2和抑制TLR4途径。

1。介绍

在早产新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)是一种危险的疾病,可以是致命的。NEC的频率不断上升,尽管临床进展1]。具有高死亡率(20 - 30%),严重的NEC经常伴随着肠壁,坏死穿孔、腹膜炎(2]。很长一段时间,人们认为多个风险因素,包括早产、肠内喂养,肠道缺血,和细菌的影响,导致了NEC的发病机制(3),最终导致炎症和坏死。

炎症反应是至关重要的在新生儿NEC的发病机制(4]。先天免疫受体toll样受体4 (TLR4)似乎发挥核心作用在NEC的炎症发病机制。过度在上皮细胞TLR4信号通路对脂多糖(LPS)导致肠上皮细胞凋亡导致肠上皮细胞损失和随后的延迟修复通过抑制肠道干细胞的迁移和TLR4-mediated损失(5]。这些因素导致细菌和有限合伙人易位到循环,导致炎性细胞因子生产、活性氧(ROS)生产,增加表达的诱导一氧化氮合酶(间接宾语),和TLR4-mediated损失和失调的内皮一氧化氮合酶(以挪士)导致灌注受损6]。同样,nucleotide-binding寡聚化域2 (NOD2)是一个重要的监管机构的抵抗微生物入侵和维护组织内稳态的肠道疾病的生物7]。它已经表明TLR4信号通路和NOD2可以相互调节炎症细胞(7]。另一项研究中提到,有一个NOD2和TLR4受体之间的相互作用在肠上皮细胞,使肠道损伤的程度在NEC的发病机制。他们证明NOD2激活以及表达NOD2蛋白质本身的限制的程度在肠上皮细胞TLR4信号。这种机制TLR4的链接激活细胞死亡,可以受到NOD2活动(8]。

虾青素是类胡萝卜素中发现螃蟹、藻类、和许多其他海产品。今天大多数的天然虾青素是来源于链球菌肝病杂志,这是比合成虾青素更稳定。由于其强大的抗氧化性能的影响,抗疲劳,抗炎症和免疫调节、天然虾青素是很受欢迎的功能食品行业(9- - - - - -12]。虾青素对一个函数以减少炎症和改善肝脏病小鼠的肠道微生物群。此外,该研究报告说,喂老鼠astaxanthin-rich酵母21天抗体表达增加断奶小鼠空肠和回肠(13]。此外,在盲肠损伤和炎症的小鼠,虾青素调节盲肠的微生物群的多样性和TLR4信号通路(14]。在结肠炎Sequence-targeted虾青素纳米颗粒可以显著减轻炎症调节TLR4信号通路(15]。然而,目前尚不清楚虾青素如何施加影响肠道功能NEC。

因此,在我们的研究中,我们假设虾青素可以减弱肠损伤大鼠模型,通过增加NOD2 NEC,抑制TLR4信号通路对氧化压力,抗炎,抗凋亡作用。

2。材料和方法

2.1。动物治疗和组织管理

浙江Eyong制药研发中心的动物中心伦理委员会批准了动物研究。动物使用许可证号码:SYXK(哲)2021 - 0033。Sprague-Dawley (SD)老鼠购自浙江Weitong利华国际实验动物科技有限公司有限公司,动物没有生产许可证:SCXK(哲)2019 - 0001。怀孕的第14天,剖腹产手术是在老鼠上执行删除早产SD大鼠,男性和女性。

老鼠被分为三组:正常组、NEC集团和NEC +虾青素组( 在每组)。正如之前报道的(16),新生儿在出生2小时治疗SD大鼠与人工喂养和刺激与NEC在缺氧条件下冷模型。胃内的管理新生大鼠鼠牛奶替代品用于饲料。之后,老鼠随后受到100%氮缺氧2分钟,其次是10分钟的刺激与冷条件在4°C 3天(每天两次)。它被认为是一个成功的NEC模型当老鼠显示排泄的黄绿色粘液在不同程度和其他NEC临床症状。虾青素(Sigma-Aldrich;默克公司)在橄榄油和牛奶混合是由胃内的一天两次的60毫克/公斤/天填喂法与NEC在NEC +虾青素组大鼠4天。

