HAVCR1影响的MEK / ERK通路在胃腺癌和影响肿瘤进展和患者预后

抽象

甲型肝炎病毒细胞受体1（HAVCR1）基因作为敏感和特异的生物标记物已被报道在各种疾病。特别是，HAVCR1过表达促进的几个人类癌症的发生和发展。因此，我们的目的是检测HAVCR1对胃腺癌（GAC）的影响。我们首先确定与基于使用生物信息学分析方法的癌症基因组图谱（TCGA）数据库上正常胃组织相比HAVCR1在GAC组织中的表达。然后，我们评估HAVCR1的使用定量实时逆转录PCR（QRT-PCR）GAC细胞，免疫印迹，细胞计数试剂盒8（CCK-）8，集落形成测定的生物学功能，伤口愈合测定法，和跨孔检测。我们的研究结果表明，HAVCR1表达在GAC组织上调，并与不良预后正相关。失功能分析表明HAVCR1的敲低抑制增殖，集落形成，迁移和侵袭GAC细胞。此外，在GAC细胞减少HAVCR1的可降低磷酸化MEK / ERK的表达。这些结果表明，HAVCR1可以表示用于GAC预后潜在生物标志物，以及用于治疗GAC一个新的治疗靶点。

1.简介

胃癌是第四大最常见的癌症，癌症死亡率在世界第二大原因[1]。胃癌的大部分（约90％）是胃腺癌[1，2]。甲胃腺癌（GAC）产生从最表面层的腺体，或粘膜，胃，其与慢性胃炎，高盐饮食相关的，幽门螺杆菌感染，吸烟和恶性贫血[2，3]。手术切除为GAC标准主要疗法。然而，手术后，总的5年生存率仍因为高局部区域和远处复发率[较差3，4]。为了提高手术的结果，佐剂或新辅助治疗是经常结合使用手术诸如放疗和化疗。然而，放疗和化疗的除了尚未见报道提供任何明显的额外的好处[1，4]。因此，如何对待GAC有效地已成为一项紧迫的任务。随着靶向治疗可以为患者GAC具体和有效的治疗，靶向治疗已成为治疗GAC的研究重点[五，6]。因此，选择适合GAC靶向治疗一些有效的生物标志物的关键。

甲型肝炎病毒细胞受体1（HAVCR1）基因在细胞遗传学5q33.2位置映射，其编码I型跨膜糖蛋白[7，8]。HAVCR1，也称为人类肾损伤分子-1（KIM-1）和T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1（TIM-1），最初在灵长类肾细胞[描述9]并且与疾病易感性相关[10]。HAVCR1已被报告为肝炎一个敏感和特异的生物标志物[11，12]和急性肾损伤[13-15]。据维拉等人的前一份报告，HAVCR1首先被证明能抑制细胞分化和透明细胞肾细胞癌中高表达[16]。此外，越来越多的证据表明，HAVCR1用一些侵袭性肿瘤如肾细胞癌相关[7，17，18]，人结肠直肠癌[10]，和卵巢透明细胞癌[19]。因此，HAVCR1可以被认为是与肿瘤发生和发展相关的一个有效的生物标志物。

在这项研究中，我们的目的是探索HAVCR1的GAC中的表达水平，并探索HAVCR1表达和GAC患者的临床病理特征之间的预后意义和关系。我们还研究HAVCR1在GAC细胞的潜在功能。

2。材料和方法

2.1。数据库

的基因的数据集是从TCGA，其包括GAC组织的375个样本和正常胃组织的32个样品。还从TCGA数据库获得的306名GAC患者对应的满量程的临床信息（https://cancergenome.nih.gov/）。在数据收集过程均符合所有的法律和法规。

2.2。细胞培养和转染

人体胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞系MKN-45和AGS购自上海生命科学研究院（上海，中国）。Cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin, and 0.1 mg/ml streptomycin at 37°C in a humid incubator containing 5% CO₂。

将细胞根据制造商的方案使用Lipofectamine 2000（Invitrogen生命技术，卡尔斯鲁厄，德国）转染。两种类型的siRNA的用于拦截的HAVCR1表达。是HAVCR1的siRNA序列如下：F：5 -UCC UUG GUG GGA AGA GAU G-3对于siRNA1（SI-HAVCR1＃1），和F：5 -GAG AAC GGA UCA ACU CUC A-3对于siRNA2转（SI-HAVCR1＃2）。同时，非特异性siRNA用作阴性对照组（SI-CON）。The transfected cells were harvested after 48 h of transfection for the following experiments. Transfection efficiency was measured by qRT-PCR and western blot.

