DDIT4在胰腺癌中的新突变

摘要

胰腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。本研究旨在寻找胰腺癌DNA损伤诱导转录本4 (DNA damage-inducible transcript 4, DDIT4)及其信号通路中可能发生的基因突变及新基因突变的价值。采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增胰腺导管腺癌患者DDIT4的DNA序列。此外，我们采用免疫组化方法检测不同类型基因突变的胰腺癌患者中DDIT4的表达水平。采用双标记免疫荧光法研究DDIT4/LC3的表达水平及其可能的相关性。我们的工作表明在DDIT4 mRNA 3中有两个新的稳定基因突变 -翻译区(m.990A和m.1246 U >C > U)。13个样本中发现了DDIT4 3突变 -未翻译区(UTR)。为了进一步验证基因突变对蛋白表达的影响，我们对不同基因突变类型进行免疫组化，发现DDIT4表达与基因突变存在相关性，并伴有核染色加深。为了进一步探讨DDIT4基因突变的临床价值，免疫荧光提示DDIT4与LC3同时表达;因此，我们推测DDIT4突变可能参与了胰腺癌细胞的自噬。在这项研究中，我们发现3 -DDIT4的UTR区域，可能与胰腺癌组织中DDIT4的表达和肿瘤自噬有关。

1.介绍

胰腺癌在美国最常见的癌症死亡原因中排名第四。胰腺癌患者的5年相对生存率只有9% [1]．根据世界卫生组织(WHO)的研究，2014年欧洲因胰腺癌死亡的观察人数为82901人[2]．尽管传统疗法取得了进展，但在过去30年里，存活率几乎没有改善[3.]．许多胰腺导管腺癌(PDAC)患者要么对放疗产生固有抗性，要么产生获得性抗性[4]．SMAD4突变通过促进自噬使胰腺癌对放疗产生抗性[5]．然而，基因突变的潜在作用尚未完全阐明，自噬相关基因的突变将是一个巨大的宝藏。

体细胞和生殖系基因突变是胰腺癌发生的重要原因，而特殊的基因是杀死癌细胞的新靶点。Wood等总结了24个散发基因突变，其中常见基因突变(KRAS、CDKN2A、TP53、SMAD4、GNAS、RNF43)患病率超过20% [6]．胰腺癌患者对放疗耐药的基因突变[5]，而自噬与对恶劣微环境的适应有关[7]．结合我们之前的RNA高通量测序结果显示自噬相关蛋白显著上调表达，DDIT4是一种在基因突变领域尚不为人知的新蛋白。

DNA损伤诱导转录本4 (DDIT4)可由多种应激条件诱导，包括氧化应激[8，内质网应激[2，以及缺氧[6]．DDIT4通过稳定结节硬化复合物2抑制雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶点[9]．DDIT4参与了癌细胞生存相关的自噬，并影响了肺癌的靶向治疗[10]．DDIT4还与自噬和干性有关，这与多形性胶质母细胞瘤患者的替莫唑胺耐药和预后不良有关[11]．高水平的DDIT4/TXNIP氧化复合物调节ROS并抑制ATG4B的活性以控制应激诱导的自噬[12]．因此，在严酷的肿瘤微环境的选择下，具有某种类型基因突变的胰腺癌细胞的生存能力是一个有趣的问题。

我们推测DDIT4基因突变可能与胰腺癌细胞适应抗肿瘤治疗和恶劣微环境有关。在机制上，DDIT4基因突变和表达水平可能影响自噬体的形成，这将有助于PDAC的生存。

2.方法

2．1．患者招募和数据收集

2018 - 2019年福建省医科大学第一附属医院胰腺肿瘤患者。根据病理结果，我们将纳入的患者分别设为实验组和对照组。实验组为经病理证实PDAC诊断的患者组。对照组为无PDAC的胰腺肿瘤患者。入选标准如下。(1)患者临床资料及随访资料完整。(2)患者签署知情同意书。有任何合并症或既往恶性肿瘤的患者被排除在研究之外。收集胰腺癌患者的相关信息，包括年龄、性别、TMN分期、手术方式、预后、化疗方案、病理分级、影像学特征、肿瘤标志物水平(表)1)．本研究经福建医科大学第一附属医院伦理与研究委员会批准。