基于之前的实验中,我们添加了NEC +随后,虾青素是由胃内的连续4天每天两次(60毫克/公斤)NEC老鼠。NOD2抑制剂(NOD-IN-1 hy - 100691, MedChemExpress公司)13.8毫克/公斤在大鼠腹腔注射前3天每天一次接触NEC根据前面的研究(17]。随后,虾青素连续4天每天两次(60毫克/公斤)是由胃内的NEC老鼠。

2.2。样品收集

有限公司₂吸入被用来使安乐死所有大鼠建模后的第六天。后肠组织从十二指肠到肛门被移除,1厘米肠近端回盲肠的样本收集。末端回肠组织也石蜡包埋,水洗,固定,切成5串行部分μ为进一步研究米厚。

2.3。TUNEL染色

Deparaffinized组织部分孵化了蛋白酶K (G1205 Servicebio)湿室等15分钟,然后孵化和部分和3%的H₂O₂10分钟和末端转移酶(TdT) (G1507 Servicebio)标签缓冲区在37°C 1小时。然后添加辣根过氧化物酶(合)标记链霉亲和素(Streptavidin-HRP) 37°C 30分钟。最后,合的催化下,凋亡细胞被3显示,3′-Diaminobenzidine (DAB)的颜色,和凋亡细胞被普通光学显微镜观察和统计。计算出的阳性细胞率TUNEL-positive细胞的数量/总细胞视野。

2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定

血液是离心机在3500 r / min 15分钟,上层清液。Interleukin-1β(il - 1β)(mm - 0047 - r1)、白介素6 (il - 6) (mm - 0190 r2)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)(mm - 0180 r2)和巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) (mm - 0099 r2) ELISA试剂盒(Meimian、江苏、中国)应用于评估il - 1的水平β、il - 6、TNF -α,MCP-1血清。

和肠道组织迅速被进一步ELISA试验,血迹是用生理盐水洗净在4°C。纯净水是滤纸吸收,和100毫克的肠道组织匀浆是削减10%。总蛋白浓度测定用bicinchoninic酸(BCA)方法。丙二醛(MDA)(建成,A003-1-2)和超氧化物歧化酶(SOD)的建成,A001-3-2肠道组织进行测试后,制造商的指示。最后,光密度的ELISA酶标使用微型板块读者阅读在450海里。

2.5。Hematoxylin-Eosin(圆))染色

肠道组织被梯度乙醇脱水,二甲苯,然后沉浸在蜡。组织是贴在抗剥落幻灯片。片被烤在60°C 12小时,由二甲苯脱蜡、水化和梯度乙醇,沾染了苏木精和伊红染色(Servicebio G1003)。最后,与低到高的浓度加入乙醇脱水。玻璃化由二甲苯和切片与中性密封胶,随后,切片的数据捕获和尼康Eclipse高达。

炎性细胞浸润的面积对病变的程度。没有炎症和损伤评分0;少量炎症细胞浸润,病变入侵和黏膜下层得分1;明显的炎性细胞浸润,病变侵犯到肌肉层,可见休会破坏得分2;明显的炎性细胞浸润,病变侵犯到肌肉层,和明显的销毁休会得分3;大量的炎症细胞渗透,病变入侵浆液性层,和隐窝上皮破坏得分4。

2.6。免疫荧光染色

肠道组织制成石蜡切片,用二甲苯脱蜡,然后用高到低浓度乙醇先后添加补充水分的组织,和抗原修复解决方案增加了,然后被孵化的部分5% BSA (G5001 SERVICEBIO), 0.2% Triton x - 100和PBS (G0002 SERVICEBIO) permeabilize组织部分。之后,部分被孵化的伯灵顿(AF0120 1: 200年,亲和力)和bcl - 2 (AF6139 1: 200年,亲和力)一夜之间在4°C,然后用山羊孵化Anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L) Fluor488-conjugated (S0018亲和力)在室温为0.5小时。然后冲走了抗体,DAPI (G1012 SERVICEBIO)添加到染色细胞的核。尼康的ECLIPSE C1是用来观察和拍照。ImageJ软件被用来分析伯灵顿和bcl - 2蛋白荧光强度。

