环状RNA CDR1as通过靶向miR-876-5p/GNG7轴抑制胃癌转移

摘要

已经证明圆形RNA CDR1As作为miRNA海绵作为各种癌症进展。CDR1As对胃癌（GC）转移的确切潜在机制仍然未知。在这里，我们发现CDR1As敲低促进的GC细胞迁移和侵袭，而其过度表达抑制GC细胞的迁移和侵袭能力在体外和体内．此外，CDR1AS下调上皮 - 间充质转换 - （EMT-）相关蛋白和MMP2和MMP2和MMP2。生物信息学分析与双荧光素酶报告基因测定，蛋白质印迹，RT-qPCR分析和功能救援实验表明，CDR1AS用作MIR-876-5P海绵，并上调靶基因GNG7表达以抑制GC转移。总之，我们的研究结果表明CDR1AS通过CDR1AS / MIR-876-5P / GNG7轴抑制GC转移。

1.介绍

胃癌（GC）是全世界癌症相关死亡的第三次常见原因[1]。远距离转移是主要原因之一，因为GC细胞易于通过淋巴结或血液侵入周围的器官或远处组织[2]。然而，GC转移的确切潜在机制仍远未清除。作为转移性GC的标准治疗，化疗和放射治疗已显示出改善生活质量和延长患者的生存时间，但副作用包括耐药性和全身性细胞毒性，使GC患者的五年生存率仍然非常低[3.]。因此，迫切需要揭示胃癌转移的分子机制，探索胃癌治疗的新靶点。

环状RNA (circRNAs)是一种新型的共价闭合非编码RNA。它们具有稳定的圆形结构、高丰度和组织特异性，可作为各种人类疾病的关键调控因子。circrna通过与mirna或其他分子结合，可以在转录、转录后和翻译水平上调节基因表达，使其成为新的潜在治疗靶点[4]。源自小脑退化相关抗原1（CDR1）基因的Circrna CDR1as已被鉴定为在包括阿尔茨海默病的许多疾病中的miR-7海绵[5，心肌梗塞[6]，骨关节炎[7]以及多种癌症，包括肝癌，非小细胞肺癌和鼻咽癌[8- - - - - -10.]。此外，CDR1AS参与不同机制的肿瘤转移。例如，CDR1AS充当MIR-135B-5P海绵并上调HIF1AN以抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移[11.]。IGF2BP3介导的CDR1AS表观遗传沉默促进黑素瘤中的侵袭和转移[12.]。然而，CDR1as在GC转移中的作用和分子机制仍未被发现。

在这项研究中，我们观察到CDR1AS对GC细胞迁移和侵袭的抑制作用，并确定MIR-876-5P作为调节GNG7表达的CDR1As的靶miRNA，这表示CDR1AS调节GC转移的新机制，并提供潜在的治疗目标对于GC。

2.材料和方法

2．1.细胞系与培养

胚胎肾细胞293T和人胃癌细胞系（SGC-7901，BGC-823，MKN-45，HGC-27，MGC-803和AGS）从细胞库，中国中国科学院（上海，中国）获得．MKN-45，MGC-803和293T细胞在高葡萄糖Dulbecco的改性Eagle的媒介（DMEM; Gibco，Thermo Fishific，USA）中培养。HGC-27，BGC-823和SGC-7901细胞保持在RPMI-1640培养基（Bioind，以色列）中。AGS细胞在DMEM / F-12培养基（Bioind，以色列）中生长。上述培养基含有10％胎牛血清（FBS; Bovogen，澳大利亚）。所有细胞均为潮湿的气氛，有5％的CO₂在37°C，并定期检测无支原体污染。

2.2。RNA提取和实时逆转录定量PCR（RT-QPCR）

根据制造商的协议，使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取来自培养细胞的总RNA。对于CircRNA和mRNA表达，RNA通过使用标记第1链CDNA合成试剂盒（Vazyme，南京，中国）逆转录到cDNA中，然后通过RT-QPCR与ACEQ QPCR Sybr Green Master混合物定量（Vazyme，中国）。RT-QPCR反应在ABI StealoonePlus实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）上运行如下：95°C / 5分钟，95°C / 30 S和60°C / 30 S为40个循环．底漆序列列于补充表中S1．RT-qPCR产物用1.5%琼脂糖凝胶分离，紫外照射检测。相对表达量以2计算^{- - - - - -△△Ct}用于归一化管家的方法β肌动蛋白(13.]。

