吲哚生物碱从吴茱萸抑制大鼠结肠运动在体外

摘要

Evodiamine (Evo)是从中药中提取的吲哚生物碱吴茱萸。埃沃可以调节肠胃蠕动，但证据不足，机制尚不清楚。这项研究的目的是调查的Evo对大鼠结肠运动的基本机制的影响，体外。大鼠结肠肌肉暴露于埃沃（10和100 μM)随后进行胆囊收缩素受体1 (CCK1R)的免疫组化。在器官浴系统中研究肌肉收缩，以确定CCK1R、一氧化氮(NO)和肠神经元是否参与Evo的松弛作用。全细胞膜片钳检测l型钙电流( )分离的结肠平滑肌细胞(SMCs)。CCK1R存在于大鼠结肠的SMCs、肌间神经元和黏膜中。Evo能抑制自发性肌肉收缩;NO合酶，抑制剂L-NAME CCK1R拮抗剂，可以部分阻断这一作用，而肠内神经元可能不起主要作用。Evo抑制了峰值在结肠SMCs中膜电位为0 mV。Evo修正了l型钙通道的电流-电压(I-V)关系，而I-V曲线的峰值保持在0 mV。Evo能抑制l型钙通道的激活，降低峰值 。Evo对结肠肌肉的松弛作用与抑制l型钙通道有关。小肠神经元、NO、CCK1R可能与Evo对结肠运动的抑制作用有关。本研究首次证明依武二胺可通过介导平滑肌细胞内钙稳态来调节大鼠结肠运动。这些数据为伊武二胺治疗胃肠动力疾病的临床应用奠定了理论基础。

1.介绍

Evodiamine (Evo)是一种天然吲哚生物碱，是其主要生物活性成分之一吴茱萸。它作为中药已经使用了几百年，最早记录在《神农中草药经典》中。Evo在药理作用方面，其对癌症、肥胖、痛觉、炎症、心血管疾病、阿尔茨海默病、传染病、体温调节等方面的有益作用越来越受到重视[1- - - - - -7]。最近的研究表明Evo可能参与调节胃肠运动，但证据不足，潜在的机制尚不清楚。

先前的研究表明，埃沃通过激活胃肠胆囊收缩素受体1（CCK1R）抑制胃肠运输和胃排空[8]。另一项研究表明，埃沃增强空肠平滑肌的收缩性，它是钙依赖性的，并且被内源性乙酰胆碱需要调解[9];卡哈尔间质细胞也参与其中。肌球蛋白轻链激酶表达增加。肠道神经系统，它仍能发挥主要的调节作用体外，调节肠道运动，提示可以利用分离的肠道碎片研究药物的作用机制[10]。

胃肠运动障碍和腹痛是功能性胃肠疾病的主要特征。许多研究表明，其机制与平滑肌和感觉系统的异常变化有关，而平滑肌和感觉系统控制着正常的胃肠运动。本研究探讨Evo对大鼠结肠动力的影响及其机制，旨在为其在临床治疗胃肠动力疾病提供理论依据。

2。材料和方法

我们采用了Lu等人的方法[11]和Quan等人[12]。

2.1。动物

所有的实验动物程序都得到了机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循了国际疼痛研究协会的伦理指南。本研究选用体重180-220 g的雄性Wistar大鼠。动物饲养在恒温(20-24℃)、湿度65%的设施中，并提供食物和水随意。

2.2。解决方案和试剂

无钙生理盐溶液(PSS)按mmol/L配制:氯化钠135.0、氯化钾5.0、氯化镁21.2、葡萄糖10.0、羟乙基哌嗪乙磺酸10.0，氢氧化钠调节pH至7.4。L型钙通道电极的解决方案是准备如下(更易/ L):氯化铯135,氯化镁24日羟乙基哌嗪ethylsulphonic酸10、无水磷酸肌酸二钠盐2,乙烯glycol-bis——(2-aminoethyl醚)四乙酸10,并与氢氧化铯tetraethylamine 20日调整pH值为7.3。按照mmol/L配制Tyrode溶液:氯化钠147.0，氯化钾4.0，氯化钙2.0，磷酸二氢钠0.42，磷酸氢二钠2.0，氯化镁1.05，葡萄糖5.5，氢氧化钠调节pH为7.4。Evo购自阿拉丁试剂有限公司将伊伍二胺溶于二甲基亚砜(DMSO)中。DMSO在本研究中使用的容量本身是无效的。将河豚毒素(TTX)、L-NAME和CCK1R抗体悬浮于无钙PSS中。

2.3。免疫组织化学

用免疫组织化学方法检测CCK1R蛋白在远端结肠的定位。石蜡包埋福尔马林固定组织，切成5μ米厚的部分。揭去抗原后，组织切片用大鼠抗cck1r抗体(1:100)在4℃孵育过夜。PBS反复洗涤后，用抗大鼠二抗PBS/Triton室温孵育1 h，再次洗涤，最后用链霉亲和素过氧化物酶复合物室温孵育20分钟。用二氨基联苯胺染色，苏木精染色。

