参考基因及蛋白表达水平在两个不同的NAFLD小鼠模型

抽象

的一些参考基因和蛋白表达水平被用于数据归一化和量化。然而，这些水平可以响应实验条件或治疗改变。目标。这项工作的目的是评估在非酒精性脂肪肝疾病的模型参考基因和蛋白表达，使用小鼠用高脂肪饮食（HFD）的小鼠和馈送是遗传性肥胖（的ob / ob）。主要方法。组织学染色技术被用来验证的形态和量化存在于肝中脂滴的量。实时聚合酶链式反应和免疫印迹用于分别监测蛋白表达和基因表达水平。主要发现。结果表明相比于标准饮食（SD）组时，有大幅提高脂滴的量在HFD的肝脏和的ob / ob动物。有在的表达观察到的还原β肌动蛋白（10％），α所述的ob / ob组相比于HFD组时微管蛋白（6％），GAPDH（19％），和RPL3（15％）的基因。此外，该ob / ob小鼠显示的是基本的，但不显著，相比SD时降低GAPDH蛋白水平。意义。得出的结论是有在的参考基因和蛋白质在这两个NAFLD动物模型中表达水平的细微差别，以及与这些模型时研究人员应该考虑到这些变化。

1.简介

定性和定量分析，基因和蛋白质表达，依靠的参考基因和蛋白质在所分析的样品中的恒定水平表达的存在。不适当内对照会损害结果的准确性和可靠性。这是因为这些基因和蛋白通常用于标准化数据和正确的实验误差，因此允许基因和/或蛋白质表达[的直接比较1]。

先前的研究已经表明，一些内部控制的表达而改变，这取决于实验条件。例如，的表达水平β肌动蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），和ββ-微管蛋白被证明在某些肿瘤[以增加1，2]，而诸如阿尔茨海默氏病，酒精性肝炎，肝硬化，精神分裂症和其他条件已经牵连在改变内源参考基因和/或蛋白质[表达式3，4]。此外，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）也已经显示出改变用于标准化基因表达水平[参考基因的组成型表达五]。

在以前我们的研究组，高脂饮食和ob / ob小鼠，这是我们作为NAFLD模型进行的研究中，它被用来作为组成的β肌动蛋白用于蛋白质表达和β2微球蛋白（B2M），用于基因表达6]。作为结果，可以看到这些组成基因和蛋白质均适用于这些模型实验，并有在NAFLD组成没有使用标准化的研究，我们着手调查不同的基因和蛋白质。

基于该模型NAFLD研究使用不同的组成基因和蛋白质的基因和蛋白表达，有的使用β肌动蛋白和其他GAPDH和α微管蛋白;没有标准的组成基因和蛋白质的模型[7-9]。

在此基础上，本研究的目的是分析在由高脂肪饮食（HFD）或遗传性肥胖（ob / ob小鼠）触发肝脂肪变性模型的一些通常使用的内源性对照的基因和蛋白表达水平。结果将在每个控制的效用的角度来讨论，并提供关于参考基因和蛋白质的选择与这些模型时的建议。

2.材料和方法

我们跟着Layanne C.达C.阿劳霍等人的方法。[6]。

2.1。动物

Male C57BL/6 mice, weighing 20-25 g, were obtained from the vivarium at the University of São Paulo (USP) Medical School and maintained in a temperature controlled room at 。The mice had free access to food and water and were subjected to a 12-hour light-dark cycle (lights on from 6 am to 6 pm). The genetically obese ob/ob mice, weighing 55-60 g, were obtained from the Department of Physiology and Biophysics at the Institute of Biomedical Sciences of USP (ICB-USP) and kept under the same conditions as described above. Each group consisted of 10 animals and the statistical analysis performed considered at least 5 animals per group. Standard diet (SD) consisted of commercial rodent chow (Nuvilab® CR-1, Curitiba, Parana, Brazil), which contained 22% protein, 61% carbohydrate, 4.5% fat, 8% cellulose, and 4.5% vitamins and minerals, providing 3.2 kcal/kg chow. The HFD chow (PragSoluçoes Biosciences, Jau, Sao Paulo, Brazil) consisted of pellets containing 20.3% protein (15% kcal/kg), 36% carbohydrate (27% kcal/kg), 34% fat (57% kcal/kg), 4.7% vitamins and minerals (0.7% kcal/kg), and 5% fibers. The animals were fed with HFD for 8 weeks. All experimental procedures were performed following the principles of the “Guidelines for the ethical use of animals in applied etiology studies” [10]而这项研究之前由伦理委员会对动物使用的ICB-USP批准（第035协议，在第30页，书03）。