2.3。基因沉默和过度表达

针对CDR1As特异性结序列和两个SIRNA定位GNG7的两个不同的SIRNA被设计和合成（Genepharma，Shanghai，Shanghai，China），以进行基因沉默。siRNA序列列于补充表中S2．MiRNA（MiR-203A，MIR-876-5P，MIR-3167和MIR-299-3P）用于过表达MiRNA水平（Genepharma，Shanghai，China）。将GC细胞在37℃下培养过夜。在无血清培养基中使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，Ca）将siRNA或miRNA模拟物（25nm）转染到细胞中。在6小时后，将无血清培养基与完整的培养基一起改变，并在48小时后收获细胞进行RNA分析或功能实验，并在72小时后进行蛋白质分析。Lentivirus表达载体（Hanbio Biotechnology，上海，中国）用于构建CDR1AS稳定过表达细胞系，包括MKN-45，SGC-7901和BGC-823。用制备的Lentivirus HBlv-CDR1As-GFP-puro或HBlv-GFP-puro转滤细胞（ ）并选择2 μg/ml嘌呤霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)至少2周。荧光显微镜(BioTek, USA)检测GFP强度，RT-qPCR检测CDR1as水平。

２.４.细胞迁移和侵袭试验

转染的GC细胞（ ）200. μL血清培养基分别播种到Transwell系统（康宁，USA）的上室内而没有（迁移测定）或（侵袭测定）Matrigel（BD Bioscience，USA）涂层。然后，600 μl将具有10％FB的完全培养基加入下腔室。在培养12小时后（迁移测定）或24小时（侵袭测定），将迁移到膜的反面的细胞在4％多聚甲醛中固定，用0.1％晶体紫色染色，通过显微镜捕获并计数。将剩余的上腔室留在上室的非组织细胞被清除。

2.5。双荧光素酶报告总基因测定

通过Genscript（南京，中国）合成含有全长CDR1As cDNA CDNA的重组双荧光素酶报告质粒质粒pMILGLO-CDR1as。MGC-803和293T细胞（ /well)，然后将400 ng荧光素酶报告质粒和40 nM miRNA模拟物共转染细胞。48 h后收集细胞并裂解，在GloMax 20/20 Luminometer (Promega)上使用dual glo luciferase Assay Kit (Promega)检测萤火虫和Renilla荧光素酶活性。

2.6。免疫印迹

用RIPA裂解缓冲液(Pierce, MA, USA)从细胞或组织中提取蛋白质。用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS- page)分离等量的蛋白，转移到PVDF膜(Millipore, Billerica, MA, USA)上。然后用5% ( ）脱脂牛奶，与特异性一抗在4°C孵育过夜，酶标二抗在37°C孵育1小时。使用增强化学发光系统(ImageQuant LAS4000mini, GE, Japan)可视化蛋白质带信号。所得抗体为兔抗β-Actin抗体（1：5000;阿克隆，武汉，中国），兔抗Vimentin抗体（1：800; BioWorld，USA），兔抗E-cadherin抗体（1：300; Santa Cruz，USA），兔抗-N-Cadherin antibody (1 : 300; Cell Signaling, USA), rabbit anti-MMP2 antibody (1 : 300; Cell Signaling, USA), rabbit anti-MMP9 antibody (1 : 300; Cell Signaling, USA), rabbit anti-GNG7 antibody (1 : 500; ABclonal, USA), and Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody (1 : 2000; Invitrogen, USA). The densitometry readings of each band were obtained using ImageJ program, and the fold change of indicated proteins was determined by normalizing toβ肌动蛋白的表达。

2.7。小鼠转移模型

根据机构动物指南，4-6周龄4-6周龄的男性Balb / C Nu / Nu Mice（Cavens，Chancens）在SPF条件下进行。腹部转移模型如前所述实施[14.]。CDR1as稳定过表达MKN-45细胞(MKN-CDR1as)或其对照细胞(MKN-NC) ( 细胞在200年μl PBS /只)腹腔注射。2周后处死小鼠，计数腹腔转移结节并成像。所有动物实验均经江苏大学动物使用伦理委员会批准。