2.7。免疫组织化学(包含IHC)测定

准备的肠道组织的石蜡切片和二甲苯脱蜡,然后用高到低浓度乙醇先后添加补充水分的组织,和抗原修复解决方案是补充道,然后与过氧化氢的部分被洗阻断内源性过氧化物酶,与牛血清后密封,一夜之间和孵化与转变增长半胱天冬酶3 (DF6020亲和力),在4°C。第二天,相应的二次抗体合孵化。轻拍(SERVICEBIO G1212)补充道。民建联的积极表达褐黄色,细胞核被苏木精染色。最后,较低的乙醇浓度高了脱水,二甲苯玻璃化,与中性香脂片被添加。半胱天冬酶3计算的平均密度的视野,和ImageJ软件被用来处理数据。

2.8。免疫印迹

纯从肠道组织中提取的蛋白质被削减,均质裂解缓冲,和离心机。和上层清液(蛋白质)离心后用BCA试剂盒测量(PC0020 Solarbio)。总蛋白质是由电泳分离,和相应的蛋白质被转移到膜。非特异性抗原被5%的牛奶,蛋白质是孵化与目标抗体TNF -α(AF7014),伊诺(AF0199),核因子-κB (NF -κB) (AF5006), B细胞lymphoma-2 (bcl - 2) (AF6139) Bcl-2-associated X(伯灵顿)(AF0120) NOD2 (DF12125), TLR4 (AF7017) MyD88 (AF5195),β肌动蛋白(AF7018)所有关联公司。在4°C 14 - 16小时,孵化后的抗体洗,蛋白质是抗体与相应的二次孵化(Anti-rabbit免疫球蛋白,HRP-linked抗体,春秋国旅,7074)。最后,图摄于增强化学发光成像(ECL)。ImageJ软件用于计算的光学密度靶蛋白,和β肌动蛋白作为内部参考。

2.9。统计分析

美国IBM SPSS软件(16.0)被用来分析数据。当多个组中的数据符合正态分布和方差齐性检验,单向方差分析(方差分析)进行了测试,另外,图基测试是用于进一步两两对比组。分布时正常,但方差不是制服,Dunnett T3测试或独立的样本t以及使用。不符合正态分布时,克鲁斯卡尔-沃利斯H测试使用。的显著性水平 。数据平均值±标准偏差。统计显著性水平的定义 。

3所示。结果

3.1。虾青素减轻肠道组织病理改变的NEC老鼠

明确虾青素是否可以缓解肠道组织病理改变的NEC老鼠,我们进行了他在每组染色。作为显示在图1(一),在对照组大鼠小肠的结构基本上是正常的,,层次清楚。与对照组相比,NEC组显示明显的炎性细胞浸润,病变侵犯浆膜层,和隐窝上皮被毁。虾青素的干扰,病变的严重程度NEC老鼠与NEC组相比降低了。更重要的是,他在NEC的半定量评分+虾青素组相比显著降低NEC老鼠(图1(一), )。

3.2。虾青素抑制il - 6的表达,il - 1β肿瘤坏死因子-α,MCP-1血清

探讨血清中虾青素是否能抑制炎症反应,NEC诱导的大鼠,ELISA试剂盒用于检测il - 6的水平,il - 1β肿瘤坏死因子-α,MCP-1。作为显示在图1 (b)刺激后,结果证实,NEC,水平的il - 6、il - 1β肿瘤坏死因子-α在血清,MCP-1相比显著增加控制大鼠( )。对我们的期望,虾青素抑制il - 6的表达,il - 1β肿瘤坏死因子-α,相对于NEC MCP-1集团( )。