3.肝脏形态

3.1。苏木和伊红染色

为了评估肝脏形态，将样品置于单独的盒，固定在10％甲醛溶液8小时，转移到70％乙醇，并储存过夜。然后将样品通过在95％乙醇和100％乙醇和二甲苯中的一系列浴的脱水。以下脱水，将组织样品在60℃在石蜡中包埋。切片机（蔡司，耶拿，德国）用于将样品切成5个微米切片，然后将其用苏木精和曙红（H＆E）染色。尼康Eclipse中的Ti-U显微镜与Nikon DS-装置Ri数字照相机和NIS元素BR 3.1软件使用。

3.2。油红O染色

可替代地，石蜡包埋的肝样品放置于异丙醇中，并立即在液氮中冷冻。使用低温恒温器（微摩尔H560的Thermo Scientific，马萨诸塞州，美国）中制备十二微米切片。从样品的不同部分的三个切片放置在每个载玻片上，并用于每只动物两个幻灯片。载玻片用油红O（ORO）和迈耶的苏木染色。以20×放大倍数获得从每只动物十个图像。所述ORO染色区域的识别是用ImageJ的程序来进行[11]。

3.3。即时聚合酶链式反应

从肝脏总RNA用TRIzol试剂（Thermo Scientific的，马萨诸塞州，美国）和反转录成cDNA（高容量cDNA试剂盒，Applied Biosystems公司，USA）提取。基因表达通过实时聚合酶链反应（RT-PCR）来评价，使用Rotor基因Q（Qiagen公司，USA）和荧光染料SYBR绿（的Platinum®SYBR®绿定量PCR超混合液UDG，Invitrogen公司，USA）。引物序列β肌动蛋白前锋：5 -TCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3 ，反向：5 -GCTCAGTAACAGTCCGCCTAG-3 ;α微管蛋白前锋：5 -TATGCCAAGCGTGCCTTTG-3 ，5反转 -CACAGAATCCACACCAACCTCC-3 ;GAPDH前锋：5 -AAGGTGGTGAAGCAGGCATC-3 ，反向：5 -CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3 ;RPL37A前锋：5 -GTACACTTGCTCCTTCTGTGGC-3 ，反向：5 -AGGTGGTGTTGTAGGTCCAGG-3 ;α辅肌动蛋白前锋：5 -CCGCACCATCAATGAGGTCG-3 ，反向：5 -AGGCTTGGAAGGTCACAACCC-3 ;B2M前锋：5 -CCCCACTGAGACTGATACATACG-3 ，反向：5 -CGATCCCAGTAGACGGTCTTG-3 。基因表达的分析进行了使用先前由Livak和Schmittgen [描述的方法12]和Pfaffl [13]。

