肝脂肪变性对PEG-IFN抗病毒作用的影响α-2a在慢性乙型肝炎患者中的作用及其机制

摘要

客观的。探讨慢性乙型肝炎(CHB)肝脂肪变性的危险因素，确定其与肝坏血性炎症、纤维化及对peg干扰素阿尔法-2a (PEG-IFN)的反应的相关性α-2a)抗病毒治疗，探索PEG-IFN抗病毒效果差的机制α-2a在CHB肝脂肪变性患者中的作用方法。我们分析了肝脂肪变性对PEG-IFN抗病毒作用的影响α对226名接受治疗前肝活检的CHB患者进行-2a的研究。226例患者接受PEG-IFN治疗，以评估完全缓解(CR)、病毒学缓解(VR)和生化缓解(BR)α-2a, 48周，随访24周。检测所有患者肝组织中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的表达情况，探讨肝脂肪变性抗病毒作用的可能机制。结果。根据肝脂肪变性的严重程度，将患者分为四组:无脂肪变性119例，轻度脂肪变性76例，中度脂肪变性22例，重度脂肪变性9例。在肝脂肪变性组中，男性患者，年龄为>40岁的患者，高尿酸血症患者，a型肝炎患者的比例 ,总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、尿酸(UA)水平显著高于无脂肪变性组，而丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)水平显著低于无脂肪变性组。多因素分析结果显示a 与CHB患者肝脂肪变性独立相关;基线AST和UA水平与CHB患者显著肝脂肪变性独立相关，而基线AST水平与显著肝纤维化独立相关。经过48周的治疗和24周的随访，CR、VR和BR的比率逐渐降低，而肝脂肪变性的严重程度却增加了。结论。肝脂肪变性可降低PEG-IFN的疗效α-2a在CHB患者治疗中的作用，其机制可能与肝组织中不同的HBcAg表达模式有关。

1.介绍

慢性乙型肝炎(CHB)和非酒精性脂肪肝(NAFLD)是我国两种主要的慢性肝病。随着生活方式和饮食结构的改变，CHB肝脂肪变性患者数量增加。世界各地的发病率差异很大，波动在27%至51%之间[1,2]，其中的28％的中值流行。1915年肝活检的情况下在中国的一份报告显示，肝脂肪变性的慢性乙型肝炎患者的发病率为14％[3.]。CHB合并肝脂肪变性是否会加重肝脏疾病的进展尚不清楚。国外学者对64例CHB肝脂肪变性患者进行了肝脏活检，86%的患者存在不同程度的纤维化[4]。其中39%发生进行性肝纤维化，但未建立对照组。Altlparmak等对164例CHB患者的研究[5]相比，病人有无肝脂肪变性和建议，有炎症和纤维化评分两组间无显著差异。另一项研究由陈和施[6报道CHB患者肝脂肪变性程度与肝脏炎症和纤维化呈负相关。关于肝脂肪变性对抗病毒治疗的影响的数据很少，特别是在聚乙二醇干扰素阿尔法-2a (PEG-IFN)方面α-2a)治疗CHB。早期的一些研究显示，在CHB患者中，肝脂肪变性与抗病毒效果没有显著联系[7,8]。然而，一些新的研究表明，脂肪肝可能降低治疗的抗病毒疗效的慢性乙肝患者[9- - - - - -11]。进一步研究肝脂肪变性和CHB患者抗病毒作用之间的潜在关系是必要的。本前瞻性队列研究评估了CHB患者四种不同程度的肝脂肪变性，以研究肝脂肪变性对CHB病理的影响，以及肝脂肪变性是否影响PEG-IFN的疗效α2 a。因此，本研究通过比较不同组肝细胞中乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBcAg)的表达模式，探讨肝脂肪变性影响PEG-IFN疗效的可能机制α2 a。

