一项初步研究：23个胆汁酸肝胆良，恶性胆道狭窄的研究

抽象

良性和恶性胆道狭窄之间的鉴别诊断可以在临床实践中很难。活检组织学的往往是不确定的。实验室指标（血清 ，糖类抗原19- ）和the length of stenosis (>15 mm) can be helpful but are not specific enough. The aim of this study was to investigate bile acids in liver bile of patients with benign and malignant biliary stenosis and controls without stenosis. A total of 73 patients entered the study: 7 subjects with benign biliary stenosis (6 men, 1 woman; 岁），21恶性胆道狭窄（15名男，6名女; 岁）和45例无胆道狭窄（22名男，23名女; 岁）;出者，25例有20没有胆总管结石。二十三个不同的胆汁酸在高效液相色谱法/质谱法分析。血清总胆红素患者恶性胆道狭窄是显著高于nonstenotic对照组相比（ ）。显著关系（ ）几对胆汁酸之间被发现。胆汁中相比无狭窄对照恶性胆道狭窄的酸浓度下显著发现对中，GlcA（ ）GUDCA（ ）GCDCA（ ）GDCA（ ）GHCA（ ）TUDCA（ ）和TDCA（ ）。在胆酸显著差异被发现良性和恶性狭窄之间（ ）。胆汁酸分析可能是恶性和良性胆道狭窄的鉴别诊断有帮助。更多的患者需要进一步的研究来进行注册，使胆汁酸的实际诊断结果才能确定。

1.简介

良性和恶性胆道狭窄的鉴别诊断可以在临床实践中是困难的。活检组织学的往往是不确定的。实验室指标（血清 ，糖类抗原19- ）和the length of stenosis (>15 mm) can be helpful but are not specific enough [1]。在良性胆道狭窄改变胆汁成分（肝移植术后）的一项研究已经发表[2]。在胆道系统胆汁酸评估癌症患者很少有其他研究3-五]。其他作者看的生物标记物，可以分化有助于良性和恶性胆道狭窄之间的其他体液的样品基质[6-8]。良性和恶性胆道狭窄的生物学基础显著不同。可以假定不同的组合物和/或胆汁酸可以对这些过程的影响的浓度。我们研究的目的是评估的连续患者肝内外23个不同的胆汁酸分析患者的恶性胆道狭窄是否有胆汁酸浓度不同从患者的良性狭窄有无狭窄胆汁酸的浓度。这一观察可能在鉴别诊断意义。

2。材料和方法

2.1。耐心

总共有73名患者进入该研究：7例良性胆道狭窄（6名男子，1名妇女; 岁），21恶性胆道狭窄（15名男，6名女; 岁）和45例无胆道狭窄（22名男，23名女; 岁）;出者，25例有20没有胆总管结石。Seven patients received long-term treatment with peroral UDCA (daily dose 500-1500 mg; median 500, IQR 500-875).

2.2。样品采集和存储

血清总胆红素和C-反应蛋白ERCP（内窥镜逆行胰胆管造影）之前进行了调查小于48小时。肝胆汁样品从肝总管收集内窥镜（对比度之前媒体使用），并在-80℃下立即冷冻直至分析进行。

2.3。色谱 - 质谱

2.3.1。色谱

的内源性23种胆汁酸的分离，使用UPLC系统的Acquity I-类来完成。简言之，分离上的Acquity BEH C18柱（ 1.7 μ米粒径）（沃特斯，米尔福德，USA），用一次性0.2保护 μ米在线过滤器（沃特斯，米尔福德，USA）。The separation was performed in a gradient elution mode with a flow rate of 0.35 mL min^-1和with the following composition of mobile phases: Solvent A consisted of ammonium acetate (0.5 mM) and acetic acid (0.001% ）在水里。Solvent B was composed of methanol : acetonitrile (75 : 25, ）mixture containing 0.5 mM ammonium acetate and 0.001% ( ）的乙酸。The gradient program was as follows: 0-0.2 min, 40% of solvent B; 0.2-7.0 min, 40-70% of solvent B; 7.0-8.0 min, 70-90% of solvent B; 8.0-8.5 min, 90 - 95% of solvent B; and 9.0-11 min, 40% of solvent B.