3.3。虾青素抑制MDA在强化肠道组织的SOD表达式NEC老鼠

ELISA试剂盒,我们测试了氧化应激的指标,包括MDA和SOD。作为显示在图1 (c),我们发现MDA在NEC大鼠肠道组织的表达高于控制老鼠,而肠道组织的SOD水平是低NEC老鼠相比控制大鼠( )。虾青素的治疗,肠组织的MDA含量降低与NEC组相比,相反,肠组织的SOD含量增强( )。

3.4。虾青素保护肠道组织的细胞凋亡NEC老鼠

所示的数字2(一个),2 (b),2 (c),2 (d)和数字3(一个),3 (b),3 (c),3 (d),包含IHC TUNEL和免疫荧光染色,更积极的细胞凋亡的特征和更积极的表达高半胱天冬酶3和伯灵顿的荧光强度,而少bcl - 2荧光强度被发现NEC老鼠的小肠组织相对于对照组( 或 )。虾青素的刺激,有较低的阳性细胞率与凋亡特征,少半胱天冬酶3-positive染色,荧光强度减少的伯灵顿虽然bcl - 2肠组织的高荧光强度被发现比NEC集团( )。

3.5。虾青素抑制肠道组织的炎症,Apoptosis-Related蛋白质NEC老鼠

在数据4(一),4 (b),4 (c),4 (d),我们发现炎症和apoptosis-related蛋白的表达在大鼠肠道组织免疫印迹分析。结果表明,NEC老鼠肿瘤坏死因子的高表达α伊诺,NF -κB,伯灵顿,TLR4比控制大鼠小肠组织( 或 )。此外,与NEC组相比,肿瘤坏死因子的蛋白表达水平α伊诺,NF -κB,伯灵顿,TLR4明显减少,和bcl - 2蛋白表达水平的NOD2 NEC +虾青素组显著增加( 或 )。

3.6。NOD2抑制剂抵消虾青素的保护作用在NEC大鼠肠道组织的病理变化

如图5(一个)在NEC组和NEC +虾青素+ NOD2抑制剂组,炎性细胞浸润,地下室,绒毛,和其他组织结构被毁,损失严重。与NEC组相比,NEC +虾青素组显示减少肠道病变损伤的程度。在图5 (b)与NEC组相比,他的肠道组织的老鼠在NEC +虾青素组显著减少( )。和他的肠道组织NEC +虾青素+ NOD2抑制剂组明显高于NEC +虾青素组( )。

3.7。NOD2抑制剂抵消虾青素的保护作用减少凋亡细胞的肠道组织NEC老鼠

所示的数字5 (c)和5 (d)TUNEL染色,虾青素的比例减少肠道组织的阳性细胞率相对于NEC老鼠( )。然而,这一趋势逆转的肠道组织除了NOD2抑制剂的NEC +虾青素大鼠( )。

3.8。虾青素通过激活NOD2发挥保护作用和抑制TLR4信号通路在NEC大鼠肠道组织

在数据6(一)和6 (b)免疫印迹被用来测试NOD2和TLR4的表达pathway-related蛋白质。结果表明,NEC +虾青素组的表达NOD2加强,而TLR4的表达,NF -κB, MyD88压制在肠道组织相对于NEC老鼠( )。后添加NOD2抑制剂NEC +虾青素组,NOD2表达式在肠道组织中减少但TLR4的表达,NF -κB,在肠道组织MyD88升高相对于NEC +虾青素组( 或 )。

4所示。讨论

NEC是新生儿胃肠道疾病,炎症和细菌的入侵,导致严重的新生儿发病率和死亡率(18]。据报道,虾青素是类胡萝卜素具有较强的抗氧化和抗炎活动(19]。目前的研究表明,虾青素减少氧化应激、炎症反应、细胞凋亡在NEC老鼠通过增强NOD2抑制TLR4途径。

