文摘
目的。调查的表情neuroligin1 (NL1)和neurexin1(资料片)肠神经发育不良(Tlx2的小鼠模型- / -老鼠)和探索对结肠运动的影响。方法。免疫组织化学染色法是用来探索NL1的组织学表现,资料片,VGLUT1 glutamatergic突触的突触前标记,和子单元的门冬氨酸受体NR1小鼠的结肠中有或没有Tlx2突变。西方墨点法和存在进行检测它们的相对表达式在结肠。结肠运动是由一个玻璃珠测量技术。然后,Tlx2- / -老鼠干预NL1石杉碱甲a变化表达式,资料片,VGLUT1, NR1和变化对结肠运动的测量。此外,血清浓度的Glu ELISA测定。结果。免疫组织化学染色显示,NL1、资料片、VGLUT1, NR1的肌间神经丛主要集中在ENS. WT和Tlx2相比+ / -老鼠,表情Tlx2 NL1和资料片的结肠- / -老鼠调节和增加VGLUT1 NR1丰度和受损的结肠运动( )。干预后,调节NL1和资料片的表达减少的相关性降低VGLUT1 NR1和恢复受损的结肠蠕动( )。Glu的血清浓度的变化,通过测量ELISA一致glutamatergic突触的变化和结肠运动( )。结论。NL1和资料片是密切相关的结肠蠕动通过他们的影响针对glutamatergic突触的形成和。的发病机制可能参与国家免疫日血清Glu的变化似乎是一个潜在的和更少的痛苦的辅助措施。对结肠运动和国家免疫日
1。介绍
)肠神经发育不良(国家免疫日是一个类似于巨结肠病的临床状况(HSCR)和在临床上表现为严重受损的结肠运动,如严重的便秘或肠梗阻(1,2]。不同于HSCR在组织学观察,缺乏神经节细胞的肌间神经丛,显示增生患者国家免疫日AChE-positive黏膜下肌间神经丛和增加的神经纤维(3]。尽管病理神经支配模式中描述,患者的结肠国家免疫日仍有争议,组织学结果之间是否存在因果关系及其严重受损的结肠蠕动。此外,由于临床特征与HSCR之间惊人的相似,可以明确诊断国家免疫日只在直肠活检组织学分析(1,4]。因此,进一步的研究和发病机制的国家免疫日更方便和更少的痛苦的诊断方法仍然是需要的。
神经元突触,连接成重叠,互相交叉的神经回路,是神经系统的基本单位和功能神经网络是至关重要的。Neurexins代表一个家庭的突触前神经元细胞粘附蛋白,形成与neuroligins transsynaptic复合物,最著名的Neurexins突触后配体,通过蛋白质域或硫酸乙酰肝素(HS) [5,6]。neurexins和neuroligins编排的事件之间的相互作用形成和稳定的兴奋和抑制性突触和共享遗传风险的核心途径在自闭症和精神分裂症在中枢神经系统(CNS) [7,8]。正常运转的胃肠道(GI)能动性也严重依赖于一个微妙的兴奋和抑制的协调肠肠神经系统中的脉冲(ENS) (9]。虽然较少的研究一直在进行实体,以前的研究已经表明neurexins neuroligins也表达了神经节细胞的肌间神经丛(10- - - - - -12]。所以,假设占组织学发现和提出了严重受损的结肠运动的国家免疫日交互neurexins和neuroligins可能与结肠的能动性。
纯合子突变小鼠的Tlx2 (Tlx2- / -)表现出与受损的肠道表型(结肠极其类似的能动性和已经证实国家免疫日13,14]。为了验证这个假设,Tlx2- / -老鼠被选为动物模型。水泡谷氨酸transporter-1 (VGLUT1),突触前分子运输Glu在突触前释放到突触囊泡和协助其终端,和门冬氨酸受体NR1分子(NR1),两者都可以通过交互的集群neuroligin1 (NL1)和neurexin1(资料片)在突触发生15,16),被选为glutamatergic突触的标志。进一步研究了通过探索发病机制的国家免疫日NL1、资料片结肠蠕动的影响。
2。材料和方法
2.1。动物和样品制备
我们的研究是齐鲁医院的伦理委员会批准,山东大学(排名12025)。下的小鼠治疗动物使用指南的机构动物保健和使用委员会(IACUC)齐鲁医院、山东大学。173个基点区域的核苷酸序列在第二个Tlx2基因的外显子淘汰通过CRISPR / Cas9基因打靶技术,和Tlx2+ / -老鼠产生Genechem(上海,中国)。Tlx2+ / -老鼠杂交获得Tlx2- / -老鼠。出生后三周,突变体后代被数和段尾收获了基因分型。岁的药物干预8周或1天之后,测量结肠蠕动。应用通过戊巴比妥麻醉后,血液样本和部分全层远端结肠的收获。然后,血清凝血后通过离心收获。血清和结肠组织存储在−80°C进行进一步的分析。
2.2。基因分型