将柱在分析过程中在45℃下保持。将样品在一个不透光的自动进样器单元保持在10℃。样品的两条微升注入柱。Retention times of all 23 bile acids were verified with authentic standards, and quantification was done against the 8-point calibration curve covering range 5-2000 nmol L^-1。

2.3.2。质谱

甲世Xevo-TQ / XS质谱仪再加上的Acquity I-类UPLC（沃特斯，米尔福德，USA）被用于检测化合物。该光谱仪用在负离子模式ESI的接口操作。Optimized settings of an ion source were as follows: capillary voltage, 2.5 kV; cone voltage, 50 V; source temperature, 150°C, desolvation temperature, 600°C; desolvation gas, 1000 L/h; cone gas, 150 L/h; and nebuliser, 6 L/h.

使用多反应监测操作（MRM）模式的化合物进行了监测。由于非共轭胆汁酸一般不提供CID（碰撞诱导解离）足够强度的定量的片段，所谓的伪MRM用于他们的定量。The following MRM transitions were used: 375 ⟶ 375 (nonconjugated, monohydroxy BA), 391 ⟶ 391 (nonconjugated, dihydroxy BA), 407 ⟶ 407 (nonconjugated, trihydroxy BA), 432 ⟶ 74 (glycine-conjugated, monohydroxy BA), 448 ⟶ 74 (glycine-conjugated, dihydroxy BA), 464 ⟶ 74 (glycine-conjugated, trihydroxy BA), 482 ⟶ 80 (taurine-conjugated, monohydroxy BA), 498 ⟶ 80 (taurine-conjugated, dihydroxy BA), and 514 ⟶ 80 (taurine-conjugated, trihydroxy BA). Energies involved in CID were as follows: nonconjugated bile acids, ;甘氨酸 - 缀合胆汁酸， ;和牛磺酸缀合胆汁酸， 。用于LC / MS数据采集和评价是MassLynx和采用TargetLynx软件（4.2版，沃特斯，米尔福德，USA）。

2.3.3。样品制备LC / MS分析

由于在胆汁胆汁酸高浓度，将样品在分析之前稀释。两个稀释因素，1000倍和10000倍，分别用来覆盖宽范围的浓度，包括在样品中的主要和次要的胆汁酸。

A sample preparation corresponding to the 1000x dilution factor was as follows: Ten microlitres of bile in the 1.5 mL Eppendorf tubes was diluted with 90 μ0.1％HCOOH的L的50％（ ）乙腈。在接下来的步骤中，900 μ升含有1％乙腈溶液（ ）甲酸和内标物IS-CAD_五（ ）加入到同一管中。

The samples with the dilution factor 10000x were prepared as follows: Ten microlitres of bile in the 1.5 mL Eppendorf tubes was diluted with 990 μ升0.1％（ ）甲酸在50％（ ）乙腈。One hundred microlitres of this solution was taken and pipetted to a clean 1.5 mL Eppendorf, to which 900 μ升含有1％冷乙腈溶液（ ）甲酸和内标物IS-CAD_五（ ）再加入。

的样品中，用稀释因子1000倍或10000倍，在前述步骤中制备涡旋1分钟，放置10分钟，在-20℃下，以实现样本脱蛋白质，在纺 （五 min, room temperature). One hundred microlitres of a supernatant was taken and mixed in a clean 1.5 mL Eppendorf tube with 900 μ升0.1％（ ）甲酸在50％（ ）乙腈。涡旋样品，和250 μL被转移到AcroPrep过滤板（96个孔，wwPTFE膜，孔径0.20 μ米，Pall公司，USA）。将滤液收集到一个96孔样品收集板（700 μL, round well, Waters, Milford, USA), sealed with a sealing mat (Cap-mat 96-well 7 mm round plug preslit silicone/PTFE, Waters, Milford, USA), and put into an autosampler for analysis.

2.4。统计分析

将所获得的数据通过描述性统计来统计检验。正态分布数据由参量配对的进一步分析 -试验，并用非正态分布数据通过非参数Mann-Whitney检验进行测试。用于相关性分析（SIGMASTAT软件，版本3.1，Jandel公司，Erkrath，德国）的Pearson检验。