不。	性别	阶段	手术方法	结果	化疗方案	病理	图像特征	肿瘤标记物

1	女	IIB (pT2N1M0)	根治性胰十二指肠	辅助治疗	周期	中度分化腺癌		HER2 (0) P53 (+ 70%), MUC6 (-), MUC2 (-), MUC1 (+), CDX2 (-), MUC5A (+), SATB2 (-), CK20 (-), CK7 (+), CK19 (+), CD34 (+)
2	女	IB (pT2N0M0)	部分胰切除术伴十二指肠保留	辅助治疗	未知的	固体pseudopapilloma		β连环蛋白(+),vim (+), CK (-), CD10 (+), syn (-), EMA(-)、CEA (+), CDX2(-),法新社(-),CK (-), CK8/18 (-), WT-1 (-), MUC1 (-), MUC5A (-)
3.	男性	花絮(T3N0M0)	根治性胰十二指肠	肝转移	周期;周期	中度分化腺癌		P53 (+), HER2 (1 +), ki - 67 (+ 80%), MUC1 (+), MUC2 (-), MUC5 (-), MUC6 (-)
4	女	iii a (pT4N0M0)	部分胰腺切除术	腹部多发转移(淋巴结、腹壁)	因为一般情况不好没有接受化疗	中度分化腺癌		MUC2 MUC1 (+) (-), MUC5 (+), MUC6 (-), CK7 (+), CK20 (+), CDX2 (+), ki - 67 (+ 60%), P53 (+ 70%), HER2 (+)
5	男性	iii a (pT4N0M0)	部分胰腺切除术	败血性休克和死亡	空	中度分化腺癌		空
6	男性	三世(pT1N2M0)	部分胰切除术伴十二指肠保留	局部复发及肝转移	周期;周期	中度分化腺癌		MUC5 CK7 (+) (+), MUC1 (+), CK20 (-), MUC2 (-), CK8/18 (+), CK19 (+), EMA (+), CA199 (+), ki - 67 (+ 10%)
7	男性	第四(pT2n1m1)	根治性胰十二指肠	辅助治疗	周期	中度分化腺癌		CK7 MUC1 (+) (+), MUC5 (+), CK20 (+), SMAD4 (+), MUC2 (-), P53 (+ 80%), HER2 (1 +), ki - 67 (+ 40%), CDX2 (+)
8	女	IIB (pT3N1M0)	根治性胰十二指肠	辅助治疗	周期周期周期	低分化腺癌		CK7 CK20 (+) (+), MUC5 (+), MUC1 (+), CK818 (+), CK19 (+), EMA (+), CA199 (+), ki - 67 (10%), MUC2 (-), D2-40 (+), CD34 (+)

2．2．基因型分析

胰腺肿瘤组织及邻近健康组织标本用液氮采集，-80°C保存。采用TIANamp组织DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司)从胰腺癌组织和对照组织中提取和存储DNA。扩增全长DDIT4，纯化后进行凝胶电泳。多组测序由生工生物技术有限公司进行分析。PCR的正向引物为5 -GTTCGCACACCCATTCAA-3 ，反过来是5 -GCATAGGTCTTAATACTTGAACAT-3 ．PCR条件为初始变性步骤，使用ABI PRISM 7700测序仪(PerkinElmer, Inc.)进行基因测序。

2．3.免疫组化和H&E染色

采用胰腺癌患者胰腺组织进行苏木精伊红染色和免疫组化。dit4抗体来自台湾新竹Arigo生物实验室。所有石蜡包埋的胰腺组织均制成八微米切片。用DDIT4 (DNA损伤诱导转录本4)单克隆抗体对载玻片进行免疫标记。根据制造商的指南，使用自动免疫组化染色器进行免疫组化。用磷酸盐缓冲盐水替代一抗作为阴性对照。

２.４.免疫荧光

取胰腺组织用4%多聚甲醛固定，并做病理切片。切片被渗透，非特异性结合被阻断。LC3和dit4特异性单克隆抗体孵育，室温应用二抗2小时，DAPI染色细胞核。染色后半小时用荧光倒置显微镜拍照。我们的免疫荧光成像使用相同的曝光时间。

2．5．统计数据

组间的统计差异由非参数Mann-Whitney评估对两组进行Kruskal-Wallis检验，对两组以上进行Kruskal-Wallis检验。斯皮尔曼秩相关系数估计了两个变量之间的关联程度。显著性在由GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA)设计。数据以具有标准差(SD)的平均值表示，以频数和百分比表示分类值。被认为是显著的。所有数据使用SPSS统计软件26版进行分析。

3.结果

3．1.DDIT4 mRNA的两种新基因突变

DDIT4是细胞自噬信号的关键分子，自噬可以防止癌细胞在恶劣的微环境中死亡。本研究采用回顾性病例对照研究方法，探讨胰腺癌组织中基因突变位点之间的相关性分析。我们对15个胰腺组织进行了测序，以确定入组患者的DDIT4基因突变(见表)2)．最佳配对序列为NCBI中Homo sapiens DNA damage-inducible transcript 4 (DDIT4)， mRNA (LOCUS: NM_019058)，符合前期实验设计。突变位点为m.990A和m.1246 U >C>U，我们在两个基因位点上都发现了三种基因类型(图1(一)和1 (b))．根据NCBI数据，我们发现这两个突变位点位于DDIT4 mRNA外显子3，部分为3 -基因的UTR(图1 (d))．


