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研究论文|开放存取
基因多态性的协会与FOXA1遗传易感性的进展为胃癌
郭雯叮
,1
缠绵顾,2
戴喆,1
Hui-wen锅,1
已经以王
,3.
亨张,4
和
羽凡1
1江苏大学附属人民医院胸外科，江苏镇江212002
2肿瘤科，江苏大学附属人民医院，江苏镇江212002，中国研究所
3.中国江苏省宿迁市第一人民医院消化科
4南京丽水区人民医院普外科东南大学中大医院丽水分院，南京211200
摘要
客观的。目的探讨FOXA1基因rs12894364和rs7144658多态性与胃癌易感性的关系。方法。选择577例原发性胃癌患者和678例正常对照患者进行病例对照研究。提取全血基因组DNA，用PCR扩增目的基因片段。采用快照法进行基因分型和等位基因检测。结果。病例组与对照组基因型频率分布无显著差异( )。分层分析表明，不同年龄、性别、是否吸烟、是否饮酒与GC的易感性无相关性。结论。有FOXA1基因rs12894364的多态性和rs7144658与胃癌风险之间没有显著相关性。
1.介绍
胃癌是中国最常见的恶性肿瘤之一。由于其起病隐匿和目前缺乏有效的早期诊断分子标记物，经常发现患者要先进，导致5年生存率 (1,2]。因此，发现参与胃癌发生发展的重要分子并研究其机制对胃癌的早期诊断和治疗具有重要意义。随着第三代遗传标记技术的发展，对胃癌发病机制的研究和探索得到了进一步发展。单核苷酸多态性(SNP)分析是研究复杂疾病和群体遗传识别的重要方法之一。肿瘤相关基因多态性的研究可能为肿瘤治疗提供新的预测因子和干预靶点。
叉头框蛋白（FOX）是高度保守在进化。每个构件具有一个叉头框（或翼）的长度为约110个氨基酸的DNA结合结构域。肝细胞核因子3α（HNF3a）是蛋白质的叉头家族的第一个成员在哺乳动物中发现。它被命名为FoxAl [3.]所需的个人成长和发展。它在定形内胚层中表达（如肝，肺，胰腺），中胚层（如肾脏，子宫，乳腺），和外胚层（例如脑，嗅上皮）在成人组织中，并发挥不同的功能[4]。FoxAl与多种临床肿瘤的发生进展关系密切[5- - - - - -8]。然而FoxAl在胃癌发生发展中的作用尚不清楚。胃癌组织中FOXA1蛋白和mRNA水平明显高于癌旁组织。此外，临床关联分析显示，FOXA1阳性表达与胃癌患者临床病理特征差有关，如肿瘤分化差、肿瘤体积大、淋巴结转移晚期等。值得注意的是，FOXA1阳性表达胃癌患者的5年总体生存率和无复发生存率较差。体内研究表明，在裸鼠异种移植模型中，FOXA1的表达显著抑制了胃癌肿瘤的生长。因此，FOXA1可能是一种很有前途的胃癌预后指标和有吸引力的治疗靶点。FOXA1在胃癌中的临床意义及其生物学功能尚不清楚。因此，本研究采用病例对照的方法，比较FOXA1基因rs12894364和rs7144658在胃癌患者和健康对照组中的基因型和等位基因，分析FOXA1基因多态性与胃癌易感性的关系。同时结合患者的性别、年龄、吸烟史、饮酒史等临床参数，综合分析两者的相关性，为胃癌的早期筛查和早期治疗提供理论依据。
2.研究对象与方法
如前所述，2013年5月至2017年6月，从江苏大学附属人民医院连续招募577例胃癌患者和678例无癌对照。本研究经江苏大学附属人民医院伦理委员会批准。从患者和对照组获得书面知情同意。通过问卷调查和病历收集患者的临床资料。收集每位受试者外周血(2ml)。按照说明书从外周血中提取DNA。PCR扩增产物经ExoI和FastAP纯化后进行扩增。延长反应结束后，用ABI3730XL测序检测分型。采用快照法检测基因多态性，随机抽取5%的样本进行复检，以保证检测结果的准确性。
GC组样品采用随机抽样法选取。利用sample power软件估计样本含量，选择小等位基因频率(MAF)大于5%，变异基因型频率约为8%及以上，统计检验准确率为80%，同时双侧检验显著性水平 。根据功率和样本大小计算软件，的比值比（OR）为约1.23 / 0.81。随机选择的GC样本规模在这项研究符合要求。
本研究采用病例对照研究，运用logistic回归模型分析一个或多个原因对一个分类结果的影响，并计算一个关键指标or。在单变量和多变量分析中，检查FOXA1和其他变量之间的相关性。分别研究了性别、年龄、吸烟和饮酒的独立影响，并分别研究了性别、年龄、吸烟、饮酒和群体间分层的影响。
3.统计方法
数据分析采用SPSS 20.0 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)。用卡方分析检验检验多态性在病例和对照组的分布是否符合哈迪-温伯格平衡。我们使用logistic回归来计算归属于SNP基因型和等位基因的GC风险。
4.结果