2.4。结肠平滑肌条的自发收缩

取下远端结肠后，迅速取3厘米片，置于95% O无钙PSS溶液中₂和5%的公司₂的气氛。解剖显微镜下，粘膜及黏膜下层微解剖。两个肌条的宽度约为3毫米,长约8毫米,被平滑肌纤维的方向,包括纵肌(LM)带附近的结肠和LM的远端结肠。将肌条置于两个灌注槽内。每条钢带的一端固定在凹槽底部的玻璃钩上，另一端连接到张力传感器上。将信号输入生理记录仪，记录条带的自发收缩，在1.5 g预负荷下孵育约20分钟。当肌条自发收缩稳定时，加入相应浓度的Evo。

2.5。全细胞膜片钳试验

大鼠处死后，迅速切除远端结肠，置于氧饱和无钙PSS中。解剖显微镜下黏膜及黏膜下层轻微剥落。然后，肌肉条被切成小方块 放入消化液中加热至37℃20-30分钟。消化期结束后，丢弃上清液，用Ca洗涤四次^{2 +}去除PSS以去除酶。单个smc用火焰抛光的巴斯德移液管通过温和的试验分散，并储存在4℃。将细胞悬浮液滴入装有倒置显微镜(Olympus，日本)的灌注室，并使其粘附在灌注室的底部。10分钟后，注入Tyrode缓冲液(1ml /min)。采用全细胞膜片钳技术，使用Axopatch™700B放大器(Axon Instruments, Burlingame, CA, USA)记录l型钙电流。使用微量移液器制作贴片移液管(P97;阻力为4-6米Ω。数据在1khz进行数字化，在800hz进行滤波。所有实验均在室温(22-25℃)下进行。

2.6。统计分析

数据采用spss17.0和pClamp 10.2进行分析，并表示为 。组间的显著差异用成对或非成对学生的量表进行评估 -试验。的average amplitude during the 5 min period before treatment with Evo was measured as the baseline. In the groups pretreated with L-NAME, anti-CCK1R antibody, and TTX, the baseline was the average amplitude after the administration of L-NAME, anti-CCK1R antibody, and TTX. The average peak contraction measured as the amplitude of contraction above the basal level in the 3 min after each Evo treatment was normalized to a standardized ratio (R), in which the baseline of each experiment was equal to 1 (R = response maximal value/baseline).值的显著性设置为0.05。

3.结果

3.1。CCK1R在远端结肠的免疫组化定位

采用免疫组织化学方法测定大鼠远端结肠CCK1R的表达。如图所示1， CCK1R在纵、圆形肌细胞、肌间神经元和粘膜中表达。

3.2。Evo对结肠条收缩活性的影响

Evo抑制正常大鼠结肠LM条的自发收缩。如图所示2， Evo明显降低LM自发收缩的基线振幅。加入Evo前的平均收缩振幅为 。加入埃沃（10和100的后 μM)时，振幅减小为 ( 和控制), ( 分别与控制)。在TTX在场的情况下(1μM)， LM的自发收缩增强，但Evo仍有抑制作用。

3.3。Evo对结肠远端纵平滑肌条一氧化氮合酶(NOS)和CCK1R的影响

如图所示3.， L-NAME预处理后(10μM)或CCK1R抗体(1:10 000)10 - 20分钟，随后应用Evo (10μ米), -LM带的值从 和 来 和 ,分别 （ 与控制)。随后申请100μM Evo, -LM带的值减小为 和 ,分别 （ 与控制)。

3.4。Evo抑制在结肠smc

如图所示4,基于全细胞电压钳记录，在500ms内从- 50mv到+ 20mv的恒定保持电位进行10 mV去极化步骤。浴用Evo(10、100)μM)导致的峰值抑制 。的密度依次减小 (控制) (Evo 10μ米)和 (Evo 100μ米)( 与控制)。

4.讨论

Evo morales在中药中常被用作止痛、止吐、收敛、降压等药物[13]。近年来，许多研究表明Evo可能是治疗肾小管间质纤维化等其他慢性疾病的潜在治疗药物[14],[血管硬化15,缺氧16),神经胶质瘤(17]、动力减退障碍[9，以及ige诱发的过敏性疾病，包括特应性皮炎和鼻炎[18]。熊等[9报道Evo对大鼠空肠收缩性具有刺激作用，显示其在缓解运动机能减退障碍方面的潜在作用。此外，Cao等研究表明Evo降低了大鼠24小时的粪便重量，并抑制了结肠条的运动。胆囊收缩素(CCK)和CCK1R被认为在这些作用中起作用[19]。本研究评价了CCK1R在大鼠结肠中的表达、Evo对结肠条收缩活性的影响以及Evo对结肠SMCs中l型钙通道的影响。我们发现CCK1R在大鼠结肠的SMCs、肌间神经元和粘膜中表达。Evo明显抑制结肠LM条的收缩活性，这种作用被anti-CCK1R抗体和L-NAME部分阻断。Evo还能抑制SMCs的l型钙通道。这些数据首次证明Evo对l型钙通道的调控具有抑制作用，提示Evo参与了大鼠结肠平滑肌钙稳态的调控。