	性别	组织类型	病理类型	mRNA.990	mRNA.1246

1	女	癌变	中度分化腺癌	T >	C > T
2	女	Paracancerous	- - - - - -	T >	C > T
3.	女	癌变	固体pseudopapilloma	N	N
4	女	Paracancerous	- - - - - -	N	N
5	男性	癌变	中度分化腺癌	N	N
6	男性	Paracancerous	- - - - - -	N	N
7	女	癌变	中度分化腺癌	T >	C > T
8	女	Paracancerous	- - - - - -	T >	C > T
9	男性	癌变	中度分化腺癌	N	C > T
10	男性	Paracancerous	- - - - - -	N	C > T
11	男性	癌变	低分化腺癌	T	C
12	男性	Paracancerous	- - - - - -	T	C
13	男性	癌变	低分化腺癌	N	C > T
14	男性	Paracancerous	- - - - - -	N	C > T
15	女	癌变	低分化腺癌	T	N

(一)

(b)

(c)

(d)

3．2．表达水平与蛋白定位的关系 -DDIT4的UTR突变类型

DDIT4与肿瘤进展相关，影响卵巢癌患者的预后[13]．为了探讨DDIT4与胰腺病理分级的关系，我们对胰腺组织进行免疫组化。我们的研究结果表明，与中分化腺癌、高分化腺癌、假乳头状瘤等其他胰腺癌病理类型相比，DDIT4在低分化腺癌中表达水平较高。×400视野下，细胞核和细胞质中DDIT4水平均显著升高。低分化腺癌中DDIT4高表达的潜在机制可能与突变有关(图)2(一个))．为了进一步阐明三者之间的相关性 -UTR突变和DDIT4表达水平，我们对胰腺肿瘤组织进行免疫组化，包括两种类型的基因突变的几种组合。然后，我们建立四个组(组1:990.T;1246.C;组2:990. n, 1246. n;第三组:990. n; 1246. t;4组:990.T>A;1246.C>T)，我们的结果提示4组表达水平最高(图4)2 (b))，其次为2组和3组，4组表达水平最低。通过对结果的分析，我们认为DDIT4和3 -UTR基因突变可能与蛋白表达水平有关。在×400视野下，DDIT4主要位于细胞质中，在细胞核中加深。

(一)

(b)

图2

DDIT4水平及基因突变/病理分级。(a)免疫组化显示低分化腺癌组织、中分化腺癌组织、实性假乳头状瘤组织中DDIT4表达高于癌旁正常组织。(b) DDIT4 3的水平增加 -UTR基因突变(990.T>A;1246.C>T)与无基因突变的胰腺癌组织比较。DDIT4在细胞核和细胞质中的表达量均增加。

3．3.胰腺癌中DDIT4/LC3信号通路的激活

既往文献提示DDIT4与肿瘤细胞自噬密切相关[11]．为进一步阐明胰腺癌组织中DDIT4表达水平与自噬的相关性，我们对胰腺癌组织进行免疫荧光，证实LC3和DDIT4在胰腺癌组织中同时表达量显著高于对照组(DDIT4低表达)。我们发现LC3和DDIT4的表达是同步的(图3.)．

3．4．DDIT4在胰腺癌中的应用前景

根据我们的实验结果和相关文献，我们总结了DDIT4 3之间的关系 -UTR突变与胰腺癌。胰腺癌细胞中DDIT4基因突变导致DDIT4 3碱点突变 -并可能影响其生物学功能所涉及的蛋白质定位。位于线粒体中的DDIT4/TXNIP复合物促进ROS的表达，抑制ATG4B的去磷酸化能力。促进LC3表达量的增加和自噬的激活。DDIT4基因突变可能通过在胰腺肿瘤细胞中异常的蛋白定位而导致抗肿瘤耐药(图)4)．

4.讨论

我们的文章发现了3个新的基因突变 -PDAC中DDIT4 mRNA的非翻译区。同时，我们发现DDIT4的表达水平与基因突变类型存在相关性，且在胰腺癌中DDIT4与LC3明显并存。本文表明这两个新基因在3 -DDIT4 mRNA的非翻译区可能是胰腺癌的新靶点。

我们在DDIT4 mRNA 3中发现了两种类型的稳定突变 -和在3 -UTR是microRNA结合位点[14]．一个基因突变导致CCND1过早的聚腺苷酸化信号缩短了它的3 -并增加淋巴瘤的风险[15]．结合我们的研究结果，microRNA可能与胰腺癌中DDIT4的功能密切相关。既往文献揭示miR-221通过DDIT4的失调参与肝癌的发生[16]．同时，miR-221通过精确调控DDIT4的表达，在人胎盘发育中发挥重要作用[17]．还有其他一些miRNA参与了DDIT4的表达，如miR-495 [18], miR-30c [19和miR-630 [20.]．综上所述，DDIT4在3中存在基因突变 -胰腺癌组织中的UTR，可能与microRNA的结合位点有关，影响DDIT4的表达水平和定位。

