肠粘膜的细菌多样性生态失调小鼠腹泻治疗Qiweibaizhu粉

文摘

目前的研究试图探索Qiweibaizhu粉的效果(QWBZP)肠粘膜的细菌多样性和群落结构失调腹泻小鼠和提供科学依据的功效QWBZP antibiotic-induced腹泻。失调腹泻小鼠模型构建与广谱抗生素头孢拉啶胶囊和硫酸庆大霉素(23.33毫升·公斤¹·d¹)。肠道粘膜是收集,从每组中提取DNA。肠粘膜的细菌特征分析MiSeq基于16 s rRNA序列的测序平台。没有明显差异在α多样性指数在三组。样本分布在正常和QWBZP组相对集中,和个人之间的距离近了。然而,在模型组得到相反的结果。此外,组成和物种的丰富性是类似正常组和QWBZP组之间的门和属的水平。QWBZP治疗后,大量的乳酸菌增加了,变形菌门减少,厚壁菌门和拟杆菌门比率下降到正常水平。我们的结果表明,QWBZP可以帮助修复粘膜细菌粘膜微生物群结构和恢复。具体来说,QWBZP大量的增加乳酸菌和细菌性的S24-7 norank组。

1。介绍

人类的肠道是居住着大量的细菌,坚持肠道粘膜表面,参与许多生理功能的主机,如消化、代谢、免疫调节、能量转换、粘膜发展和屏障维护(1- - - - - -4]。肠道菌群的组成和功能影响宿主的健康(5,6]。通常,肠道细菌生活在一个相对稳定的动态平衡的环境。一旦这种平衡被破坏、类型、数量、比例,肠道细菌和位置将无序,导致失调,导致主机(病理变化7]。

肠道粘膜是最大的接触表面之间的身体环境和肠内腔。它由粘膜上皮细胞,紧密的细胞间链接和细菌膜。它可以有效地防止有害物质和病原体的入侵来维持稳定的内部环境(8]。身体失调会导致腹泻的过度增加条件致病菌,导致肠粘膜屏障损伤,肠道细菌和内毒素的变化,免疫力下降,肠道通透性增加(8- - - - - -10]。研究表明,中药具有明显的优势治疗肠粘膜屏障功能障碍。中药降低了肠粘膜通透性,促进肠道蠕动,促进有益菌的生长,抑制有害细菌的生长,刺激肠道mucosa-related细胞的分泌,增强肠道免疫通过调节肠道菌群,改善肠道粘膜屏障功能(10]。例如,QWBZP可以有效地治疗失调腹泻通过改善肠道失调等促进有益菌的繁殖双歧杆菌和乳酸杆菌(11,12]。

在先前的研究中,我们研究了QWBZP细菌乳糖酶基因的影响,但功能乳糖酶功能基因不能被发现在所有细菌,只有lactase-producing细菌;然而,16 s rDNA可以发现在所有的细菌。此外,QWBZP肠道结构有很好的效果,但这并没有改善肠道的细菌乳糖酶基因的多样性的内容(13,14]。与肠道的内容相比,粘膜有很多优势,包括完成结构、健康的免疫力,在微生物群殖民相对稳定,不受外部因素的影响。在这项研究中,我们旨在调查在失调QWBZP腹泻的影响从微生物群的多样性和群落结构在肠粘膜和提供更多有力的证据能力的中药来改变肠道菌群,改善肠道粘膜屏障功能。它将帮助开发临床消化疾病的预防和治疗。

2。材料和方法

2.1。动物

十八one-month-old-specific无菌(SPF)昆明小鼠(公里)(9个男性和9名女性)重达18 g-22 g是购自湖南Slaccas Jingda实验动物公司(湖南、中国)牌照号码SCXK(湘)2016 - 2002。所有涉及动物实验和程序根据协议执行机构的动物保健和使用委员会批准的湖南中医药大学。