2.3。RNA提取和定量RT-PCR

根据制造商的方案，使用的Trizol试剂（Invitrogen，格兰德岛，NY，USA）提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒（宝，大连，中国）样品反转录成cDNA。HAVCR1的mRNA的表达，实时PCR使用SYBR Green（宝，大连，中国）来确定。The qRT-PCR cycle conditions were 95°C for 5 min, 40 cycles of 95°C for 30 sec, 60°C for 40 sec, and 72°C for 1 min. The results were quantified and normalized using the相对于GAPDH方法。每个测定进行独立地进行三次。引物如下：HAVCR1前进，5 -TGG TGG GAG ATA GAG GAA GCA T-3 ，和反向，5 -GAT CAG CGT TCA GAT CCA GG-3 ;GAPDH前进，5 -GCG GGA AGA TCC CTC CAA AAT-3 ，和反向，5 -GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3 。

2.4。Western印迹

Cells were harvested and treated with lysis buffer (KeyGEN, Nanjing, China) on ice for 30 min. A BCA kit (KeyGEN, Nanjing, China) was used to quantify protein concentration. Equal amounts of protein (20 μ克）溶解在SDS-PAGE，并转移到PVDF膜上。Membranes were blocked with 5% nonfat milk for 1 h and incubated overnight at 4°C with primary antibodies (dilution 1 : 1000, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) against MEK (Cat no. 9126), p-MEK (Cat no. 3958), ERK (Cat no. 4695), p-ERK (Cat no. 8544), GAPDH (Cat no. 5174), and HAVCR1 (Cat no. 14971). Subsequently, membranes were washed with TBST and cultured with secondary antibody (anti-rabbit IgG, HRP-conjugated goat anti-rabbit, dilution 1 : 3000, Cat no. 7074, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) for 2 h at room temperature. The samples were detected by an ECL detection system (Thermo Fisher Scientific). And the intensity of the signal on each membrane was quantified by densitometry (Quantity One software, Bio-Rad). GAPDH was used as control. All experiments were repeated at least three times.

2.5。细胞增殖分析

根据制造商的方案，使用CCK-8测定细胞增殖。The transfected cells were seeded in 96-well plates at a density 1000 cells per well and determined at 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h using a CCK-8 kit. The absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Thermo Fisher Scientific Microplate Reader, Waltham, Massachusetts, USA). Each experiment was performed independently in triplicate.

2.6。集落形成测定

转染的细胞在6孔板中接种并在培养基中与每3天或4天更换10％FBS中温育。After two weeks, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 30 min and stained with 0.1% crystal violet for 30 min (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Visible colonies were counted and imaged. Each sample was determined independently at three times.

2.7。伤口愈合分析

将转染的细胞在6孔板中在37℃在潮湿的培养箱中培养，用5％CO₂for 24 h, resulting in a monolayer at more than 90% confluence. Then monolayer cells were scraped with a 200 μ升标准移液管尖，以产生伤口。用新鲜培养基洗涤细胞以除去漂浮细胞。Subsequently, the spread of the wound closure was recorded after 24 h of incubation under an Olympus BX51 microscope (Olympus Corporation, Tokyo, Japan). The experiment was repeated at three times.

2.8。跨孔迁移和侵袭分析

Transwell小测定在使用具有/ Transwell小室24孔板中进行，而不基质胶（孔径8 μ男，BD生物科学公司，富兰克林湖，新泽西州，美国）。在迁移测定，将细胞悬浮在无血清的RPMI 1640培养基中，并在加入到上部室 细胞/转孔。在侵袭测定，将细胞悬浮于无血清RPMI 1640培养基中在覆盖有基质胶上室接种 细胞/转孔。在每个测定中，下腔室中填充有10％FBS的RPMI 1640培养基作为化学引诱物。温育24小时后，将转孔的上表面用棉签擦拭。The inserts were fixed with paraformaldehyde for 30 min, stained with 0.1% crystal violet for 20 min, and then washed with PBS. Next, the migrating and invading cells were counted and photographed under an Olympus BX51 microscope (Olympus Corp., Shinjuku, Tokyo, Japan) at 200x magnification over five random fields in each well. The experiment was repeated three times.