2.材料和方法

2.1。病人

本前瞻性队列研究纳入了2010年5月至2016年在厦门中医医院接受经皮肝穿刺活检的245例初发CHB患者。所有患者均行经皮肝穿刺活检，经肝组织学病理检查证实其肝组织存在或不存在脂肪变性。患者接受PEG-IFN治疗α-2a 48周，随访24周。6例患者因甲状腺功能异常被排除，8例患者因外周血中性粒细胞绝对计数被排除 ,5例患者因移民而失访。剩下的226名患者组成了研究队列。根据肝脂肪变性严重程度将患者分为4组:无脂肪变性119例(S0组)，轻度脂肪变性76例(S1组)，中度脂肪变性22例(S2组)，重度脂肪变性9例(S3组)。所有患者均定义为HBsAg和hbcag阳性至少6个月，基线HBV DNA水平超过20,000 IU/mL, ALT水平升高为正常(ULN)上限的2 - 10倍，肝脏组织病理学结果显示脂肪变性。排除有酒精摄入>140 g/周史、伴随病因包括慢性丙型肝炎或慢性丙型肝炎合并或重复感染、自身免疫性肝炎、药物性肝损伤、HIV合并感染或免疫抑制证据的患者。研究方案经厦门市中医医院伦理委员会批准。所有患者均知情同意。基线预处理评估包括收集年龄、性别、病程、身高和体重、肝脏炎症活动度、纤维化分期等数据[12];测定HBV DNA水平;乙型肝炎病毒基因型检测;定量检测HBV - e抗原(HBeAg)、HBsAg、ALT、AST、CHO、TG、GLU、UA水平。所有资料在厦门市中医医院中心实验室进行评估。采用COBAS TaqMan HBV试验(罗氏Lightcycler荧光定量PCR系统，中国上海)，以500 IU/mL为低检出限，采用荧光定量PCR检测HBV DNA载量。采用Roche Elecsys 2010系统(German Roche Diagnostics Ltd, Germany)进行电化学发光免疫测定，定量HBsAg、HBsAb、HBeAg和HBeAb水平。采用PCR反向斑点杂交法(深圳亚能生物技术有限公司)检测HBV基因型。

2.2。肝活检组织学和

所有患者都同意接受肝活检。超声引导下用16G活检针行肝脏活检。合格的活检标本至少1.5 cm长，或显示6个或更多门管区。标本固定，石蜡包埋，苏木精和伊红染色(HE染色)。采用Scheuer’s评分系统对G0 ~ G4组织学坏死性炎症和F0 ~ F4纤维化分期进行半量化，由两名病理学家独立完成，对患者的生化和病毒学结果不知情。对所有标本进行马尾松三色染色以评估其纤维化程度。组织切片从准备好的有代表性的组织块(块)中切成4mm的样品，然后放入石蜡烤炉去除大部分石蜡。为完成脱蜡，标本经二甲苯和一系列酒精稀释5分钟，并经抗原提取微波处理10分钟。浸泡在3% H的甲醇溶液中₂O₂为了阻断内源性过氧化物酶5分钟，使用过氧化物酶共轭的Envision试剂盒(Envision- po, Envision System;将兔一抗应用于标本肝细胞内HBcAg的免疫组化染色。

肝脂肪变性的分类如下:无脂肪变性(脂肪变性影响不到5%的肝细胞，S0)、轻度脂肪变性(脂肪变性影响5-33%的肝细胞，S1)、中度脂肪变性(脂肪变性影响34-66%的肝细胞，S2)和重度脂肪变性(脂肪变性影响66%以上的肝细胞，S3)(图)1）13]。

HBcAg表达模式分为:无HBcAg表达(hbcg阴性)、细胞质表达(cHBcAg)、细胞质显性表达(cdHBcAg)、细胞质和核平均表达(mHBcAg)。

HBcAg-negative类型没有HBcAg表达肝细胞的细胞核或胞浆,cHBcAg类型显示HBcAg表达式只有在细胞质中但不是在肝细胞的细胞核,cdHBcAg类型显示,超过2/3的HBcAg表达式在细胞质中,和mHBcAg类型显示,50% HBcAg表达肝细胞的细胞核和细胞质的50%(图2）14]。

本研究将HBcAg表达强度分为4种类型:0分，低于5%的乙肝核心抗原表达;1点，5%-33%的乙肝核心抗原表达;2分，乙肝核心抗原表达34%-66%;3分，乙肝核心抗原表达超过66%(图)3.）15]。

本研究将HBsAg表达强度分为3种类型:1点，乙肝表面抗原表达5%-33%;2分，乙肝表面抗原表达34%-66%;3分，乙肝表面抗原表达超过66%(图)4）15]。

2.3。抗病毒治疗

所有患者均接受180处理 μPEG-IFN的g iHα-2a (Pegasys, Roche)，每周一次，共48周，根据医生发现的任何不良反应调整剂量。启动PEG-IFN后α-2a治疗，每4周在门诊随访一次。除常规生化检测外，在基线和第12、24、48、72周分别对血清HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和HBV DNA进行定量。完全缓解(CR)的定义为:治疗后48周及24周随访时，血清HBV DNA水平低于500 IU/mL, ALT水平正常(< 40iu /L)， HBeAg血清转换(HBeAg丢失及anti- hbe阳性)。病毒学反应(Virological response, VR)定义为血清HBV DNA水平低于500iu /mL。生化反应(BR)定义为ALT和AST水平恢复正常。以下病例在治疗期间停止:难以耐受副作用的患者和拒绝继续抗病毒治疗的患者。以下病例在24周随访中停药:ALT水平升高>10倍ULN的患者;拒绝继续随访并改用核苷类似物(NAs)治疗的患者。