2.2。医学

根据中国药典2015年,QWBZP是由人参、6克(山西);茯苓,10 g(云南);木香,6克(云南);agastache 10 g(广东);国内外葛根,10 g(湖南);白术macrocephala,10 g(浙江);和甘草,3 g (Neimong),这是购买处方从湖南中医药大学第一附属医院。医学是重根据上述比例,用冷水浸泡30分钟覆盖;这药是“煮大火焰,直到煮熟,然后用软的火焰。两次煮,煎煮时间通常是20 - 30分钟。药水“煮两次混合,100%剂量的传统煎煮QWBZP和冻结在4°C以下实验(15,16]。

2.3。试剂

头孢拉啶胶囊(产品批号:110804)和硫酸庆大霉素注射液(产品批号:5120106)从苏州购买请注意化学和制药工业有限公司和宜昌Renfu制药有限公司,有限公司,分别。抗生素浓度的混合物准备62.5 g L¹用无菌生理盐水的比例根据1:2(即。,6gentamicin (2 mL/branch) + 3 cephalosporins (0.25 g/grain)) and stored at 4°C [16,17]。蛋白酶K, Tris-saturated phenol-chloroform-isoamyl酒精(25:24:1),溶菌酶,和TE缓冲是购自北京郭鼎生物科技有限公司有限公司其他试剂在实验室做好准备。

2.4。方法

经过2天的适应性喂养,十八个月大SPF KM小鼠(相同数量的男性和女性)被随机分为三组,六只小老鼠(每组三个男性和三名女性):正常组(mn)、模型组(当时称为自然恢复组,mm)和治疗组(mq)。引起腹泻,老鼠在模型组和治疗组服用抗生素混合组成的硫酸庆大霉素、头孢拉啶(23.33毫升·公斤¹·d¹)。相应地,老鼠在正常组与无菌水填喂法,0.35毫升为5天(一天两次11,16]。当腹泻症状(拒绝活动,拱形颤抖,特别是水样粪便,蜷缩,和食欲不振)引起,治疗组的小鼠QWBZP汤在一个剂量的0.16 g·公斤¹·d¹3天(12,16]。老鼠牺牲无菌操作平台上使用颈椎错位。然后,肠道粘膜是刮带盖,和2次盐水后添加的重量挤压食糜,切开肠道和盐水清洗肠道壁。最后,两只老鼠的肠道粘膜样本(一男一女)在每一组选择,立即冻结在4°C以下实验(16,18]。

2.5。Metagenome提取

根据我们以前的报告,metagenome肠道粘膜微生物的DNA提取了以下协议(19]。总共2.0 g的肠道粘膜收集在一个无菌的环境中,放置在一个无菌离心管,均质5毫升0.1摩尔L¹磷酸缓冲溶液(PBS),以及离心机在200 g×2分钟。与PBS洗两次后,上清液转移到新的无菌管和离心机在10000 g×8分钟。然后,新的沉积物聚集;与丙酮与PBS洗一次,两次,三次和PBS;和resuspended 4毫升的TE缓冲。样品预处理后,500年μL悬浮,20μL的溶菌酶,5μ蛋白酶K, L和45μL TE缓冲被添加到1.5毫升无菌EP管和均质。样本在37°C的环境与30 30分钟和混合μL 10% SDS,其次是孵化在37°C 40分钟,每隔10分钟与涡流。80年之后,μL(十六烷基三甲基溴化胺(CTAB) /生理盐水和100年μL 5摩尔L¹添加了氯化钠和混合。混合物在65°C涡10分钟。同等体积的Tris-saturated phenol-chloroform-isoamyl酒精(25:24:1)被添加到示例中,混合好,离心机在10000 g×3分钟。上层清液转移到新的无菌管,与同等体积的混合chloroform-isoamyl酒精(24:1),和离心机10000 g×3分钟。上层清液被转移到新鲜无菌试管,同等体积的chloroform-isoamyl酒精(24:1)再次添加并混合。离心后的上层清液被转移到新鲜无菌管在10000 g×3分钟,10¹卷3摩尔L¹醋酸钠和增加了两倍体积的无水乙醇沉淀在-20°C approximately12 h。样本离心机在10000 g×3分钟。获得沉积物是用70%乙醇洗净,晒干,最终溶解在50μL (TE缓冲metagenome DNA提取。