表格1显示，rs12894364和rs7144658位于14号染色体。他们类别的蛋白质编码。在我们的控制rs12894364的次要等位基因频率（MAF）为0.119。在我们的控制Hardy-Weinberg平衡测试是0.659（ ）这意味着样本总体具有代表性。我们使用快照方法，基因分型和试验成功的比例为98.73％。rs7144658的次要等位基因频率（MAF）对中国在genecard数据库是0.121，并在我们的控制是0.116。在我们的控制Hardy-Weinberg平衡测试是0.940（ ）这意味着样本总体具有代表性。采用快照法进行基因分型，成功率为98.65%。
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一个MAF：最小等位基因频率。bHWE:哈迪温伯格平衡。 |
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表中的结果2显示了研究对象的特征，包括人口统计和环境风险因素。病例组吸烟率明显高于对照组(34.49%对27.29%， )。人口结构（年龄和性别）是很好的匹配（ 和 ,分别;表格2)。提示吸烟和胃癌的发生发展。在酒精摄入量方面，GC患者与对照组之间并无显著差异( ,表格2)。
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在胃癌的FOXA1基因多态性rs12894364和对照组的频率分布和logistic回归分析显示，与参照野生型CC，TC杂合突变的频率分布不是两组间统计学显著（ )并有回归调整后的性别，年龄，吸烟，饮酒无统计学差异（ ）;TT纯合子突变的频率分布也无统计学显著（ ）并有回归调整后差异无统计学意义（ )。在主导模式，TC + TT突变的频率分布情况并非如此，对照组中有统计学显著（ ）和差异不回归调整后统计显著（ )。在隐性模型中，频率分布无统计学差异( )。根据性别、年龄、吸烟、饮酒情况进行logistic回归分析，两组间仍无统计学差异( )(表3.)。
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FOXA1 rs7144658在胃癌和对照组中的频率分布及logistic回归分析结果显示，以野生型TT为参考型的两组间差异无统计学意义( ）经性别、年龄、吸烟、饮酒等因素调整logistic回归分析，差异无统计学意义( )。CC纯合突变体( ）并有Logistic回归分析后无统计学差异显著（ )。显性模型\隐性模型的分布无统计学差异( )。根据Logistic回归分析，仍有差异无统计学意义（ ;0.915)(表4)。
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与C等位基因在rs12894364的频率分布相比，T等位基因是病例组中比对照组高（ ），差异无统计学显著（ )。rs7144658等位基因的频率分布情况并非如此，对照组中有统计学显著（ )(表5)。
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根据分层的结果，FOXA1的多态性rs12894364表明，与野生型CC作为参考基因型的野生型TC，TT纯合子，占主导地位的模型，并且在女性组隐性模型均无统计学显著（ , , , )。野生型TC、纯合子TT、显性模型和隐性模型在性别、吸烟或饮酒组之间无显著差异(见表)6)。
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FOXA1基因rs12894364在577例和678例对照中分型成功率为99.20%。 |
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FOXA1 rs7144658多态性分层结果显示，以野生型TT为参考基因型，我们发现野生型TC、纯合型CC、显性模型和隐性模型在女性组中均无统计学意义( , , , )。在性别、吸烟、饮酒组中，野生型TC、纯合子CC、显性模型、隐性模型差异无统计学意义(见表)7)。
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FOXA1基因rs7144658在577例和678例对照中分型成功率为99.60%。 |
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5.讨论
胃癌是一种多因素疾病，包括饮食习惯，遗传因素，环境因素，免疫因素，感染和炎症。这些因素不可避免地导致某些信号传导途径，其密切相关的胃癌的生长和调节因子的不平衡。的发生和肿瘤进展是从转录因子的调控分不开的。该FOXA家庭密切相关的发生，增殖，侵袭和转移的恶性肿瘤。FOXA1是FOX家族的重要成员，广泛分布于全身。FOXA1结合靶基因的染色体的启动子区，从而导致核小体结构，其促进的其它转录因子的结合靶基因的启动子区域，并促进靶基因的转录的重组。因此，FOXA1起着不同的生物过程，如器官发育，机体代谢和肿瘤发生[中起重要作用9]。在前列腺癌，甲状腺癌，神经胶质瘤和研究表明，FOXA1在肿瘤组织中高表达，与肿瘤分级，浸润，转移及预后差的显著相关性，在促进肿瘤发生和发展[作用10- - - - - -12]。然而，在乳腺癌和子宫内膜癌的研究，发现FOXA1的阳性表达率显著负患者的预后较差，这在抑制肿瘤的发展[发挥作用相关13,14]。上述结果表明，FOXA1在肿瘤的发生发展中的作用是具体的。在不同的肿瘤组织，FOXA1能起到促进或抑制肿瘤的发展中的作用。
