口服磷脂酰胆碱可改善药物性肝损伤大鼠的肠屏障功能

摘要

客观的。磷脂酰胆碱(PC)是主要的表面活性磷脂，使表面具有疏水性。据报道，它可以逆转肝纤维化的进展，改善肝功能。本研究旨在探讨口服PC对药物性肝损伤大鼠肠屏障功能(IBF)的影响。方法。四氯化碳(CCl4-)致肝损伤大鼠给予100mg /kg PC，每日1次，连续21天。PC治疗对(i)肝功能和门静脉压、(ii)肠道和肝脏组织学、(iii)血浆内毒素、二胺氧化酶(DAO)和肿瘤坏死因子- (TNF-)的影响α水平进行调查。结果。在ccl4诱导的肝损伤中，PC治疗可以降低门静脉压力，改善肝功能。pc处理肝损伤大鼠，胶原纤维逐渐减少，肝细胞无序排列和肝小叶部分修复，纤维组织炎性细胞浸润减少。在pc治疗的肝硬化大鼠中，回肠炎症细胞浸润的降低改善了肠道组织学，血清DAO水平也降低了。这些变化与炎症活性的降低有关，如血清TNF-的降低α水平和血浆内毒素水平。结论。提示PC治疗对药物性肝损伤大鼠具有肝保护作用，能恢复IBF，减少内毒素血症。

1.介绍

肝病是一个庞大的医疗负担全世界和是由多种因素造成的。药物诱导的肝损伤表示宽范围的在暴露于任何制造的或天然存在的化学化合物的反应。以前的实验和临床研究表明，肝损伤，尤其是肝硬化，与增加的肠渗透性和肠屏障功能障碍有关[1- - - - - -3.]。肠道屏障通透性增加可能导致细菌易位和内毒素血症[4,5]，可引起肝功能障碍，甚至导致全身血流动力学紊乱，导致肝硬化的多种并发症[5]。因此，修复肠黏膜屏障是肝脏损伤的治疗具有重要意义。

磷脂酰胆碱（PC）是一种普遍存在的膜磷脂是细胞分化，增殖和再生必要的，是必要的分子通过膜[运输6]。它被认为是肝脏疾病的标志[7]。肝硬化患者血清和肝组织PC水平均明显降低[8,9]。根据以往的研究，在肝损伤的实验模型PC治疗已被确定为逆转肝纤维化的进展[10]和改善肝功能[11]。

表面活性PC是用于肠的疏水性生物物理表面性质重要，提供对抗微生物的屏障和有毒副产品[12]。已有研究表明，外源性PCs可防止胃、十二指肠、小肠非甾体类抗炎药或脂多糖引起的粘膜损伤[12,13]。先前的研究由本研究的作者进行显示，溶血磷脂酰胆碱粪便内容在患者中显着增加肝硬化或肝细胞癌[14,15]，因此表明在PC在肠道管腔的降低。然而，PC对药物性肝损伤肠屏障的影响仍是未知。本研究的目的是评价口服给予PC对大鼠肠屏障功能与碳tetrachloride-（CCl4-）诱导的肝损伤的作用。

2.材料和方法

2.1。动物

一个total of 40 healthy male Sprague-Dawley rats weighing 180-220 g were provided by the Department of Animal Care, Zhejiang Traditional Medicine University (Hangzhou, China). Rats were fed with standard laboratory food and water ad libitum. The temperature in the feeding room was kept between 20°C and 25°C, and the relative humidity was 50%-65%. All experimental protocols were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Zhejiang Provincial People’s Hospital (Hangzhou, China).