3.4。Western印迹分析

动物were deeply anaesthetized with thiopental (50 mg/kg b.w.); after loss of corneal reflexes, the abdominal wall was opened to visualize the liver and portal vein. The animals were then euthanized, and the livers were removed and homogenized in lysis buffer (100 mM Tris, 10% SDS, 100 mM sodium pyrophosphate, 100 mM sodium fluoride, 10 mM EDTA, 10 mM sodium orthovanadate). The tissue extracts were centrifuged at 15,294 ×  ，在4℃，40分钟。上清液的蛋白含量用Bradford方法测定。对于SDS-PAGE，50 μg of total protein was mixed with Laemmli buffer containing 200 mM dithiothreitol, loaded onto a 10% gel, and separated at 120 V for 120 minutes. The resolved gels were then transferred to nitrocellulose membranes using a Bio-Rad mini trans blot apparatus (USA). The membranes were incubated in blocking solution (5% skim milk) for 2 hours at room temperature. The membranes were then incubated, with primary antibodies, overnight at 4°C, and washed and incubated with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody. The specific antibodies used included anti-:β肌动蛋白（目录号4970S）和α辅肌动蛋白（目录号3134S）（Cell Signaling公司，马萨诸塞州，美国），αβ-微管蛋白（目录号322500）（Thermo Scientific的，马萨诸塞州，美国），和α-GAPDH（目录编号SC-25778）（圣克鲁斯，达拉斯，USA）。丽春红S染色来计算相对蛋白质含量。免疫印迹的可视化用增强的化学发光（Amersham公司Biosciences）中来完成的。免疫印迹进行扫描，并使用ImageJ软件量化。

4.统计分析

用GraphPad V7.0（格拉夫派得软件，拉霍亚，CA，USA）的结果进行分析。每组的最小样品尺寸为分析的每个参数是由一个定义的足以通过执行样本的分布的分析“达戈斯蒂诺和Pearson总括正态性检验，”所推荐的GraphPad软件。所有的样品为正态分布进行了评价，并进行单向ANOVA，随后由事后Bonferroni检验（Bonferroni多重比较检验）（ ）。结果表示为 （ ）。

5.结果

5.1。形态学

如图1，有将SD小鼠的肝脏样品中检测到未检测到脂滴，通过H＆E染色所证实（左上面板）。相反，HFD（顶部中间面板）和的ob / ob（右上面板）的小鼠的肝细胞中含有大量的胞内脂滴。对于脂质含量的更定量的评估，ORO的颜色强度染色的样品进行测定（ 和 像素，分别地）。

5.2。基因表达

在RT-PCR分析（图的结果2）未能检测的组成型基因表达的水平的任何统计学上的差异显著β肌动蛋白，αβ-微管蛋白，GAPDH，RPL3，和之间或群体之间B2M。然而，的ob / ob组相比于HFD组时，有在的量可观察到的减少β肌动蛋白（10％），αβ-微管蛋白（6％），GAPDH（19％），和RPL3（15％）。在另一方面，ob / ob小鼠还提出的大致水平升高α相比于SD和HFD组辅肌动蛋白的表达，但这个结果没有达到统计学显着性水平（ ）。

5.3。蛋白表达

图图3（a）和3（d）表明，随着越来越多的蛋白质加载到凝胶并随后转移丽春红S的强度染色增加。注意增加的强度，当被加载到凝胶（2.5对比5对比更大量的蛋白质染色10 μG/μL）。然而，具有相似蛋白的负荷，从各组小鼠中，有间或组之间（图没有统计学差异显著图3（b）和图3（e））。数字图3（c）示出了使用每个特定的抗体典型的免疫印迹。

对于蛋白质表达，有在水平没有发现显著差异β肌动蛋白，α微管蛋白，α辅肌动蛋白，GAPDH或组之间（图图3（f）-3（H））。然而，在HFD小鼠的肝脏的GAPDH蛋白水平显着降低（ ; ）并在ob / ob小鼠的水平通过大约减少一半（ ;不显著），相比SD小鼠。

6.讨论

本研究的结果表明，NAFLD动物模型（即，HFD和ob / ob小鼠）没有本改变的表达模式，用于组成型表达的蛋白质。在另一方面，有在若干参考基因的组成型基因表达的改变在从HFD的结果和的ob / ob组进行比较。然而，有相当大的增加α在ob / ob小鼠的肝脏中辅肌动蛋白的表达水平相比，SD对照。

参考蛋白和基因是基于的前提是，这些归一化标记在所有组织中，并且这些分子的表达不实验或病理生理条件下变化表示选定。然而，存在已经被证明能促进在这些基因和蛋白质的表达[水平变化的实验条件下，细胞类型，发育阶段，以及其它条件，例如与某些肿瘤，精神分裂症和肝病例子2-4，14]。因此，研究人员必须谨慎选择的参考基因，以免造成误解的结果。