2.9。统计分析

所有的值表示为 （SD）和数据采用SPSS统计分析软件（版本22.0，芝加哥，伊利诺伊州，美国）。HAVCR1表达和临床特征之间的关系用卡方检验和单向方差分析确定。的Kaplan-Meier法和log-rank检验用于产生总体存活曲线。使用Cox回归分析，以检测是否HAVCR1是在GAC预后的独立危险因素。学生们 -试验用于测量两个组之间显著差异。差异被认为是显著 。

3.结果

3.1。HAVCR1表达上调在GAC和预后差相关

基于癌症基因组图谱在375个GAC组织和32个正常胃组织以识别HAVCR1在GAC的潜在作用，我们首先评估HAVCR1表达式（TCGA，https://cancergenome.nih.gov/）数据库。我们发现，HAVCR1表达在组织GAC明显上调（ ）与正常组织相比（ ; ，数字图1（a））。此外，卡方检验表明HAVCR1表达与死亡相关（ ，表1）。

此外，排除患者没有随访，306名GAC患者保持和他们的全面临床信息是从TCGA数据库提取。中值表达值作为分界点，和GAC患者分为两组：HAVCR1高基（>中值; ）和HAVCR1低组（<中值; ）。该数据通过Kaplan-Meier法用对数秩检验，并因此总体存活曲线作图。如图图1（b）与HAVCR1低组相比，HAVCR1高组显示出较差总体存活（ ）。

此外，HAVCR1在GAC患者的预后价值是由Cox回归分析评价。如表2，单因素分析显示HAVCR1表达式（ ， ）临床阶段（ ， ）病理-N（ ， ）和年龄（ ， ）被显著与总生存期GAC患者。多变量分析表明HAVCR1表达式（ ， ）和年龄（ ， ）可以被看作是对GAC患者的总生存的独立危险因素。总的来说，结果表明，HAVCR1可能是GAC潜在生物标志物和预后因素。

3.2。HAVCR1表达上调在GAC细胞

为了研究HAVCR1对GAC细胞的影响，我们首先使用定量实时逆转录PCR（QRT-PCR）测定HAVCR1在不同GAC细胞系中的表达。如图图1（c）当与正常胃细胞系进行比较（GES-1），HAVCR1表达明显上调GAC细胞系（MKN-45和AGS），尤其是AGS细胞系。此外，Western印迹分析显示出该HAVCR1在MKN-45和AGS细胞中的蛋白表达较GES-1细胞的高（ ，数据1（d）和1（e）中）。这些结果证实HAVCR1表达在GAC细胞系高度调节。为了检验HAVCR1在GAC细胞的作用，我们首先撞倒HAVCR1的使用siRNA策略表达。QRT-PCR和免疫印迹的方法进行了检测MKN-45和AGS细胞沉默效率（ ，数字2）。

3.3。HAVCR1受损的下调GAC细胞增殖和集落形成

探索HAVCR1对GAC细胞增殖和产克隆能力的效果，CCK-8和集落形成测定在MKN-45和AGS细胞中进行。在CCK-8测定，MKN-45和AGS的增殖，转染用si-HAVCR1＃1和Si-HAVCR1＃2，当与阴性对照组（SI-CON）（相比显示出明显下降 ，数据图3（a）和图3（b））。相同的趋势也分别在集落形成试验观察。如图图3（c）和3（d）在克隆的SI-HAVCR1＃1和＃2组是数SI-HAVCR1两个GAC细胞系显著降低相对于SI-CON组，包括MKN-45和AGS（ ）。因此，这些观察结果公开了HAVCR1的敲低在增殖和集落形成细胞GAC起到了抑制作用。

3.4。HAVCR1减毒减少GAC细胞的迁移和侵袭

为了确定HAVCR1对GAC细胞的迁移率的影响，一个伤口愈合测定法和的transwell测定法用于这一目的。For wound-healing analysis in MKN-45 cells, the distances of the wound in the si-HAVCR1#1 and si-HAVCR1#2 groups were larger than that in the si-con group after 24 h of incubation ( ，数字图4（a））。一致地，的伤口闭合SI-HAVCR1＃1和Si-HAVCR1＃2组在AGS细胞比在Si-CON组中更宽（ ，数字图4（b））。此外，在MKN-45和AGS细胞的transwell测定表明，SI-HAVCR1＃1和Si-HAVCR1＃2转染显着抑制GAC细胞的迁移和侵袭用si-CON处理相比（ ，数据图4（c）和图4（d））。两者合计，HAVCR1的敲低抑制GAC细胞的迁移和侵袭。