2.6。PCR扩增和MiSeq Metagenome测序

V3 + V4变量地区的细菌16 s rDNA放大使用提取的DNA作为模板。使用的引物扩增338 f (5 - - - - - -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3 )和806 r (5 - - - - - -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 )。聚合酶链反应混合物(20μL)包含2.0μL(10×缓冲区,2.0μL(2.5更易与L核苷酸,0.8μ正向引物(5 Lμ0.8 mol / L)μ反向引物(5的Lμ0.2 mol / L)μ0.2 L的Taq,μL BSA, 10μ模板DNA的L, 4μL (ddH₂o . PCR条件如下:最初在95°C变性3分钟,其次是29 30年代周期在95°C,退火30年代,在55°C和扩展为72°C 45 s,然后为10分钟72°C (20.]。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检查,使用AxyPred凝胶萃取提纯设备(Axygen、科学公司,联盟城市,CA,美国),和量化使用QuantiFluor™- (Promega)。PCR产品被测序的Illumina公司MiSeq测序平台(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。MiSeq宏基因组测序已经完成由武汉弗雷泽遗传信息有限公司有限公司

2.7。生物信息学和统计分析

细菌多样性指数(包括Chao1, ACE、辛普森和香农指数)在肠道粘膜是衡量MOTHUR (v.1.30.1版本,http://mothur.org/基于操作分类单位(辣子鸡)(21]。主成分分析(PCA),主坐标分析(PCoA),非度量多维标度(nmd)和LEfSe分析进行了R包(http://www.R-project.org/)分析的主要分布特征和社区样本的相似性22- - - - - -25]。SPSS 24.0软件(美国、IBM、纽约Armonk)被用来分析统计数据。独立样本测试 或 用于比较的统计学意义上的差异。

3所示。结果

3.1。QWBZP对细菌的影响OTU失调腹泻小鼠的肠道粘膜

使用USEARCH (vsesion7.1)软件平台,序列受到OTU nonrepetitive序列的聚类(不含单序列)根据相似度97%。分析结果如图所示1。有288、443和269年的辣子鸡发现正常组、自然恢复组和治疗组,分别。其中,194是一样的。这表明抗生素的细菌数量增加辣子鸡、肠粘膜中增加了细菌物种在老鼠身上。QWBZP治疗后,细菌物种减少的数量接近正常水平。

3.2。QWBZP对细菌多样性的影响Dysbacterial腹泻小鼠的肠道粘膜

3.2.1之上。α多样性分析

α多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性。Chao1和ACE通常被用来估计的物种总数。指数值越大,越大的物种总数。辛普森和香农通常是用来定量描述一个地区的生物多样性。越小辛普森指数和香农指数越大,群落多样性越高。结果表明,ACE、Chao1辛普森,自然恢复组和香农指数非常接近的治疗组,和ACE Chao1,和香农指数略低;然而,治疗组的辛普森指数略高于正常组,和没有显著差异(图2)。建议QWBZP在细菌多样性的影响肠粘膜是类似于自然恢复,和它不增加其多样性。

3.2.2。β多样性分析

PCA能反映样本之间的差异和距离通过分析OTU相似(97%)组成不同的样本,它反映了不同的多组数据在二维坐标图使用方差分解。类似的样品成分越多,越近的距离PCA图。导致PC1变化和PC2比例为96.67%和1.71%,分别为(图3(一个))。与正常组相比,样品在自然恢复组相对分散,和两组之间的距离很好,表明抗生素对细菌结构产生重大影响的肠道粘膜。与QWBZP治疗后,样品mq1 mq2集中,但mq3相对分散,这可能与个体差异有关。这些发现表明,QWBZP能有效恢复肠道粘膜的细菌结构失调小鼠腹泻。此外,我们在PCoA获得相同的结果,nmd(数字3 (b)和3 (c))。