2.5。伦理

该研究是通过联合大学伦理委员会（协议号201712S06P）。所有程序均符合机构研究委员会的道德标准，并与1964年赫尔辛基宣言及其后修订。

所有患者均签署了书面同意。对于获得的所有数据，所有的个人识别信息符合法律捷克共和国的机密性保护被删除。

3.结果

血清总胆红素患者恶性胆道狭窄是显著高于nonstenotic对照组相比（ ;见表1）。显著关系（ ）几对胆汁酸（中，GlcA-GDCA，中，GlcA-TLCA，GCDCA-GDCA，GCDCA-GCA，CDCA-CA，GUDCA-TUDCA，GDCA-TDCA，TCDCA-TCA，和TMCA-THCA）之间被发现。胆汁中相比无狭窄对照恶性胆道狭窄的酸浓度下显著发现对中，GlcA（ ）GUDCA（ ）GCDCA（ ）GDCA（ ）GHCA（ ）TUDCA（ ）和TDCA（ ）。良性和恶性狭窄之间显著差异被发现的胆酸（CA）（ ，数字1）。其他结果没有达到统计学意义。血清C-反应蛋白的浓度，并在初级胆汁15种胆汁酸在所研究的组列于表1。其余8个胆汁酸检测不到或它们的浓度分别为<2.5 μ摩尔/ L。总胆汁酸的浓度列于表1。他们比在良性狭窄恶性狭窄较高（ ）和无狭窄对照（ ）。

胆汁UDCA在七十三分之十四人（19％）检测到。Out of those, 7 patients were not treated and 7 subjects were treated with peroral UDCA (daily dose 500-1500 mg; median 500, IQR 500-875). Bile UDCA was lower in the nontreated group ( 与 ）但这种差异并没有达到统计学意义（ ，类型2误差测试0.632）。胆汁UDCA没有与胆汁GUDCA相关得足够紧或者（ ， ）或与胆汁TUDCA（ ， ）。胆汁GUDCA TUDCA之间和胆汁相关性显著（ ， ）。与口服熊去氧胆酸治疗的7例患者显著较高浓度的胆汁GUDCA（ ）和胆汁TUDCA（ ）比起那些没有用口服熊去氧胆酸治疗。与口服熊去氧胆酸治疗没有显著影响的原发性肝胆其他胆汁酸的浓度。

4。讨论

我们目前的试点病例对照研究显示全新原装的见解。胆汁酸浓度分别为相比于没有狭窄控制在恶性胆道狭窄显著更低。有良性和恶性狭窄之间胆酸的显著差异。所分析胆汁酸的编号都是唯一的。这样的详细的分析可能使不同的病理情况精确映射。

在良性胆道狭窄改变胆汁成分（肝移植术后）的一个研究结果发表[2]。胆盐，磷脂和胆固醇在谁肝移植术后开发非吻合胆管狭窄一百十一分之十四例（13％）显著降低。通过胆汁盐和磷脂的减少胆汁分泌谁开发胆道狭窄的患者进行了表征和降低的胆汁磷脂/胆汁盐的比例。四个胆盐进行了调查（胆，脱氧胆酸，鹅去氧胆酸，熊去氧胆酸盐和）：还有谁没有发展非吻合胆管狭窄的绝对数额患者之间和各种胆盐谁后来发展那些没有显著差异[2]。

其他一些研究分析胆汁酸的患者胆道癌[3-五]。Lankisch等。[4]发表了胆汁蛋白质组学分析使得能够从原发性硬化性胆管炎和胆总管结石病胆管癌分化。随后，美国专利提交[9]。福伦达等。来自同一个研究小组[10]上发表胆管癌早期诊断的论文。在这项研究中，结合胆汁和尿液蛋白质组分析成立之初就87例已知诊断，然后在样品分析时施加到一组45个例，而不建立诊断。因此，该诊断方法的验证的前瞻性研究队列进行[10]。Park等人。[3]分析了胆道癌组在五个胆汁酸（胆酸，脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸，石胆酸，熊去氧胆酸和酸），胆管结石组，和控制。总胆汁酸的浓度为癌症组中比在胆结石组和对照组低。这一结果是相似的，当疾病的定位被限制在胆管或胆囊。虽然胆管阻塞的存在解释了一些在总浓度和胆汁酸组合物中的差异，也有其他贡献的机制。Park等人。说，胆汁酸转运的改变可能会降低胆汁酸的排泄，并可能导致在胆管上皮[致癌胆汁酸积累3]。

