lncRNA Mirt2下调在溃疡性结肠炎和结肠上皮细胞调节IL-22表达与细胞凋亡

摘要

lncRNA Mirt2是脂多糖（LPS-）诱导炎症抑制剂。我们发现，Mirt2在溃疡性结肠炎（UC）患者血浆下调，Mirt2的下调区分UC患者与健康对照。IL-22也被下调在UC患者和与Mirt2正相关。Mirt2过表达导致上调，而Mirt2 siRNA沉默导致从用LPS处理的结肠上皮细胞的IL-22的抑制分泌。此外，在LPS处理，Mirt2过表达导致了降低，而Mirt2 siRNA沉默导致结肠上皮细胞的增加凋亡率。因此，Mirt2在溃疡性结肠炎下调并调节在结肠上皮细胞的IL-22的表达。

1.介绍

在临床实践，胃肠道疾病的一个共同的基团是炎症性肠疾病（IBD）[1]。溃疡性结肠炎(UC)是IBD的两种主要亚型之一(另一亚型是克罗恩病)[1]。UC发病率高得让人难以接受[2]。外部抗原和肠道微生物引起的炎症反应与UC的发生密切相关[3.,4，而IBD的病因学仍然几乎不知道。促炎细胞因子-(如TNF, IFN-)γ， IL-17A/F或IL-21)靶向治疗已广泛应用于UC的临床治疗[5]。这些疗法主要集中于降低细胞毒性和抑制炎症[5,6]。在大多数情况下，甚至疾病状况也可以得到控制;临床治疗效果有待进一步改善，以促进康复。

清楚的是，某些炎症介质，如IL-23，TNF-αα和IL-12，参与UC的发病机制，以及生产和这种介质的分泌的抑制被认为是疾病控制和恢复[有益7,8]。另一种可能的治疗方法是增加某些抗炎细胞因子的分泌，如IL-22，可以抑制肠道炎症[9]。Long (>200 nt)非编码RNA (noncoding RNAs, lncRNA)是一种蛋白编码能力有限但具有基因表达调控功能的RNA转录本[10]。lncRNA Mirt2是一种脂多糖(LPS)诱导的炎症抑制剂[11]。因此，我们推测Mirt2的炎症抑制作用可能对UC的治疗也有帮助。因此，我们研究了Mirt2在UC中的作用。

2。材料和方法

2.1。研究对象

为分析UC中Mirt2的差异表达，本研究纳入了2016年3月至2018年3月兰州第二人民医院诊断的68例UC患者和68例健康对照者。患者纳入标准为:(1)首次诊断的UC患者和(2)研究前未接受治疗的UC患者。排除标准为:(1)其他医院转院的患者和(2)诊断为多种临床疾病的患者。选择健康的对照组，以匹配患者组的性别和年龄分布。将实验原理告知所有患者和对照组，本研究在患者入院前已获得上述医院伦理委员会批准。

2.2。等离子体和细胞

在任何治疗开始之前，从每个参与者中抽取空腹血(5ml)。将血液转入EDTA试管，1200 g离心15 min，分离血清。

使用人结肠上皮细胞（HCnEpC，电池应用，USA）。HCnEpCs由电池应用领域提供的指导下进行培养。为了建立UC细胞模型，LPS，剂量为4μg/ml处理HCnEpCs 24小时后使用。

2.3。瞬时转染

Sangon(中国上海)利用pcDNA3载体构建Mirt2表达载体。Mirt2 siRNA和阴性对照siRNA由GenePharma(上海，中国)设计合成。使用Lipofectamine®2000试剂(Sigma-Aldrich，美国)进行瞬态转染，将10 nM Mirt2表达载体、10 nM空载体(阴性对照，NC)、35 nM Mirt2 siRNA或35 nM阴性对照siRNA(阴性对照，NC)转染至10⁵HCnEpCs。对照组(C)细胞为未转染的细胞。随后的实验使用转染后24小时收集的HCnEpCs进行。

2.4。RT-qPCR

HCnEpCs（10⁵)或血浆(0.2 ml)与1ml RiboZol™RNA提取试剂(美国VWR)混合，提取总RNA。RNA样品经DNase i处理后，使用SensiFAST™cDNA合成试剂盒(Bioline，美国)进行逆转录。然后使用SYBR Green Master Mix (Bio-Rad，美国)制备qPCR反应混合物，内源性对照18S rRNA，分析Mirt2的表达。每个反应设置3个重复。数据分析使用2^-ΔΔCT方法。

2.5。ELISA

采用人IL-22定量ELISA试剂盒(D2200, R&D Systems, USA)检测HCnEpCs血浆和细胞培养液中的IL-22。血浆中IL-22水平归一化为pg/ml。