胃肠道是一个复杂的系统。许多因素，包括神经、神经递质、神经肽和激素，都参与调节其功能和活动[20.,21]。据报道，CCK是调节肽家族的一员，可能在调节消化道生理功能中发挥重要作用，主要作用于消化道分布的受体。CCKR是一种G蛋白偶联受体，包括CCK1R和CCK2R。CCK1R主要在外周组织表达，而CCK2R主要在中枢神经系统表达[22- - - - - -25]。CCK1R在消化道的表达介导胆囊收缩、幽门括约肌松弛、胰腺生长和胰酶分泌，抑制胃排空和胃酸分泌[25]。既往研究表明Evo可能作用于消化道CCK释放肽(CCK- rp)，刺激十二指肠细胞分泌CCK，使CCK释放到血液中。血液CCK作用于胃肠道表达的CCK1R，从而抑制胃排空和肠蠕动[8]。在我们的研究中，我们发现CCK1R在大鼠结肠的SMCs、肌间神经元和黏膜中均有表达，抗CCK1R抗体可以部分阻断Evo在体外对大鼠结肠收缩的抑制作用。这说明CCK1R可能与Evo对结肠动力的抑制作用有关。可能还有其他的分子参与了抑制作用。

一氧化氮(NO)是肠神经系统中必不可少的非肾上腺素能、非胆碱能(NANC)神经递质。它由l -精氨酸由神经元NOS (nNOS/NOS- i)生成。NO对胃肠道多个区域的平滑肌有强烈的抑制作用[26]。此外，NO还参与大量的生理功能，如神经传递、血管扩张和胃肠运动[27,28]。多项证据表明NO合成的损害与抗氧化机制的改变和胃肠动力障碍有关[29,30.]。在家兔中，NO可减少平滑肌两层的自发收缩[31]。史密斯与缪尔[32]证明NO可以提高自发电活动的频率和幅度，并增加兔结肠在体外的收缩速度。NO的产生是通过NOS酶的作用介导的，该酶高度定位于大鼠小肠壁的神经和血管成分[33]。为了检验NO是否参与Evo对结肠动力的抑制作用，我们用NOS抑制剂L-NAME处理条带。结果表明，低浓度Evo (10μM)被10预处理阻断μ而高浓度Evo的抑制作用(100)μM)部分受阻。提示L-NAME阻断Evo对肠道收缩的抑制作用可能是可逆的。

此外，为了检查肠内神经元是否参与了这种效应，我们用TTX处理了条带。结果表明，两种抑菌效果均较低μ和高浓度Evo (100μM)在1预处理时仍然存在μM TTX。因此，肠神经可能不是Evo对肠道运动抑制作用的主要参与方，而CCK1R和NOS可能起主要作用。

已知的是，增加的[Ca^{2 +}]_我导致与钙调蛋白结合并激活肌球蛋白轻链激酶，是收缩的主要刺激因素[34]。l型钙通道是调节胃肠平滑肌收缩的主要离子通道。钙通道的开放增加了钙离子的内流，使细胞膜去极化，从而促进平滑肌收缩。结肠l型钙通道表达上调与结肠运动障碍有关[35]。此外，泉等。[12发现硫化氢可以通过抑制大鼠结肠平滑肌细胞中的l型钙通道和BKCa通道来调节结肠运动。但Evo对大鼠结肠的松弛作用是否直接抑制l型钙通道尚不清楚。为了调查这种可能性，我们检查了Evo对 。我们发现Evo具有抑制作用 。进一步，的I-V曲线的形状显着改变，这表明L-型钙通道的电压门控由埃沃修改。以前的研究表明，人胆囊平滑肌的松弛主要是由ATP敏感性钾通道（KATP）介导的[36]。此外，许多研究表明，K的活化⁺位于平滑肌通道也起着在松弛作用对由硫氢化钠介导的胃肠道平滑肌中起重要作用[37- - - - - -39]。是否K⁺这些通道参与Evo对大鼠结肠运动的抑制作用尚待研究。

5.结论

综上所述，Evo在大鼠结肠SMCs中抑制l型钙通道。Evo对结肠动力的松弛作用部分是直接或间接抑制l型钙通道所致。这些数据首次证明Evo可能介导SMCs的钙稳态，从而在调节大鼠结肠运动中发挥关键作用。然而，K⁺Evo对大鼠结肠的松弛作用机制有待进一步研究。

数据可用性

用于支持本研究的结果的实验​​数据是请直接从相应的作者。

的利益冲突

作者无利益冲突需要申报。

致谢

这项工作得到了浙江省台州市科技计划项目(批准号1701KY40)的资助。

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