Tlx2基因型测定印迹。基因组DNA被隔离的尾巴一只老鼠尾巴基因组DNA的突变体后代工具包(CWBio,北京)。引物的Tlx2如表所示1反应溶液,由25μl 2×Es Taq MasterMix (CWBio,北京),2μl正向引物(10μmol / l), 2μl反向引物(10μ2.5 mol / l)μl DMSO (Solarbio,北京),16岁μl双蒸水,2.5μl基因组DNA。然后放大了基因组DNA PCR和1%琼脂糖凝胶上分离。这幅图片是由BIO-RAD凝胶文档系统(BIO-RAD、钙、美国)。
2.3。药物干预
Tlx2- / -石杉碱甲的老鼠干预石松属植物生物碱分离从草本Huperzia serrata影响资料片的表达(17]。石杉碱甲(北京药理学和毒理学研究所、北京、中国)盐酸溶解在0.1 N在5毫克/毫升原液和稀释之前使用生理盐水。Tlx2- / -小鼠随机分为5组。石杉碱甲Tlx2- / -老鼠的剂量为0.1毫克/公斤8周,胃内的强饲法(高)12.5倍稀释和保留灌肠(集团)一定是在稀释25倍。同时,相同剂量的生理盐水也给出了通过胃内的强饲法(SIG)和保留灌肠(行为)。的Tlx2- / -老鼠没有任何干预是诈骗集团。
2.4。结肠运动测量
结肠蠕动的老鼠被玻璃珠技术测量。用鼠标在老鼠一条毛巾,保持冷静。罢工轻轻鼠标左右5分钟刺激老鼠通过粪球。玻璃珠(2.5毫米直径)是通过肛门将慢慢推入结肠2厘米的玻璃棒(2.5毫米直径,2厘米)。检查后,珠不是困在玻璃棒,杖慢慢被移除。一旦删除杖,启动定时器,直到珠子被驱逐了出去。
2.5。免疫组织化学染色
采用免疫组织化学染色检测的组织学外观NL1、资料片,NR1, VGLUT1。石蜡切片脱蜡在二甲苯和分级醇。抗原被微波在0.01 M柠檬酸缓冲,揭露和内源性氧化物酶切除3%的H2O2。冲洗后用0.1 PBS,结肠部分被封锁在山羊血清为0.5 h 37°C和孵化在初级抗体(表2一夜之间)在4°C。然后结肠部分与二次孵化抗体在37°C 0.5 h和彩色涂(Beyotime、上海、中国)。后与分级醇脱水,二甲苯,结肠部分盖玻片,如图所示。
2.6。免疫印迹分析
免疫印迹分析申请调查的相对丰度NL1、资料片、NR1, VGLUT1在蛋白质水平。总蛋白质分离得到全层结肠标本按分钟™总蛋白提取工具包(发明、锰、美国)。之后,20浓度测量μg蛋白质分离7.5% sds - page凝胶和electroblotted PVDF膜。后被5% BSA,孵化了PVDF膜主要抗体(表2一夜之间)在4°C。然后,膜被0.1 TBST冲洗和孵化二级抗体(表2)1 h rt,被TBST冲洗后,膜被检测到的ECL工具包(微孔、马、美国),最后和灰色值计算。
2.7。qPCR化验
qPCR化验是申请调查的相对表达NL1、资料片,NR1, VGLUT1在mRNA水平。每个标本分离的总RNA MiniBEST通用提取工具包(豆类、志贺、日本)。评估集中后,互补脱氧核糖核酸合成的数量1μ称g RNA的指示PrimeScript™RT试剂盒(豆类、志贺、日本)。然后,反应的解决方案准备使用UltraSYBR混合物(CWBio,北京),和qPCR反应进行罗氏LightCycler 480系统。引物的详细信息如表所示1。Ct值测量和2−ΔΔCt计算每组的统计分析。
2.8。ELISA试验
血清标本存放在−80°C在冰上融化了准备。Glu的酶联免疫试剂盒(Xinqidi、武汉、中国)被选为检测Glu的水平。血清标本96 -检测板(100μl /)。反应后,OD值在450 nm和实际测量血清浓度的Glu根据标准曲线计算。
2.9。统计分析
所有数据分析GraphPad棱镜®软件和显示为7.0 。单向方差分析和图基的测试被用于多个比较,和值小于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。基因分型和解剖
Tlx2+ / -老鼠显示正常的1.5岁。Tlx2+ / -老鼠杂交,其后代被印迹基因分型分析(图1(一))。野生型等位基因显示为568 bp的片段,和突变等位基因显示为395 bp片段。173年英国石油公司Tlx2基因的核苷酸序列在Tlx2中被淘汰了- / -老鼠。Tlx2- / -老鼠常常表现出生长阻滞较低体重和膨胀腹部(图1 (b)),因为之前报道(13,14]。Tlx2的26% (33/127)- / -老鼠死于出生后8周。的Tlx2- / -,Tlx2+ / -、WT老鼠和肠道被解剖解剖。大体解剖学Tlx2显示没有异常+ / -老鼠相比WT老鼠。附录中,盲肠、回肠末端和近端结肠Tlx2- / -老鼠扩张,远端结肠Tlx2- / -老鼠WT和Tlx2相比出现收缩+ / -老鼠(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。调节的表情Tlx2 NL1、资料片和结肠运动受损+ / -老鼠