2.6。细胞凋亡分析

在转染后24小时收集HCnEpCs，然后用LPS以4剂量孵育μ克/毫升。然后用PBS洗涤两次HCnEpCs。然后，绑定缓冲区(500μ升），PI溶液（5 μ升），和FITC标记的膜联蛋白V（5 μ升）用于用10混合⁶然后在黑暗中孵育10分钟。最后，使用FACSCalibur流式细胞仪(BD, Lake Franklin, USA)检测凋亡细胞。

2.7。统计过程

三个生物学重复了每个实验组。平均值用于表示的3次重复的数据。未配对 -测试用于测试两组参与者之间的差异。单向ANOVA和Tukey检验用于测试不同的细胞处理组之间的差异。使用ROC曲线分析进行诊断分析。用于相关性分析的线性回归。 差异有统计学意义。

3.结果

3.1。等离子Mirt2下调在UC并显示诊断中的价值

据观察，在血浆水平Mirt2患者组中显著低于对照组（图1(一), )。通过ROC曲线分析Mirt2对UC的诊断价值。在这项分析中，UC患者是真正的阳性病例，健康对照组是真正的阴性病例。如图所示1 (b)，曲线下面积为0.92，标准误差为0.023,95%置信区间为0.87-0.96。

3.2。UC患者IL-22与Mirt2呈正相关

ELISA数据分析显示，患者组血浆中IL-22水平明显低于对照组(图)图2（a）, )。IL-22与Mirt2的相关性采用线性回归分析。IL-22与Mirt2在UC患者中呈显著正相关(图)图2（b）)。然而，IL-22与Mirt2之间的相关性在健康对照组中不显著(图)图2（c）)。值得注意的是，IL-22/Mirt2与血浆c反应蛋白(CRP)的相关性分析显示，血浆IL-22水平( )和Mirt2 ( )与血浆CRP水平呈显著负相关(数据未显示)。

3.3。Mirt2正调控IL-22在HCnEpCs

将Mirt2表达载体或siRNA转染到HCnEpCs中(如上所述LPS处理)。C和两个NC比较，Mirt2的表达水平与Mirt2表达载体或siRNA转染HCnEpCs被显著改变（图图3（a）, ),指示成功转染。ELISA检测不同细胞组培养基中IL-22水平。数据显示，Mirt2过表达导致表达增加(图)图3（b）, ),而Mirt2 siRNA沉默则导致中培养液中HCnEpCs分泌IL-22的减少(图)3 (c), )。

3.4。在LPS作用下，Mirt2抑制HCnEpC细胞凋亡

细胞凋亡测定数据的分析结果表明，比较C和两个NC，Mirt2过表达导致下降（图4(一), ),而Mirt2 siRNA沉默则导致增加(图)4 (b), )细胞凋亡率HCnEpCs的。

4.讨论

本文分析了Mirt2在UC中的表达模式、功能及诊断价值。我们发现Mirt2在UC中下调，Mirt2可能通过正向调节抗炎IL-22而抑制UC的发展。

与编码蛋白质的基因不同，lncrna通常在特定类型的细胞或特定的发育阶段特异表达，参与特定的生理或病理过程[12]。然而，lncrna可能会从合成部位释放到血液循环系统中，作为全身基因表达的调节因子[13]。在本研究中，我们在所有UC患者和健康对照组血浆中检测到Mirt2，提示在人体中存在循环Mirt2。此外，UC中Mirt2下调，而Mirt2的下调将UC患者与健康对照组区分开来。因此，循环Mirt2可用于辅助UC的诊断。

UC与抗炎IL-22有关[14]。鞭虫感染对UC有治疗作用，近期一项研究证实IL-22参与了这一过程[15]。在另一项研究中，一种IL-22结合蛋白被鉴定为可以结合IL-22抑制其对UC的保护作用[16]。我们的研究观察到了UC中IL-22的下调。在本研究中，我们发现Mirt2在UC中是IL-22的正调节因子(1)Mirt2和IL-22在UC患者血浆中呈正相关(2)Mirt2正调节HCnEpCs中IL-22的分泌。已知Mirt2可以灭活MAPK通路，减少促炎细胞因子的产生[11]。IL-22还与MAPK [串扰17]。因此，MAPK可能介导IL-22与Mirt2的相互作用。

肠上皮细胞凋亡参与UC的发生[18]。在本研究中，我们发现，在LPS处理下，Mirt2对HCnEpCs具有保护作用。因此，过表达Mirt2可能是通过抑制细胞凋亡、促进IL-22分泌来治疗UC的潜在途径。然而，还需要更多的临床试验。