为了进一步研究细菌基因的相似性,HC基于UniFrac距离矩阵。如图3 (d),mn2 mn1 mn3 mm1, mq2被归入到一个类别,分别平方毫米和mm3集群。这表明正常组样本之间的相似性高,表明抗生素会破坏正常小鼠的粘膜细菌结构。治疗后与QWBZP mq1和mq3可以聚集着成群的mn1 mn2, mn3和mq2聚集到一个类别。这表明细菌的差异很小,结构之间的相似性很高的治疗和正常组,表明治疗效果好。然而,mm1, mn3聚集在一起,这可能与小鼠的个体差异有关。

3.3。QWBZP对社区的影响成分失调腹泻小鼠的肠道粘膜的细菌

3.3.1。QWBZP对肠粘膜的构成细菌在门级

一般来说,肠道粘膜细菌主要起源于厚壁菌门、变形菌门,拟杆菌、放线菌和Tenericutes。厚壁菌门是最丰富的。中检测到的细菌,Acidobacteria、Gracilibacteria Gemmatimonadetes, Deinococcus-Thermus只发现在自然恢复组。不难看到从图4(一)厚壁菌门的丰度,拟杆菌、放线菌、和Tenericutes自然恢复组低于正常组,除了变形菌门。此外,在放线菌有显著差异( ),拟杆菌门( ),和Tenerictutes ( )。与QWBZP治疗后,大量的厚壁菌门,拟杆菌门,Tenericutes增加,大量的变形菌门和放线菌下降。此外,厚壁菌门的丰度较高,而变形菌门的丰度和放线菌在治疗组低于正常组,但无显著性差异。

确认我们的发现,提供的热图分析R包使用。一个热点图可以直观地表示数据值的大小在一个定义的颜色。丰裕的水平代表聚类样本之间的相似性,和垂直代表丰富的聚类相似物种之间。丰富和low-abundance物种可以通过集群、聚合和社区组成的相似性和差异在每个分类水平是反映在颜色梯度和相似性。在检测到细菌在门级、细菌显然是由它们的相对丰度(图4 (b))。

3.3.2。QWBZP对肠粘膜的细菌的组成的影响在属水平

中检测到的细菌在属级,乳酸菌(44.16%)是正常组的优势种,紧随其后细菌性的_S24-7_group_norank (12.33%),Candidatus arthromitus(10.61%)和Stenotrophomonas(10.41%)。然而,占主导地位的物种在自然恢复组乳酸菌(40.05%),Stenotrophomonas(8.66%),肠球菌(5.53%)和Pseudoalteromonas(5.05%)。治疗组的优势种乳酸菌(44.51%),肠球菌(12.97%),细菌性的_S24-7_group_norank (9.32%)Stenotrophomonas(8.10%)(图4 (c))。在六个主要属,细菌性的_S24-7_group_norank和Candidatus arthromitus在自然恢复组明显低于正常组( );与正常组相比,肠球菌是增加,乳酸菌,Pseudoalteromonas,Stenotrophomonas减少,但没有显著差异。与QWBZP治疗后,乳酸菌和细菌性的_S24-7增加,达到正常组水平;Stenotrophomonas和Candidatus arthromitus类似于自然恢复组但低于正常组。此外,肠球菌继续增加,这明显不同于自然恢复组和正常组( )。