2.4。统计分析

所有的统计分析使用SPSS 22.0软件(IBM公司，阿蒙克，纽约，美国)进行。连续变量表示为 （或中值和范围）和曼 - 惠特尼检验用于比较非参数连续变量。分类变量以频率和百分比表示，并采用卡方检验进行分析。分组与结果的相关性采用Spearman秩相关分析。采用多变量logistic回归确定完全缓解率与相关因素之间关系的独立预测因子。一个双边< 0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1。CHB患者不同程度肝脂肪变性的基线特征

基线特征列于表中1。根据肝脂肪变性程度将患者分为四组。慢性乙型肝炎合并肝脂肪变性的患者多为男性，年龄>40岁，有肝脂肪变性病史 ,是否存在高尿酸血症，TC、TG、GLU、UA水平较高，ALT、AST水平较低，如表所示1。

连续变量表示为 或中位数(四分位范围)，和分类变量被计数和比例描述。皮尔逊卡方检验和学生卡方检验 -测试进行统计分析。缩写：TC：总胆固醇;TG：甘油三酯;UA：尿酸;GLU：葡萄糖;ALT：丙氨酸转氨酶;AST：谷草转氨酶，乙型肝炎病毒：乙肝病毒;BMI：身体质量指数。

3.2。肝脂肪变性与肝组织坏死性炎症、纤维化分期的关系

基线肝组织坏死性炎症和肝细胞脂肪变性阶段呈负相关。更严重的脂肪肝是，不太严重的肝脏炎症活动（表2)。肝纤维化程度与肝脂肪变性无相关性(见表)3.)。

分类变量用计数和比例来描述。统计分析采用皮尔逊卡方检验、Spearman秩相关分析和列联系数。

分类变量用计数和比例来描述。统计分析采用皮尔逊卡方检验、Spearman秩相关分析和列联系数。

3.3。与显著组织学异常相关的危险因素

临床参数(性别、年龄、病程、基线TC、基线TG、代谢综合征、基线ALT、基线AST、基线HBV DNA、 ,基线UA、GLU进行多变量回归分析，并与肝脏组织学异常相关(表)4)。 ( )与CHB患者的肝脂肪变性独立相关。基线AST ( )和基线UA（ )与CHB患者显著的肝脂肪变性独立相关基线AST ( )独立与慢性乙型肝炎患者显著纤维化相关。

3.4。PEG-IFN治疗后肝脂肪变性与VR、BR、CR率的相关性研究α2治疗

观察治疗48周后四组患者的VR、BR、CR率。四组患者的VR、BR、CR率差异有统计学意义( )。肝脂肪变性越严重，VR、BR和CR率越低(表)5)。

分类变量用计数和比例来描述。统计分析采用皮尔逊卡方检验。

3.5。24周随访后肝脂肪变性与VR、BR、CR率的相关性

在24周的随访中，有13例患者出现ALT水平升高>，10次ULN停止随访，改为NAs治疗，有7例患者打算接受NA治疗，所以退出继续随访。206例患者完成随访。

在四组观察到的VR，BR，和CR率随访24周后。四组患者的VR、BR、CR率差异有统计学意义( )。肝脂肪变性越严重，VR、BR和CR率越低(表)6)。

分类变量用计数和比例来描述。统计分析采用皮尔逊卡方检验。

3.6。肝脂肪变性与HBcAg、HBsAg表达的相关性研究

四度肝脂肪变性具有不同的HBcAg表达模式。S0组hbcag阴性和c-HBcAg率为43.70%，而S1、S2、S3组分别为31.58%、31.82%、33.33% ( )(表7)。然而，HBsAg和HBcAg的表达水平没有显著组（表之间不同8和9)。