更具体地，有证据表明，基因通常用于数据标准化（即，β肌动蛋白，GAPDH，和18S rRNA基因）中丙型肝炎病毒感染的模型显示可变的表达水平[15-17]。此外，Boujedidi等。[18]表明，组成型表达的基因的水平β肌动蛋白和GAPDH也是患者的酒精性肝损伤变化很大。

已经很少受到关注，相对于参考基因的实验条件，为NAFLD。Bruce等。[五]分析了6个基因，并建议，在这些之中，GAPDH和B2M均NAFLD最稳定的基因，而CYC1和EIF4A2是最不稳定的。此外，在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）模型，发现YWHAZ和ACTB基因是最稳定和CYC1和B2M基因是最不稳定的。然而，也有人发现，有在控制动物的某些基因和蛋白质的组成型表达的一些变化，以及。考虑到所有这些考虑，它最终得出的结论是最稳定的成分为YWHAZ和CYC1，而最不稳定成分为EIF4A2和ACTB。

本研究的结果，使用NAFLD的动物模型，是类似的布鲁斯等人。[五]。这两项研究都无法探测到HFD和SD小鼠与正常小鼠的GAPDH和B2M基因表达水平的任何显著的差异。然而，执行与从ob / ob小鼠肝脏样品相同的分析过程时，人们发现，相比HFD小鼠时GAPDH基因的表达水平被降低显著（图2）。

此外，组成型表达β肌动蛋白，α微管蛋白，RPL37A，和α辅肌动蛋白基因并没有关于控制调节，但两个相比较NAFLD模型时没有显示显著差异。因此，这些参考基因，与外α辅肌动蛋白（ ）用适当的对照相比每个单独的模型（HFD或的ob / ob）时，应认为是良好的，可靠的数据正规化。在另一方面，在比较相对于控制两个NAFLD模型时，B2M应该算是一个不错的选择。

类似的参考基因，其用于作为用于基因表达分析，蛋白质参考，也被称为管家蛋白对照，也被用来作为内部对照，并且用于标准化的SDS-PAGE免疫印迹或数据。这类蛋白的实例包括β肌动蛋白，GAPDH，ββ-微管蛋白，以及其它，如COX-IV和亲环[19]，它都被证明在显着和未改变的水平来表示。如图图3（a）和图3（b），丽春红S，其已被用于的转印效率定性评估，以及凝胶上样稠度[20]，允许对样品蛋白含量的快速和有效评价。

以往的研究表明，该蛋白表达水平β肌动蛋白，GAPDH，和β2 - 微球蛋白的一些实验条件下改变，以及在正常与发炎的肠的情况。此外，GAPDH水平改变了一些缺陷和转染细胞系，并也有报道黑色素瘤患者[2，21]。

在这项研究中，无论是丽春红染色强度和免疫印迹结果显示，有中没有显著差异β肌动蛋白，α微管蛋白，或α图之间或各组间（辅肌动蛋白蛋白质表达水平2）。此外，发现GAPDH水平的控制和HFD组，略有改动（ ）但未能达到显着水平（图2）。

7.结论

根据我们的结果，得出的结论是有在参考基因和蛋白质在本研究中使用两个NAFLD动物模型中表达水平改变一些。强烈建议参考基因（多个）的选择小心进行时直接比较这两种模型。在另一方面，如果只比较合适的控制模型之一，有多种选择。我们的研究表明，所有分析的结构蛋白是用于比较两个动物模型研究和良好的参数（HFD和的ob / ob）;然而，相对于基因表达，组成型基因最合适的是B2M;因为当时的车型没有任何区别，我们建议您将其用于您的分析。

最后，建议本次研究的结果与这些模型时加以考虑，以确保所获得的结果是可靠的，可正确地解释。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

作者非常感谢FAPESP（2016 / 06911-3，CROC）和的CNPq（303543 / 2014-0，CROC; 140170 / 1015-4，LCCA），用于支持这项研究。

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