3.5。HAVCR1缺失影响细胞外信号调节激酶（MEK / ERK）信号传导途径的激活

为了研究HAVCR1对增殖的潜在机制，集落形成，迁移和侵袭GAC细胞，ERK信号级联，如在人类癌症中最常见的失调途径之一，使用免疫印迹测定。由于最高沉默效率和Si-HAVCR1＃1的效果比较明显，随后的免疫印迹试验由SI-HAVCR1＃1日实施。SI-HAVCR1＃1转染后，对MEK的在MKN-45和AGS细胞中的表达水平和对ERK进行显著下调相比于Si-CON组（ ，数据图5（a）-图5（d）），而总MEK和ERK的表达水平显示出SI-HAVCR1＃1组和Si-CON组之间没有差异（ ，数据图5（a）-图5（d））。总之，HAVCR1缺乏阻止了MEK / ERK信号传导途径的活化，从而影响扩散，集落形成，迁移和侵袭GAC细胞。

4。讨论

在这项研究中，我们首先分析HAVCR1的基础上TCGA数据库GAC样品中的表达水平。我们发现，HAVCR1表达在GAC组织上调与正常胃组织，并积极与不良预后相关的比较。考克斯分析表明，HAVCR1可能是GAC患者预后的独立预测因子。此外，功能性实验表明HAVCR1的下调通过介导MEK / ERK途径的激活抑制增殖，集落形成，迁移和侵袭GAC细胞。因此，HAVCR1可以被认为是一个潜在的生物标志物和预后预测因子GAC。

HAVCR1已经被报道与许多疾病如肾损伤相关[13-15]，感染（丙型肝炎病毒，A型肝炎病毒，埃博拉病毒和）11，12，20，21]，和自身免疫性疾病（过敏，哮喘，系统性红斑狼疮患者）22-24]。这些研究已经表明，具有HAVCR1在各种疾病的多种功能。特别是，HAVCR1作为肝细胞上的受体的作用已被广泛研究。例如，HAVCR1可以是丙型肝炎病毒（HCV）条目的促进者，这可能稳定或提高病毒结合到细胞表面膜上，并允许用于交互的正确病毒受体定位与主HCV受体[12]。更重要的是，在肾细胞癌中观察到HAVCR1表达[7]，人结肠直肠癌[10]，和卵巢透明细胞癌[19]，这可能会促进肿瘤的发生和发展。因此，过表达HAVCR1可以是用于数种癌症[诊断生物标志物10]。根据这些发现，我们的目的是探索HAVCR1和GAC发展之间的关系。基于TCGA数据库，HAVCR1表达GAC组织中上调，并且与不良预后相关。此外，我们的实验结果表明，HAVCR1不足受损的扩散，集落形成，迁移和侵袭GAC细胞。因此，HAVCR1可能是GAC预后潜在生物标志物和用于治疗GAC有效的治疗靶。

ERK信号级联是中央MAPK途径调节多种细胞过程，如增殖，分化，存活，迁移和侵袭[的25-27]。ERK可通过各种致癌基因和细胞外刺激被激活，MEK作为ERK [的上游关键蛋白26，27]。ERK信号通路据报道，在胃癌细胞生长和转移[中发挥重要作用28-三十]。更重要的是，张，蔡表示，HAVCR1可以通过ERK介导肾小管上皮细胞的修复/ MAPK信号通路[31]。因此，在这项研究中，我们发现HAVCR1对AGS细胞的MEK / ERK信号通路下调的影响。MEK和ERK的表达水平的磷酸化表明HAVCR1的敲低后明显减少。因此，我们猜测HAVCR1的上扩散，集落形成，迁移和GAC细胞侵袭的作用可能与MEK / ERK途径相关联。

5。结论

我们的数据揭示，HAVCR1表达在GAC组织和细胞系上调，其高规与GAC患者的预后较差相关。此外，失功能实验表明HAVCR1的下调起到对增殖，集落形成，迁移和侵袭MKN-45和AGS细胞的负面影响。的MEK / ERK相关蛋白HAVCR1抑制后也降低。综上所述，HAVCR1可以是用于GAC预后潜在生物标志物，以及用于治疗GAC一个新的治疗靶点。当然，进一步的研究来验证这些结果，并澄清HAVCR1对GAC的促进作用的具体机制。

数据可用性

用于支持本研究的结果的数据可从根据请求相应的作者

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

致谢

作者承认甘肃大学研究项目的支持（批准号：2017A-052）和兰州市城关区科技研究项目（批准号：2017年〜3-3）。

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