4.讨论

在本研究中，我们比较了不同程度肝脂肪变性的CHB患者的基线临床资料。肝脂肪变性的CHB患者TC、TG、GLU、UA、BMI水平较高;属于女性;年龄>40岁;有没有高尿酸血症和a ;与无肝脂肪变性者相比，谷丙转氨酶和谷草转氨酶显著降低。随着肝脂肪变性程度的增加，UA、TG及高尿酸血症的发生率逐渐升高，而40岁以上患者比例逐渐降低。CHB和肝脂肪变性的联合存在与代谢紊乱有关，并已导致糖尿病、动脉粥样硬化和心脑血管事件[16- - - - - -18]。>40岁的患者比例逐渐下降，肝脂肪变性程度越高，提示随着年龄增长，脂肪细胞坏死，肝纤维组织逐渐增生。

多因素Logistic回归分析表明， 是CHB合并肝脂肪变性的独立危险因素，提示超重或肥胖是CHB合并肝脂肪变性患者的重要特征，已经引起或可能与胰岛素抵抗增加有关[19,20]。胰岛素抵抗会损害周围组织对葡萄糖的吸收利用能力，导致肝脏中大量的TG沉积，导致肝脂肪变性的形成。此外，多因素logistic回归分析显示，AST和UA基线水平是CHB合并显著肝脂肪变性的独立危险因素( ),和基线AST水平的显著肝纤维化的独立危险因素（ )。有四组之间HBV DNA滴度无显著差异，这表明HBV的复制不与肝脂肪变性的存在相关联。

在这项研究中，我们提出我们的调查结果，即更高程度的脂肪肝与肝组织炎症水平较低有关;此外，有肝纤维化的程度和肝细胞脂肪变性程度之间没有相关性。一位国内研究[15研究表明，肝脏脂肪变性程度高导致肝脏炎症程度降低的机制可能是肝脂肪变性减弱肝组织内HBsAg和HBcAg表达强度的能力。从而降低了病毒蛋白激活细胞免疫反应的能力，减少了感染肝细胞的破坏，引起轻微的肝炎症。

但我们研究了不同肝脏脂肪变性严重程度组内HBsAg、HBcAg表达水平的差异，发现不同肝脏脂肪变性严重程度组间HBsAg、HBcAg表达水平无显著差异。此外，我们证明了HBcAg表达模式与肝脂肪变性相关。无脂肪变性组中，43.70%的患者为hbcg阴性和c-HBcAg，而脂肪变性组中31.77%的患者为hbcg阴性和c-HBcAg。一项研究[14]表明，在慢性乙型肝炎患者的肝组织中HBcAg阴性和c-的HBcAg的表达模式通常发生在免疫清除和活性肝脏炎症的阶段，而CD-HBcAg的组和m的HBcAg组中的往往免疫耐受阶段，并有轻度肝脏炎症，从而导致较低的抗病毒效果。因此，PEG-IFN的作用α-2a慢性乙型肝炎患者的肝脂肪变性较差。我们的研究比较VR，BR，和CR 48周的治疗和随访24周后的四度肝脂肪变性之间的比率。有四组之间的差异显著。随着细胞脂肪变性程度的增加，VR，BR，和CR的发生率显著下降。因此，我们要采取有效措施，预防和治疗脂肪肝的改善PEG-IFN的功效α2 a。

综上所述，CHB脂肪变性患者的ALT、AST水平及肝组织炎症活性均明显低于无脂肪变性患者;这可能是由于肝组织中hbcb -阴性和c-HBcAg型低表达导致免疫应答不良，最终导致抗病毒效果不佳。使用PEG-IFN进行抗病毒治疗α-2a不适用于有肝脂肪变性的CHB患者。相反，肝脂肪变性主要与性别、基线TC、TG、UA、GLU、BMI有关，但与HBV DNA载量无关。因此，我们可以提高PEG-IFN的临床疗效α-2a CHB患者与由控制体重，戒酒，饮食调整，和胰岛素抵抗改善肝脂肪变性。

本研究存在一些局限性。我们评估了PEG-IFN的疗效α2治疗48周和24周的药物戒断没有评估药物戒断的持续48周的功效又因为一些病人需要抗病毒治疗由于显著升高血清ALT和AST水平在停药后超过24周,将会导致一个大的辍学率。我们的研究是在一个单一的中心进行的，缺乏足够的样本，特别是在严重脂肪变性组。因此，今后应多中心、平衡各组人数、大样本研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在本文中。

的利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金(No. 81673660, No. 81873242)、国家科技重大专项(No. 2017zx10202201)、福建省卫生与计划生育医学创新研究人才培养项目(No. 2018-CXB-28;第2018-2-68号)、厦门市科技计划资助项目(第3502Z20174028号)、中国第六批中医药专家小组厦门市重大疾病项目(第3502Z20179047号)联合研究(2017)。

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