DDIT4的表达水平受到多种因素的调控，如缺氧[21，电离辐射[22，能源消耗[23和内质网应激[24]．我们的结果与之前关于卵巢癌病理分级与蛋白水平关系的研究一致[13]．恶性肿瘤分化程度低可能与基因突变率高有关。我们的论文发现了DDIT4 3之间的相关性 -UTR基因突变与DDIT4。基因突变是肿瘤最重要的特征，基因突变的积累会导致癌细胞的异常行为[25]．DDIT4 3 -UTR基因突变可能通过影响DDIT4与microRNA的结合而影响蛋白质的定位和降解。

DDIT4与LC3共定位表明DDIT4在胰腺癌组织中高表达，其表达参与了自噬。DDIT4信号通路与参与替莫唑胺耐药的自噬和多形性胶质母细胞瘤患者的不良预后有关[11]．ATF4-DDIT4-mTORC1轴通过激活自噬信号通路抑制癌症治疗，而与SIRT1/2抑制剂和药物自噬抑制剂联合治疗是一种有效的肺癌治疗策略[10]．DDIT4基因突变 -UTR通过调节DDIT4的表达水平来影响自噬。

DDIT4的高表达不仅促进胰腺癌肿瘤细胞自噬的增加，还可能通过抑制肿瘤周围免疫细胞的功能参与肿瘤耐药[26]．同时，免疫细胞功能的异常也与胰腺癌的肿瘤耐药有关。DDIT4增强内毒素血症小鼠的血管炎症和通透性，导致免疫细胞浸润、全身炎症、caspase-3活化和凋亡[27]．DDIT4与IL-10或缺氧诱导巨噬细胞线粒体活性氧水平低有关[28，抑制巨噬细胞的免疫功能。肥大细胞激活的癌相关成纤维细胞(CAFs)和转化生长因子-β信号传导与胰腺癌对吉西他滨/纳巴axel的耐药性有关[29]．一种针对Wnt的治疗策略增强了胰腺癌细胞毒性并恢复了结节性阳性疾病患者的抗癌免疫[30.]．

肿瘤的异质性最终与肿瘤与微环境长期共同发展后的耐药有关，耐药基因的突变是有利于肿瘤生存的必然结果。DDIT4的UTR突变通过调节DDIT4的表达参与胰腺癌细胞的自噬，可能是化疗耐药和预后不良的潜在生物标志物。胰腺癌中ADAM28的过表达与吉西他滨耐药的调控密切相关，因此它是胰腺癌中新的预后生物标志物[31]．miR-155-5p高表达与吉西他滨治疗的PDAC患者化疗耐药和预后不良直接相关[32]．自噬相关基因DDIT4的突变和较高的蛋白表达水平具有重要意义。在未来，我们可以通过检测胰腺癌患者血样中DDIT4的突变水平来监测组织中DDIT4的突变水平，从而实现对化疗耐药和不良预后的有效评估。

本文有一些局限性。胰腺癌患者的生存时间非常短，难以进行队列研究。因此，本研究采用回顾性病例对照研究的方法，探讨基因突变位点与肿瘤自身依赖性的相关性分析，为今后的化疗耐药和预后提供新的靶点。本文只是通过对多个肿瘤样本中DDIT4基因突变的综合分析，在一定时间点捕捉到肿瘤组织，但证据是间接的。在未来，如果我们有幸得到同一个肿瘤患者在多个时间点的组织或血液样本，我们可以直接观察肿瘤进展过程中的基因突变。

5.结论

在这项研究中，我们发现3 -DDIT4的UTR区域，可能与胰腺癌组织中DDIT4的表达和肿瘤自噬有关，进一步的机制研究还需要进一步的研究。

数据可用性

可根据作者的要求提供数据。

伦理批准

所有人体实验均经福建医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

的利益冲突

作者声明在本文的研究、作者身份和/或出版方面没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

陈幼婷、高峰构思设计了实验。丁发电、洪小平负责文章的撰写和整体进度。黄世荣、范向群和连伟进行了实验。陈星婷，向群，刘奇才对实验结果进行了分析和解释。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(no . 81572442)、福建省妇幼保健院基金项目(no . YCXM19-28)和福建省自然科学基金项目(no . 2020J01961)资助。这些资金来源对样本采集、患者样本分子分析和生物信息学分析起到了关键的支持作用。

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胃肠病学研究与实践

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