通过不饱和脂质过氧化反应,导致肠道缺氧/复氧损伤、氧化应激与NEC的病理生理学20.]。然而,多亏了虾青素的亲脂性的特点,它使细胞穿透双层膜,实现它的抗氧化作用。研究发现,虾青素变弱从氧化应激障碍严重的疾病21- - - - - -23]。本研究证明了虾青素表达下调MDA降低氧化应激,但移植肠组织的SOD水平,从而导致了对新生大鼠肠道损伤NEC减轻影响。

此外,炎症在NEC的发展是至关重要的。细胞因子在炎症导致NEC的粘膜损伤上升(24]。TNF-expression增加有关趋化因子和细胞因子的生产在NEC患者的肠道25,26]。符合之前的研究中,我们发现,在NEC的老鼠,出现炎症细胞因子,如TNF -的高程α,进气阀打开,等等。然而,我们发现,虾青素NEC老鼠成功抑制炎症反应。除此之外,NEC的特点是广泛的肠道上皮细胞坏死和细胞凋亡(27,28]。在我们的研究中,用TUNEL染色,我们发现虾青素能保护细胞免受细胞凋亡。此外,伯灵顿的表情和Caspase3少生产虾青素治疗后,而更多的bcl - 2是NEC大鼠肠道组织中产生,表明虾青素对NEC大鼠的保护作用。Akduman et al。29日)宣布,虾青素能够减少肠道损伤的程度NEC由于其抗炎,抗氧化剂和其他有益的作用,,这与我们的研究是相一致的。

最重要的是,在我们的研究中,虾青素调节NOD2的表达,NEC老鼠中表达降低,与此同时,它表达下调TLR4的表达,NF-kB, MyD88。根据前面研究的理查森et al。8),他们透露,NOD2抑制TLR4信号在肠道上皮细胞在活的有机体内和在体外较低的实验NOD2 TLR4受体,这就可以解释的变化NOD2和TLR4在NEC老鼠在我们的研究中。我们发现保护作用抵消了NOD2抑制剂添加更糟糕的肠道组织的病变和更多的凋亡细胞,进一步证实了虾青素的表达增强NOD2抑制TLR4信号通路发挥作用在NEC的老鼠。虾青素的可能的解释的交互NOD2 TLR4受体是虾青素激活NOD2可能导致炎症的激活在肠上皮细胞囊泡,从而报警主机入侵的存在通过建立促炎症反应,同时限制TLR4通路的程度。此外,它有效地防止进一步的细菌进入,同时限制TLR4-induced肠道损伤的影响(30.]。

在这项研究中,虾青素可以减少肠道组织损伤的治疗新生儿NEC老鼠通过减轻氧化应激、炎症反应和细胞凋亡。然而,内部NOD2之间的串扰和TLR4需要进一步探索和细胞实验验证astaxanthin-specific功效在NEC的预防和治疗是必要的。

5。结论

总之,虾青素改善肠道组织的病理损害NEC老鼠,通过减少氧化应激较低的MDA但较高的SOD水平,保护细胞免受细胞凋亡NEC新生儿肠组织的老鼠。此外,抑制炎症反应,减少肿瘤坏死因子-α,进气阀打开,TLR4 NF -κB, MyD88产生,但增强NOD2表达式。NOD2抑制剂抵消NEC的虾青素大鼠的保护作用。虾青素缓解氧化应激、炎症反应和细胞凋亡在新生儿NEC老鼠提高NOD2和抑制TLR4通路。

缩写

NEC公司:	坏死性小肠结肠炎
SOD:	超氧化物歧化酶
MDA:	丙二醛
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
il - 1β:	Interleukin-1β
il - 6:	白介素- 6
MCP-1:	巨噬细胞化学引诱物蛋白1
伊诺:	诱导一氧化氮合酶
NF -κB:	核因子-κB
bcl - 2:	b细胞lymphoma-2
伯灵顿:	Bcl-2-associated X
TLR4:	toll样受体4
NOD2:	Nucleotide-binding寡聚化域2
ELISA:	酶联免疫吸附试验
):	Hematoxylin-eosin
包含IHC:	免疫组织化学。

数据可用性

来自本研究的数据可以从合作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。