2.2。试验协议

将大鼠随机分为正常对照组(健康大鼠，HR); )和肝损伤组。采用50% CCl4(中国四川省成都市科龙化学试剂公司)与橄榄油(1ml /kg) 1:1混合，皮下注射，每周两次，共8周，诱导30只大鼠肝损伤。肝损伤的动物随后被随机分配到治疗组(LI-PC; )或车辆（LI; )组。LI-PC组灌胃给予100 mg/kg PC (Sigma-Aldrich;德国达姆施塔特的默克公司;目录编号1535755)每天一次，共21天。HR组接受溶液(1ml生理盐水)，同时进行分析。

继治疗期间，大鼠行剖腹探查术。They were anaesthetized with 50 mg/kg pentobarbital sodium subcutaneously, and a midline incision was made to measure portal pressure. Subsequently, blood and tissue samples from the left major liver lobe and the ileum were collected. All rats were subsequently sacrificed by intraperitoneal injection of 8 ml/kg body weight of 10% chloral hydrate (Aoxin Reagent Company, Yangzhou City, Jiangsu, China). Tissue samples were washed with phosphate-buffered saline, harvested, and fixed at room temperature overnight in 10% formalin for histological examination. Tissue specimens were frozen immediately following fixation via immersion in liquid nitrogen and stored at -80°C. Blood samples were evaluated to determine biochemical parameters.

2.3。组织病理学评估

病理专家进行组织病理学评估。通过苏木精染色和伊红染色评估肝组织病理学变化，而马尾松三色染色用于评估纤维化程度。

对回肠活检进行处理，切片用苏木精和伊红染色，然后用光学显微镜进行检查。按照标准程序对回肠活检进行超微结构评估，活检立即用2.5%戊二醛室温固定过夜，后用1%四氧化锇固定，并用树脂包埋(EMbed 812包埋试剂盒;电子显微镜科学，宾夕法尼亚州，美国)。超薄切片切至120 nm厚，随后用柠檬酸铅和醋酸铀酰染色。透射电子显微镜(Philips Tecnai 10;和电子显微镜图像分析仪(Erlangshen ES500W;(美国加利福尼亚州普莱森顿的Gatan公司)被用来分析样本。

2.4。肝功能

分离血清用于肝功能分析，取血样在室温下3000×g离心10 min。血清样本使用日立7600自动分析仪(日立公司，东京，日本)进行分析。

2.5。入口压力的决心

开腹手术期间，采用BL-420S数据采集与分析系统(成都TME科技有限公司，中国成都)，使用连接灌注套管近6 cm的应变传感器连续监测并记录门静脉压力，采用先前发表的方法[16]。结果以mmHg表示。

2.6。内毒素测定，TNF-α和二胺氧化酶

采用定量显色鲎试剂(爱华医药，中国上海)测定血浆内毒素。17]。The detection limit of endotoxin was 0.2 units, and the results are presented as EU/ml. Tumour necrosis factor- (TNF-)α采用ELISA试剂盒(RAB0480, Sigma-Aldrich;默克公司(Merck kGaA)，以ng/ml的形式出现。采用紫外分光光度法(UV-2102C, Juchne, USA)测定肠屏障功能障碍的生物标志物——血清二胺氧化酶(DAO)的浓度。

2.7。统计分析

结果以 。统计分析采用单因素方差分析。采用Duncan或Mann-Whitney非参数检验进行事后比较。数据分析使用SPSS for Windows (ver)。16.0;SPSS公司，芝加哥，伊利诺斯，美国)。 认为具有统计学显著性差异。

3.结果

3.1。肝功能和门静脉压

三组患者的肝功能指标和门脉压见表1。丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶和总胆红素水平( )及减低总蛋白质含量( )与LI- pc和HR对照组比较。LI-PC组丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平高于HR组，但差异不显著。LI组的门静脉压力明显高于HR组( ）而LI- pc组的门脉压力明显低于LI组( )。

3.2。组织病理学肝

如图所示1， LI组肝细胞排列紊乱，广泛脂肪变性，明显肿胀，斑点状坏死，肝组织中可见嗜酸性粒细胞。胶原纤维分裂紊乱的小叶，大量淋巴细胞浸润并胆管增生。LI-PC大鼠胶原纤维逐渐减少，受损肝小叶部分修复，肝细胞脂肪变性减少，纤维组织炎性细胞浸润减少。

3.3。回肠组织病理学

光镜分析发现，与HR组相比，LI- pc组Paneth细胞下降，LI- pc组下降幅度更大。LI- pc大鼠粘膜下水肿不明显，而LI组明显。LI- pc组炎症细胞浸润低于LI组(图)2)。