必须解决的一个关键问题是什么是因，什么是后果。胆汁盐是潜在的细胞毒性[11，12]和抗凋亡，并可能导致胆管损伤及胆管周围诱导纤维化13]。胆汁由于它们的信令特性的酸具有对胞内胆管调节差动作用，并且它们可以发起对胆管分泌，增殖和存活逆影响;例如，牛磺胆酸和牛磺石酸可以刺激，而熊去氧胆酸可以减少其他胆汁酸的增殖作用[2，14-16]。在大鼠的实验研究，胆汁酸肝内积累没有诱导直接癌变但促进了cocarcinogenic效果由于胆管增生，增强炎症（白细胞介素-6的表达增加），和减少在法尼醇X​​受体依赖性化学保护的刺激（FXR的下调）17]。

尽管UDCA的药代动力学以来已批准其在原发性胆汁性胆管炎研究使用，有限的工作已经发表在造型UDCA及其两个主要结合物，甘氨酸结合，GUDCA的代谢和牛磺酸结合，TUDCA [18]。在我们的研究中，口服熊去氧胆酸治疗的7例患者胆汁GUDCA和胆汁TUDCA显著较高浓度。

我们目前的项目是一个试验性研究，我们的数据必须谨慎解释。我们无法提供发现任何差异最终解释权。不过，我们可以推测，长期低浓度胆酸可作为在肿瘤生物学初始步骤之一导致胆道黏膜不稳定。不像我们，Jusakul等。[五]研究在胆囊胆汁中胆汁酸轮廓从患者谁接受肝切除胆管癌，肝细胞癌，和良性胆道疾病。它们在具有高血清总胆红素胆管癌发现显着升高胆酸和鹅脱氧胆酸。作者发现胆汁酸浓度的癌症患者中不同的图案相比，患有良性胆道疾病。某些胆汁酸的积累可以根据这些作者参与致癌作用[五]。

我们都知道这个试验性研究的可能限制。患者的数量是有限的，尤其是那些有良性狭窄。对照组相当异质，有或没有以前的胆囊切除术，部分患者接受了重复ERCPs带或不带乳头，胆总管结石是不同的病因，而不是所有的胆汁样品无菌。例恶性狭窄和受试者无狭窄和不具有胆总管胆酸的两个较低的水平。该观察结果不排除胆酸的浓度的可能的效用在良性和恶性狭窄之间鉴别诊断。

5。结论

胆汁酸分析可能是恶性和良性胆道狭窄的鉴别诊断有帮助。更多的患者必须在今后的研究中，这样可确定胆汁酸的实际诊断率进行注册。

缩略语

CA：	胆酸
鹅去氧胆酸：	鹅去氧胆酸
CE：	碰撞能量
C.I：	置信区间
CID：	碰撞诱导解离
DCA：	去氧胆酸
ERCP：	内镜逆行胰胆管造影
HCA：	猪胆酸
HDCA：	猪去氧胆酸
LCA：	石胆酸
IQR：	四分位距
IS-CAD五：	内部标准d五-胆酸
MCA：	Muricholic酸
GCA：	甘氨胆酸
GCDCA：	Glycochenodeoxycholic酸
GDCA：	甘氨脱氧胆酸
GHCA：	Glycohyocholic酸
GHDCA：	Glycohyodeoxycholic酸
中，GlcA：	Glycolithocholic酸
GUDCA：	Glycoursodeoxycholic酸
标准。开发：	标准差
TCA：	牛磺胆酸
TCDCA：	牛磺鹅去氧酸
TDCA：	脱氧胆酸
THCA：	Taurohyocholic酸
THDCA：	Taurohyodeoxycholic酸
TLCA：	牛磺石胆酸
青马管制区：	Tauromuricholic酸
TUDCA：	牛熊去氧胆酸
UDCA：	熊去氧胆酸。

数据可用性

用来支持这项研究的发现研究数据尚未作出，因为通用数据保护条例（对自然人的保护的欧洲议会2016年4月和理事会的27调控六百七十九分之二千零十六相对于可用个人数据和此类数据的自由移动处理和废除指令95/46 / EC）。

泄露

该研究的初步结果表示为在欧洲胃肠大会（UEG周，巴塞罗那2019年10月19日至23日，从DOI的海报：10.1177 / 2050640619854671）。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