4所示。讨论

4.1。QWBZP有助于恢复肠道粘膜的细菌多样性

在物种多样性分析,有两个因素,即丰富和一致性。在这项研究中,Chao1,王牌,香农指数最大,辛普森指数最小的正常组。在某种程度上,这反映了丰富性和复杂性在正常小鼠肠道粘膜的细菌。治疗组的多样性指数非常接近自然恢复组和正常组没有区别,这与我们之前的发现是一致的(20.]。可能的原因可能是强大的自我调节效应在粘膜的细菌密切相关;粘膜微生物群可以自然恢复后短期抗生素干预,是因为其强大的韧性。辣子鸡的数量(443)在自然恢复组明显高于那些在正常组(288)和QWBZP组(269),和辣子鸡QWBZP组的数量比正常组接近,表明QWBZP可以帮助恢复粘膜细菌多样性保持在一个正常的水平。这一结果与以往的研究,干预和QWBZP抗生素治疗细菌多样性有很大的影响在肠道的内容(26]。它可能与多种因素有关,包括治疗时间短,QWBZP恢复肠道的微生物群的优先级的内容,以及不同组件之间的肠道微生物群内容和粘膜。

4.2。QWBZP调节肠道粘膜的细菌丰度

从物种丰度分析、组成和物种的丰富性之间类似正常组和QWBZP组门和属的水平。自然恢复组增加了大量的许多非机密的细菌。在特定的分类单位,抗生素的细菌类群丰度增加Acidobacteria, Gracilibacteria Gemmatimonadetes, Deinococcus-Thermus和细菌属丰富的Acidobacteria_norank,Aestuariibacter,Alteromonas,Aureicoccus,双相障碍1-7_clade,Halomonas,Hoeflea,Labrenzia,Marinobacter,Pseudoalteromonas,Rhodobacteraceae_unclassified,Ruegeria,Shimia,Thalassobius,弧菌。这个结果表明抗生素促进许多致病细菌的增加在一定程度上和QWBZP导致了细菌丰度的恢复肠道粘膜。

变形菌门的越来越多是一个诊断失调的迹象和疾病风险,和厚壁菌门和拟杆菌门的比率( 值)是常用的测量肠道内稳态27]。乳酸菌抑制肠道致病细菌,促进T细胞的发展,增强细胞免疫(28]。在这项研究中,与QWBZP治疗后,乳酸菌增加,变形菌门减少, 比率下降到正常水平。此外,肠球菌继续增加,这明显不同于自然恢复组和正常组( )。这些结果表明,QWBZP帮助恢复的主要微生物群并达到一个新的平衡肠道粘膜。此外,扩散乳酸菌促进肠道粘膜的修复,增加肠球菌可能与抗生素的耐药性,如庆大霉素。

4.3。QWBZP有效修复肠道粘膜的细菌群落结构

主成分分析是用来分析细菌群落结构。从我们的研究结果,分布相对集中,和样本距离接近QWBZP和正常组,表明细菌群落结构相似性高。自然恢复组、样本分布相对分散,和样本距离远非QWBZP组和正常组,表明可怜的相似性。我们在随后的PCoA获得相同的结果,nmd分析。研究结果表明,抗生素破坏了细菌的结构在正常小鼠肠道粘膜。这些结果与我们之前的研究相一致,抗生素大大改变肠道粘膜细菌的群落结构20.]。此外,样品在正常和QWBZP团体更集中,和结构的相似性高,这表明QWBZP可以帮助恢复肠道粘膜的细菌群落结构保持在一个正常的水平。我们相信它是相关的有效的修复效果QWBZP肠道粘膜细菌结构与失调小鼠腹泻(13,29日]。

总之,抗生素破坏了肠道粘膜细菌在小鼠和结构,在某种程度上,刺激的增加他们的多样性。与QWBZP治疗后,细菌是有效地恢复,结构有效地修复,微生物群达到一个新的平衡肠道粘膜。我们的研究表明,可能功效的QWBZP失调小鼠腹泻是通过结构和微生物群的有效恢复肠道粘膜。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

这项研究是动物伦理和福利委员会批准的湖南中医药大学。

的利益冲突

所有的作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

周瑾(Tan设计研究。Hao-Qing邵和程毓罗进行实验,收集数据。Cheng-Xing长,Hao-Qing邵分析数据。Cheng-Xing长写的手稿。荣昱和周瑾(Tan回顾了手稿。

确认

特别感谢是扩展到中国的国家自然科学基金(81573951)。

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