2.8。统计分析

数据采用SPSS 21.0 (IBM, Chicago, IL, USA)和GraphPad Prism version 5.0 (La Jolla, CA, USA)软件进行分析。学生的 -试验用于评估两组之间的差异，同时施用三种或多种实验组之间的单向ANOVA差异。三个独立实验的数据呈现为 ，和值<0.05被认为是统计学意义的。

3.结果

3.1。CDR1AS敲低促进GC细胞的迁移和侵袭

我们首先研究了CDR1as在伴有功能缺失的胃癌细胞转移中的作用。将两种单独的抗CDR1as的siRNA转染到HGC-27和MGC-803细胞中，以下调CDR1as水平，并以一种非特异性siRNA作为对照。RT-qPCR分析证实了转染效率(图)1(一)和1 (b)）.随后，用Transwell法检测胃癌细胞的转移能力。结果显示，CDR1as敲低明显促进了HGC-27和MGC-803细胞的迁移(图)1 (d))，有效增强了GC细胞的侵袭能力(图1 (e)）.为进一步探讨胃癌细胞转移机制，检测上皮-间充质转化- (EMT-)相关蛋白和基质金属蛋白酶(MMPs)。CDR1as敲低后，间质标记物N-cadherin和vimentin表达水平升高，上皮标记物E-cadherin表达水平降低(图)1 (c)）.同时，CDR1AS的敲低促进了MMP2和MMP9表达（图1 (c)）.这些结果表明，CDR1as下调可能通过诱导EMT过程和MMP释放来促进GC细胞的迁移和侵袭。

３．２．CDR1as过表达抑制胃癌细胞的体内外转移

为了进一步证实CDR1as对胃癌细胞转移的影响，我们在胃癌细胞系(MKN-45、SGC-7901和BGC-823)中过表达CDR1as。将制备的慢病毒HBLV-CDR1as-GFP-PURO或HBLV-GFP-PURO转导GC细胞，构建稳定过表达CDR1as的细胞及相应的对照细胞。结果表明，大部分细胞在荧光显微镜下成功转导并表达了GFP(图)2(一个)）.此外，实验组中的CDR1As水平超过RT-QPCR的对照组的100倍（图2 (b)）.然后，Transwell测定表明，具有CDR1A过表达的迁移和侵袭的GC细胞的数量显着低于对照细胞（图2 (c)和2 (d)）.western blot结果显示，过表达CDR1as的GC细胞中N-cadherin、vimentin、MMP2和MMP9水平较对照组低，而E-cadherin水平较高(图)2 (e)），与CDR1AS敲低观察到的效果相反。此外，为了评估对GC转移的CDR1AS效果体内，裸鼠中的腹部转移模型用CDR1As稳定过表达MKN-45细胞（MKN-CDR1As）及其对照细胞（MKN-NC）构建。我们发现，与MKN-NC细胞相比，在小鼠MKN-CDR1AS细胞中，腹部转移性结节的数量降低了（图2（f））.同时，我们还注意到MKN-CDR1As组中的腹部转移性结节体积高于MKN-CDR1AS组中的腹部转移性结节。这些结果表明CDR1AS过表达抑制了GC细胞转移在体外和体内．

3.3。MiR-876-5P逆转CDR1As促进GC细胞的迁移和侵袭

为了识别CDR1AS除MIR-7外，我们在Starbase v2.0上搜索了新的miRNA目标（http://starbase.sysu.edu.cn/)，根据biComplex和clipReadNum的值以及targetSites的数量选择miR-203a、miR-876-5p、miR-3167、miR-299-3p作为候选。双荧光素酶报告基因检测显示，这些mirna过表达，特别是miR-876-5p，显著降低了MGC-803和293T细胞中含有CDR1as序列的报告基因的荧光素酶活性，证实了CDR1as与miR-876-5p的结合能力(图)3(一个)和3 (b)）.此外，进行MGC-803和MKN-45细胞中的救援实验。我们发现，CDR1as抑制了GC细胞的迁移和侵袭能力，而MIR-876-5P可观察地逆转此效果（图3（c）和3（d））.此外，miR-876-5p与miRNA mimic过表达显著增强了GC细胞的转移能力，这与CDR1as沉默诱导的效果一致(图)3（e）和3（f））.总共，这些结果推断MIR-876-5P可以是CDR1A的靶标，用于调节GC细胞的迁移和侵袭。