总之，在Mirt2 UC和Mirt2下调可以通过积极地调节抗炎IL-22抑制UC的发展。

数据可用性

在研究过程中产生的分析数据集可以在合理的要求下由通信作者提供。

的利益冲突

作者宣称，他们没有竞争的利益。

作者的贡献

所有作者都已经阅读并赞成最终的手稿。

致谢

感谢兰州第二人民医院的支持。

参考文献

1. “随着时间的推移，炎症性肠病的发病率和流行率的增加，基于系统回顾，”消化内科卷。142，没有。1，第46-54.e42，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
2. L. Peyrin-Biroulet, E. V. Loftus, J. F. Colombel，和W. J. Sandborn，“基于人群的组群中成人克罗恩病的长期并发症、肠外表现和死亡率，”炎症性肠病第17卷，no。1，第471-478页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. P. B. Eckburg和D. A. Relman，《微生物在克罗恩病中的作用》，临床感染疾病第44卷，no。2，第256-262页，2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
4. J. V. Weinstock，“蠕虫和粘膜免疫调节”，纽约科学院年鉴卷。1072，没有。1，第356-364，2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. P. Rutgeerts, W. J. Sandborn, B. G. Feagan等，“英夫利昔单抗用于溃疡性结肠炎的诱导和维持治疗”，新英格兰医学杂志，第353卷，第2期。23，页2462-2476,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术
6. Y.李，H.金，链球菌康，李笃，J.公园和S.乔恩，“纳米胆红素作为抗炎治疗纳米药物”Angewandte化学国际版卷。55，没有。26，第7460-7463，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
7. D.崔，黄国忠，杨D.，黄B.和B.一种“疗效和安全性干扰素γ克罗恩病的靶向治疗:随机对照试验的系统回顾和荟萃分析肝脏和胃肠病学的临床和研究第37卷，no。5，第507-513页，2013。视图:出版商的网站|谷歌学术
8. I. Marafini, E. Angelucci, F. Pallone，和G. Monteleone，“IL-12/23/STAT轴作为炎症性肠病的治疗靶点:在人类中的机制和证据，”消化系统疾病第33卷，no。1，第113-119页，2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术
9. K.杉本，A.小川，E.沟口等人，“在溃疡性结肠炎的小鼠模型中的IL-22改善肠道炎症，”该临床研究杂志卷。118，没有。2，第534-544，2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
10. 林俊华，“基因表达的局部调控与lncRNA启动子、转录与剪接”，国立中山大学学报(自然科学版)。自然，第539卷，no。7629，第452-455页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
11. M.都，L.元，X. Tan等人，“在LPS诱导lncRNA Mirt2是炎症的负调节剂，”自然通讯，第8卷，no。2017年第2049条。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. 《长链非编码rna:控制核结构和基因表达的空间放大器》，李建平，《空间放大器:控制核结构和基因表达》。自然评论。分子细胞生物学第17卷，no。12，第756-770页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
13. 齐平，周欣欣，杜欣欣，“长链非编码rna在癌症中的应用:现状与展望”，肿瘤分子卷。15，没有。1，P。39年，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术
14. A.关川，H.福井，K. Suzuki等人。“的IL-22 / REG我的参与α轴溃疡性结肠炎，”实验室调查第90卷第1期3，第496-505页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
15. M. J. Broadhurst, J. M. Leung, V. Kashyap等人，" IL-22⁺CD4⁺T细胞与治疗相关的鞭虫溃疡性结肠炎患者的感染"科学转化医学第2卷第1期60，第60ra88页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
16. J. C. Martin, G. Beriou, M. Heslan等，“IL-22BP是由人肠道中的嗜酸性粒细胞产生的，在结肠炎期间阻碍IL-22的保护作用，”粘膜免疫，第9卷，no。2，第539-549页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. D. Lejeune, L. Dumoutier, S. Constantinescu, W. Kruijer, J. J. Schuringa，和J. C. Renauld，“在大鼠肝癌细胞系通路中，白介素-22激活JAK/STAT, ERK, JNK和p38 map激酶通路，这些通路与IL-10共享且不同。”生物化学杂志卷。277，没有。37，第33676-33682，2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术
18. 吴，黄，董，Kwon，“溃疡性结肠炎相关长链非编码RNA, BC012900，调节肠上皮细胞凋亡，”炎症性肠病第22卷，第2期。4，第782-795页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术

版权

版权所有©2019光荣丁等。这是下发布的开放式访问文章知识共享署名许可，允许在任何媒体中不受限制地使用、发布和复制原创作品，只要原稿被正确引用。