组织学表现NL1和资料片的远端结肠免疫组织化学染色(图2(一个))表明,positive-stained细胞NL1和资料片大多集中在肌间神经丛的神经节细胞,这是符合前面的发现(10,18]。增生的肌间神经丛也观察到如前所报道(13,14]。代表墨迹图(图2 (b))和比较的相对灰度值(数据2 (c)和2 (d))表明,蛋白质的相对表达NL1 Tlx2和资料片- / -老鼠( , )在WT(调节相比 , )和Tlx2+ / -( , )老鼠( )。qPCR(图2 (e)和2 (f))所示类似的趋势,NL1和资料片mRNA在Tlx2更高- / -老鼠( , )相比在WT ( , )和Tlx2+ / -( , )老鼠( )。玻璃珠技术用于检测小鼠的结肠运动(图2 (g))。珠被驱逐的时候Tlx2- / -老鼠( )相比,在WT Tlx2+ / -老鼠( , , )。驱逐越长时间显示一个受损Tlx2结肠蠕动- / -老鼠。Tlx2之间的比较+ / -和WT老鼠表达无统计学差异。
(一)
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(e)
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(g)
3.3。增加Tlx2 Glutamatergic突触+ / -老鼠
NR1亚单位的门冬氨酸受体glutamatergic突触和VGLUT1 glutamatergic突触的突触前制造商。免疫组织化学染色(图3(一个))表明,NR1和VGLUT1的表达主要在老鼠的远端结肠肌间神经丛和黏膜和黏膜下层,这表明glutamatergic突触的存在。西方墨迹图(数据3 (b)- - - - - -3 (d))表明,NR1的相对丰度和VGLUT1 Tlx2- / -老鼠( , )是高于WT老鼠( , )和Tlx2+ / -老鼠( , )( )。qPCR分析(数据3 (e)和3 (f)证实这一趋势在mRNA水平NR1和VGLUT1 Tlx2 mRNA- / -老鼠更高( , )相比在WT ( , )和Tlx2+ / -( , )老鼠( )。更高的NR1和VGLUT1表示的表达式在Tlx2 glutamatergic突触的增加- / -小鼠结肠。
(一)
(b)
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3.4。减少NL1、资料片和调节表达的相关干预后恢复受损的结肠蠕动
NL1的表达式和资料片和结肠运动干预后如图4。表达的蛋白质NL1和资料片组高( , ),(一定是 , )在CON组相比显著降低( , ),团体( , ),和行为( , , )。NL1 qPCR化验证实减少表达式和资料片。表达式NL1和资料片mRNA组高( , ),(一定是 , )在CON组相比显著降低( , ),团体( , ),和行为( , , )。结肠运动测量显示相关恢复受损的结肠蠕动。驱逐次珠的组织以及和(一定是 , )在组织反对,相比短团体和行为( , , , )。生理盐水不能影响结肠蠕动。
(一)
(b)
(c)
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3.5。相关减少Glutamatergic突触后干预
NR1和VGLUT1被干预的变化如图所示5。表达的蛋白质NR1和VGLUT1组高( , ),(一定是 ,0 )在组织反对相比显著降低( , ),团体( , ),和行为( , , )。qPCR化验证实这mRNA水平的变化。NR1和VGLUT1 mRNA在群体的影响以及( , ),(一定是 , )减少相比,在团体反对( , ),团体( , ),和行为( , , )。减少NR1的表达式和VGLUT1也反映出减少glutamatergic突触。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。Glu的血清浓度变化有关