3.4。CDR1AS上调GNG7，MIR-876-5P的目标

为了确定miR-876-5p下游靶mRNA，我们使用starBase v2.0从7个数据库中预测了超过3000个靶mRNA，并根据符合度选择48个mRNA (Supplementary Table)S3.）.由于mir-876-5p对GC细胞转移的促进作用，我们主要专注于肿瘤抑制基因，因此选择了10个潜在靶标（补充表S3.）.在AGS的MiR-876-5P模拟中转染后，所有细胞系只有GNG7和MITF mRNA水平降低，表明它们可能是miR-876-5p的靶基因（图4（a））.为了确定CDR1as海绵吞噬miR-299-3p时的靶点是哪个基因，我们进一步检测了CDR1as过表达和敲低后它们的转录水平。在过表达CDR1as的MKN-45、BGC-823和SGC-7901中，GNG7是唯一表达显著增加的基因(图)4（b））.同时，CDR1as下调HGC-27和MGC-803细胞中GNG7水平(图)4（c））.Western印迹分析还表明miR-876模仿在GC细胞中抑制了GNG7蛋白水平（图4（d）），CDR1AS敲低，同时其过度表达上调上调GNG7蛋白质水平（图4（e）和4（f））.此外，miR-876-5p共转染可逆转过表达CDR1as的GC细胞中GNG7蛋白水平的上调(图)4（g）和4（h））.综上所述，GNG7被确定为miR-876-5p的靶基因，并在GC细胞中被CDR1as上调。

3.5。GNG7的敲低逆转CDR1as以促进GC细胞的迁移和侵袭

为了确定GNG7是否是cdr1a介导的肿瘤抑制作用的重要调控因子，设计了两种不同的sirna，并转染到AGS和MGC-803细胞中下调GNG7。RT-qPCR和western blot分析证实了GNG7在GC细胞中的表达下调(图)5（a）- - - - - -5（d））.转染后，GNG7沉默明显促进了GC细胞的迁移和侵袭能力（图5（e）和5（f））.此外，当我们在过表达GC细胞的CDR1As中敲低GNG7时，CDR1AS对细胞迁移和侵袭的抑制作用减少甚至逆转（图5（g）和5（h））.因此，这些结果提示GNG7可介导CDR1as对胃癌细胞转移的抑制作用。

4.讨论

肿瘤转移是包括胃癌在内的许多癌症患者预后不良的关键决定因素[15.]。这是一个多步骤的细胞生物学过程，其中EMT和增强的MMP功能对于原发肿瘤细胞向周围组织和远处的局部侵袭非常重要[2]。CDR1AS是Circrna研究领域的热点，已被发现对不同癌症类型的肿瘤转移产生不同的调节作用。它促进鳞状细胞癌中的细胞转移[16.，非小细胞肺癌[17.]和胰腺癌[18.]，同时抑制卵巢癌细胞转移[11.[黑色素瘤[12.]。在本研究中，通过功能获得和功能缺失实验观察到CDR1as抑制胃癌细胞转移。同时emt相关蛋白和MMPs也下调。建立模拟晚期胃癌的裸鼠腹腔转移模型，发现CDR1as过表达减少了腹腔转移结节的数量。虽然只使用了一对裸鼠，但CDR1as对裸鼠胃癌转移的抑制作用明显。因此，CDR1as可能通过调控MMP释放和EMT过程来抑制胃癌细胞转移。