透射电镜显示，LI大鼠细胞间连接增宽，微绒毛变形，线粒体增加和扩张。LI-PC大鼠肠道上皮微绒毛和线粒体正常，细胞间连接变厚(图)3.)。

3.4。血浆内毒素与血清DAO和TNF-α水平

血浆内毒素与血清DAO和TNF-α级别在表中列出2。LI大鼠血清DAO明显高于HR大鼠( )和LI-PC大鼠（ )。LI-PC大鼠血清DAO浓度降低与血清炎症活性降低相关，表现为血清TNF-显著降低αLI- pc组血浆内毒素水平与LI- pc组比较( )。然而,血清TNF -αLI-PC组血浆内毒素水平明显高于HR组( )。

4.讨论

细胞粘膜上覆盖着一层磷脂，使其表面具有疏水性。PC是主要的表面活性剂。因此，PC主要构成疏水性表面，其维护对于身体健康和疾病预防具有重要意义。

已证实PC对实验性肝损伤大鼠有肝保护作用[11]。本研究结果与既往文献一致，PC治疗对肝损伤大鼠的肝功能有改善。此外，pc处理大鼠的门脉压力明显低于未处理大鼠的肝损伤。LI-PC大鼠肝组织病理改变明显改善，胶原纤维逐渐减少，肝小叶部分修复。提示PC治疗可减少肝纤维化[10,11LI-PC大鼠门静脉压力的降低是由于纤维形成减弱和肝保护作用。

本研究表明，给药后大鼠肝损伤的肠道组织病理学改变改善。光镜观察显示，PC治疗部分阻止了窗格细胞减少、粘膜下水肿和炎症细胞浸润。电镜显示LI-PC大鼠微绒毛和线粒体正常，细胞间连接增宽。血清DAO活性和内毒素水平是肠粘膜通透性、肠损伤和再灌注损伤的有用标志物[18]。与肠道组织病理学结果相比较，我们发现PC处理的大鼠血清DAO活性和血浆内毒素浓度明显低于未处理的大鼠。PC对肠道的有利作用可能部分归因于LI-PC大鼠门脉压力的降低，以及对粘膜屏障完整性的直接保护。

已有研究表明，肝硬化大鼠血清TNF-水平明显升高α各级[19，这与目前的结果一致。肝损伤大鼠肠屏障功能改变与血清TNF-上调有关α水平。TNF-α增加α肝硬化大鼠肠道表达可能是肠道通透性增加的结果，允许细菌和内毒素进入肠壁。因此，血清TNF-的降低α在LI-PC观察大鼠水平可能反映在国际羽联的改进。然而，以前的文献表明，外源PC针对胃肠道炎症反应[20.,21]。这些发现(20.,21提示PC治疗可能在肠道中发挥直接的抗炎活性，有助于保护IBF。

PC对肝硬化大鼠IBF的好处是由于降低了门脉压力，可能是由于影响肠屏障的结构和功能。PC是肠粘膜组织膜、细胞和细胞器不可或缺的组成部分，这一发现支持了PC在大鼠实验性急性肝功能衰竭早期可防止肠道细菌易位的研究[22]。此外，内源性PC是必要的粘膜疏水性和有助于上皮的屏障性能[12,13]。已确定PC在黏液层直接吸附，从而提高屏障性能[13]。因此，在IBF改进在药物诱导的肝损伤的治疗PC观察到可取决于在肠壁和肠屏障的维护直接营养作用。

本研究结果提示PC治疗能够恢复药物性肝损伤大鼠的IBF并减少内毒素血症。这种脂类是否能够有效地影响药物性肝损伤的自然历史，并降低肝损伤或肝硬化患者的细菌易位和其他细菌并发症的风险，还需要进一步的临床试验来确定。

数据可用性

在题为“口服磷脂酰胆碱改善药物性肝损伤大鼠的肠屏障功能”的手稿中，本研究中产生或分析的所有数据均纳入本文。您可以访问结果、表格和图表中的数据。

的利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

作者的贡献

陈美娟、黄海军和周鹏城也有同样的贡献。

致谢

本研究由中国科学技术（2018ZX10302205-002号）部的国家科技重大专项，中国国家自然科学基金（编号81672115和81800472）和浙江的资助中国的省自然科学基金（批准号：LY12H03014）。

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