但是FOXA1在胃癌组织中的生物学功能尚不清楚。与邻近肿瘤组织相比，胃癌组织中FOXA1的mRNA和蛋白水平明显升高。此外，更重要的是揭示FOXA1的阳性表达与胃癌患者临床病理特征差、预后差有关。因此，FOXA1有望成为一种新的在预测胃癌患者临床结局方面具有重要价值的生物标志物。FOXA1在胃癌中的潜在致癌作用促使我们对其生物学作用进行研究。先前的研究[15,16]已经证实，FOXA1是一个叉头转录因子调节染色质结构和募集其它转录因子以促进下游靶转录。在功能上，FOXA1是细胞增殖，细胞周期和细胞凋亡的重要调节剂。在体外和体内研究已证明，FOXA1抑制能抑制增殖并诱导胃癌细胞凋亡[17- - - - - -19]。因此，我们的数据表明FOXA1通过促进细胞增殖和凋亡的防止在胃癌的致癌作用。河马-YAP信号通路已经发现打在胃癌中起关键作用。YAP的表达已被证实比与正常胃粘膜一致前人研究的显著较高[20- - - - - -23]。YAP调节增殖和胃癌细胞凋亡[24- - - - - -26]。因此，YAP被视为用于胃癌的治疗靶标。有趣的是，最近对肝癌的研究癌表明FOXA1可以打开在启动子YAP围绕CREB结合位点的染色质致密和促进CREB介导的转录YAP，导致YAP的表达增加在HCC细胞中[27]。因此，我们假设，FOXA1可能通过调节YAP的表达[调节胃癌细胞的增殖和凋亡21]。FOXA1特异性shRNA抑制胃癌细胞FOXA1表达，显著降低FOXA1 mRNA和蛋白水平。这些结果提示FOXA1可能通过调控胃癌细胞YAP的表达来调控细胞的增殖和凋亡。靶向治疗和GC的基因组谱也有靶向性，但它们的生物学效应仍然部分模糊。目前，FOXA1基因多态性的研究大多围绕2型糖尿病和乳腺癌展开[28,29]。张某等人。(三十等研究发现FOXA1基因rs4442975位点在中国人群中与乳腺癌风险无关，在ER、PR、吸烟、饮酒和绝经分层的所有亚组中也出现了阴性结果。FOXA1基因多态性与胃癌的关系尚未见研究。
基于上述背景，本研究中检测到FOXA1基因rs12894364和rs7144658的原发性胃癌组和对照组中的多态性。在现场的基因型频率分布与对照组中的哈迪 - 温伯格平衡定律一致，并将样品仍然被认为具有良好的人口代表性。使用病例对照研究的关联分析，发现，rs12894364和rs7144658的等位基因频率不是这样组和对照组之间有统计学差异。比较其基因型频率分布和基因模型，也有病例组和对照组差异无统计学意义。这个结果并不能证明FOXA1基因是胃癌易感基因。我们的研究结果表明FOXA1 rs12894364和rs7144658多态性不与不同年龄GC的改变易感性，性别，吸烟和饮酒状况有关。
本研究的阴性结果可能受到以下因素的影响:样本量小，遗传标记位点不足，以及存在其他偏倚。胃癌是由环境因素和特定基因变化的积累共同引起的。饮食因素在胃癌，尤其是肠腺癌的发生发展中起着重要作用。另外，由于肿瘤的异质性，胃癌的不同病理类型和分期也可能导致结果的偏差。根据Lauren型胃癌分为肠道型、弥漫型和混合型，FOXA1在不同类型胃癌中的表达状态不同。同时，Epstein-Barr病毒(EBV)感染HP是胃癌发生的危险因素[31,32]。因此，本研究结果可能具有一定的局限性，不能完全排除FOXA1基因与胃癌的相关性。此外，考虑基因-基因相互作用和基因环境相互作用在许多疾病特别是慢性疾病的发病机制中[33]中，FOXA1基因多态性可能与其他基因多态性或环境因素。这种相互作用影响胃癌的人类发病。有人建议，分析基因 - 基因相互作用和基因与环境相互作用的进一步研究在未来，为胃癌的发病机制的进一步证据。
数据可用性
用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。
伦理批准
本研究获得了江苏大学伦理审查委员会的批准。
同意
所有患者均提供书面知情同意书。
的利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
作者的贡献
徐宇顾是共同第一作者。
致谢
本研究得到江苏省重点研发专项基金BE2015666、江苏省创新团队领军人才基金CXTDC2016006、江苏省六大高峰人才基金WSW-205、江苏省333人才基金BRA2016140、卫计委重点项目基金SHW2017005资助。此外，作者感谢所有参与这项研究的人。
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