CDR1AS已经证明以调节肿瘤进展，因为MiRNA海绵到DerePress下游靶MRNA。许多miRNA已被识别为CDR1as的目标，特别是miR-7。例如，CDR1A通过海绵miR-7加速结直肠癌进展，以上调其目标EGFR-RAF1 [19.]。CDR1AS充当miR-7海绵，以在非小细胞肺癌中上调包括EGFR，CCNE1和PIK3CD的miR-7的目标[9]。此外，MIR-1270被验证为加速肝细胞癌中CDR1AS的靶标[20.]。此外，CDR1AS抑制卵巢癌进展，因为MiR-135B-5P海绵上调HIF1AN表达[11.]。在本研究中，MiR-876-5P被鉴定为CDR1as的目标。与双荧光素酶报告基因测定结合的生物信息学预测证实了CDR1AS和MIR-876-5P的结合能力。Transwell测定显示MIR-876-5P对GC细胞迁移和侵袭的促进作用，这与CDR1as的影响相反。当用MiR-876-5P救出CDR1AS过表达细胞时，CDR1AS对细胞转移的抑制作用明显逆转。因此，CDR1AS通过作为miR-876-5p海绵抑制GC细胞转移。

G蛋白质γ亚基7（GNG7），大g的成员γ据报道，家庭将在各种癌症中下调，包括胰腺癌[21.]，食管癌[22.]和胃肠道癌[23.]。GNG7表达量的下降与GNG7启动子区域的高甲基化有关[22.，24.或zeste同源物2增强子(EZH2)减少和失能同源物2相互作用蛋白(DAB2IP)增加[25.]。此外，多数研究表明GNG7是一种潜在的肿瘤抑制因子。在食管癌中，GNG7高表达的肿瘤侵袭性低于GNG7低表达的肿瘤在体外和体内［22.]。在透明细胞肾细胞癌中，GNG7水平较低的细胞在G2/M细胞周期期增加[25.]。在胃肠道肿瘤中，GNG7抑制细胞生长在体外和体内通过上调周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27的表达^Kip1［24.]。GNG7可通过抑制MTOR途径诱导自噬和细胞死亡，通过调节肌动蛋白细胞骨架抑制细胞分裂[26.]。在本研究中，通过与RT-QPCR和Western印迹分析结合生物信息学预测，将GNG7鉴定为miR-876-5p的靶标。同时，CDR1AS呈正常调节GNG7的蛋白质和mRNA水平。通过用miR-876-5p救出，CDR1as的上调GNG7水平可通过救出MIR-876-5P来下调，表明CDR1AS可能会抑制miR-876-5p效应来上调GNG7水平。此外，GNG7可能是调节GC转移时的抑制基因，因为其敲低促进了GC细胞迁移和侵袭。当CDR1AS中的GNG7的表达被敲下来时，降低了对细胞转移的抑制作用或甚至逆转，揭示了GNG7对于CDR1A是对GC转移产生抑制作用的重要作用。

由于传统癌症治疗的局限性，已经开发了包括靶向EGFR，VEGF和HER2的小分子药物或单克隆抗体的分子靶向治疗[27.]。然而，肿瘤细胞会产生耐药性，一些药物由于靶点的结构而难以开发[28.]。circrna作为调节肿瘤相关蛋白的天然miRNA海绵，具有作为有效治疗靶点开发的巨大潜力。通过调控环状rna水平来抑制肿瘤进展可能是一种有用的方法。在我们的研究中，我们使用慢病毒载体提高GC细胞中CDR1as的水平，并显著抑制GC转移在体外和体内．此外，一种含有miR-21结合位点的合成环状rna已被证实在体外抑制GC细胞生长[29.]，建议合成CDR1AS海绵可能是一个简单，有效，方便的治疗策略。这些拟议策略的安全性和有效性仍有进一步验证。

总之，CDR1AS通过海绵MiR-876-5P在GC转移中发挥着重要的抑制作用，以上调GNG7表达。这些发现阐明了GC转移的新机制，并为未来的GC治疗提供了潜在的治疗策略。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可从相应的作者请求中获得。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

嘉嘉江和荣莉同等为这项工作进行了贡献。

致谢

这项工作得到了江苏省重点研发计划（BE2020680），苏州卫生委员会（LCZX202019）和张家港科学支持项目（ZKS2015）。

补充材料

补充表S1和S2：引物和寡核苷酸序列。补充表S3：使用星形v2.0预测MIR-876-5P的靶MRNA。（补充材料）

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