Glu的血清浓度的变化,通过测量ELISA glutamatergic突触的变化一致,NR1和VGLUT1结肠运动的变化。Tlx2 Glu的血清水平- / -老鼠( )是高于WT Tlx2+ / -老鼠( , , ;图6(一))。干预后,血清组的Glu水平高的和一定是( , )降低组相比案子,团体和行为( , , , ;图6 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
实体起源于肠神经嵴细胞(19,20.]。失败存在和发展的障碍会引起严重的肠道运动障碍,如复杂。障碍国家免疫日许多调查人员提出质疑作为一种独特的病理实体而存在的国家免疫日暗示,印第安纳州的病理变化可能是一个次要的现象引起的肠梗阻和炎性疾病1,21]。的Tlx2- / -是一个真正的老鼠是一个强有力的证据表明,国家免疫日实体。在目前的研究中,基因Tlx2被淘汰出局。然后,增生的远端结肠肌间神经丛被观察到。存在的畸形可能带来所示的狭隘的远端结肠大体解剖学。附录的扩张,盲肠,回肠末端,近端结肠可能引发的次生变化结肠癌梗阻。因此,腹胀和受损的结肠蠕动Tlx2老鼠并不惊人。这些发现证实了Tlx2的候选人- / -老鼠。类似的动物模型国家免疫日
肠蠕动引起的顺行推进腔的内容通过协调良好的肠道平滑肌的收缩和舒张22]。驱逐越长时间住Tlx2珠的- / -老鼠表示一个结肠运动受损。同时,NL1的表达式和资料片的存在远端结肠Tlx2- / -老鼠调节。Tlx2是孤儿同源框基因专门组织来源于神经嵴细胞表达和编码homeodomain,已知的特定DNA序列结合发展中存在调控下游基因的表达(23,24]。所以,可能存在一个直接或间接的相互作用在NL1、资料片、Tlx2。Tlx2的故障可能导致NL1调节表达式和资料片。但这需要进一步的研究来验证。干预后,调节LN1和资料片的表达减少,伴随着经济复苏的结肠运动受损。NL1表达式之间的相关性,验证了资料片和变化结肠运动预测NL1和资料片结肠运动密切相关,的发病机制可能参与国家免疫日这是一个解释Tlx2的结肠运动受损- / -老鼠可能导致从远端结肠肌间神经丛的增生,如本文所示。
作为一个主要的兴奋性神经递质在中枢神经系统,Glu起着基本的作用在生理条件下25]。尽管有争议的主题的文献和具体途径尚未完全阐明,越来越多的证据表明,谷氨酸可能也参与调节胃肠道的蠕动,以及brain-gut轴(25- - - - - -27]。NL1 glutamatergic突触本地化,可以绑定到资料片目标glutamatergic突触的形成和分化等集群突触蛋白NR1和VGLUT1(的15,16]。发现NR1和VGLUT1表达小鼠结肠肌间神经丛的表示glutamatergic突触在实体的存在。
NR1的变化和VGLUT1伴随着NL1和资料片的变化。的调节表达式LN1 Tlx2资料片- / -老鼠可以导致增加glutamatergic突触的实体,由相关增加验证NR1和VGLUT1。结肠蠕动正常运转关键取决于一个微妙的兴奋和抑制的协调肠冲动(28]。glutamatergic突触的增加将产生提升兴奋性突触的冲动,这将导致平滑肌细胞的收缩不协调。加强收缩,观察到的远端结肠Tlx2老鼠,最终将导致结肠蠕动障碍作为一个后果。同样,调节后的表情LN1和资料片减少干预,glutamatergic突触的复苏将提高结肠运动受损。这些表明NL1和资料片可能影响结肠蠕动通过glutamatergic突触。
由于相似的临床症状和HSCR之间国家免疫日,直肠活检确诊仍依赖于组织病理学分析现在(1]。直肠活检是一个熟练的和微妙的方法只给优秀的结果如果是由一个非常称职的外科医生(29日]。更方便和更少的痛苦的诊断方法仍然是必要的。在这项研究中,不同血清Glu衡量ELISA glutamatergic突触的变化一致,结肠的能动性。提升血清Glu Tlx2- / -老鼠可能反映其增加glutamatergic突触和随之而来的结肠蠕动障碍在某种程度上,反之亦然。血清Glu浓度的变化似乎是一个潜在的和更少的痛苦的辅助措施。对结肠运动和国家免疫日
如上所述,我们得出的结论是,NL1和资料片结肠运动密切相关。的发病机制可能参与国家免疫日NL1的表达和资料片小鼠结肠,在国家免疫日生成增加glutamatergic突触存在,因而可能导致结肠蠕动障碍。此外,血清Glu浓度的变化似乎是一个潜在的和更少的痛苦的辅助措施。对结肠运动和国家免疫日
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者没有利益冲突的披露。
确认
本研究支持的(1)国家自然科学基金(项目编号:81873846)(2)中国国家自然科学基金(项目编号:81701492),和(3)中国国家自然科学基金(项目编号:81471487)。