这项研究是由研究项目MH CZ-DRO（UHHK，00179906），并通过该研究项目PROGRES Q40-15和Q40-01从查尔斯大学的支持。

参考

1. V. G.贝恩，N.亚伯拉罕，G. S. Jhangri等人，“胆管狭窄的前瞻性研究，以确定恶性肿瘤的预测，”胃肠病学杂志加拿大卷。14，没有。5，第397-402，2000。查看在：出版商网站|谷歌学术
2. C.I。比伊斯，E. Geuken，D.S。Visser等人，“肝移植后改变的胆汁组合物与非吻合胆管狭窄的发展相关联，”中华肝脏病杂志卷。50，没有。1期，第69-79，2009年。查看在：出版商网站|谷歌学术
3. J. Y.公园，B. K.公园，J.S。柯，S.爆炸，S. Y.宋，和J. B.涌“在胆道癌胆汁酸分析，”延世医学杂志卷。47，没有。6，第817-825，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术
4. T. O. Lankisch，J.梅茨格，A.A Negm等人，“蛋白质组胆汁从型材原发性硬化性胆管炎和胆总管结石病分化胆管癌，”肝病卷。53，没有。3，第875-884，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术
5. A. Jusakul，N. Khuntikeo，W. G.黑格等人，“在患有良性胆道系统疾病，肝细胞癌和胆管癌胆汁胆汁酸鉴定”亚太癌症预防杂志卷。13，第77-82页，2012。查看在：谷歌学术
6. J.梅茨格，A.A Negm，R.R。Plentz等人，“尿蛋白质组学分析区别于原发性硬化性胆管炎等良性胆疾病胆管癌，”肠道卷。62，没有。1，第122-130，2013。查看在：出版商网站|谷歌学术
7. A. Arbelaiz，M. Azkargorta，M. Krawczyk等人，“胞外血清囊泡包含用于原发性硬化性胆管炎和胆管癌蛋白生物标志物”肝病卷。66，没有。4，第1125至1143年，2017年。查看在：出版商网站|谷歌学术
8. S. H.松开，C. Roderburg，K.L。Kauertz等人，“循环骨桥蛋白水平升高与切除胆管癌后不良存活相关，”中华肝脏病杂志卷。67，没有。4，第749-757，2017。查看在：出版商网站|谷歌学术
9. H. Mischak，为“Method and标记用于胆管狭窄的诊断和在胆汁中，胆管细胞癌的”，美国专利US20140027283A1，2014。查看在：谷歌学术
10. T.福伦达，J.梅茨格，B.Schönemeier等人，“A相结合的胆汁和用于患者的待查胆管狭窄胆管癌诊断尿蛋白质组学测试，”欧洲胃肠病学杂志卷。5，没有。5，第668-676，2017。查看在：出版商网站|谷歌学术
11. P. R.加勒，L. Theilmann，R. Raedsch，G.奥托，和A. Stiehl，“熊去氧胆酸盐减少了人原代肝胆汁盐的肝毒性，”肝病卷。12，没有。3，第486-491，1990。查看在：出版商网站|谷歌学术
12. D. L. Schmucker，M.太田，S。金井，Y.佐藤，和K.木谷，“肝损伤诱发由胆汁盐：生物化学和形态学事件之间的相关性，”肝病卷。12，没有。5，第1216至1221年，1990。查看在：出版商网站|谷歌学术
13. M. Arrese和M. Trauner，“胆汁的形成和淤积的分子方面，”在分子医学发展趋势卷。9，没有。12，第558-564，2003。查看在：出版商网站|谷歌学术
14. D.阿尔瓦罗，A Gigliozzi和A. F. Attili，“监管和胆管细胞增殖的放松管制，”中华肝脏病杂志卷。33，没有。2，第333-340，2000。查看在：出版商网站|谷歌学术
15. G. Alpini，S.格拉塞，D.阿尔瓦罗等人，“胆酸消耗和饱食调节由大鼠磷脂酰肌醇3-激酶依赖性途径胆管生长和分泌，”消化内科卷。123，没有。4，第1226至1237年，2002年。查看在：出版商网站|谷歌学术
16. X.夏，H.弗朗西斯，S.格拉塞，G. Alpini，和G. LESAGE，“胆酸相互作用与胆管上皮细胞，”世界华人消化杂志卷。12，没有。22，第3553-3563，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术
17. E.洛萨诺，L.桑切斯 - 森特，M. J.蒙特等人，“在胆管癌发展肝内胆汁酸的积累Cocarcinogenic效果，”分子癌症研究卷。12，没有。1，第91-100，2014。查看在：出版商网站|谷歌学术
18. P.佐，R. L. Dobbins的，R. L. O'Connor的-的Semmes，和M. A.杨，“在健康熊去氧胆酸代谢和原发性胆汁性肝硬化A系统的模型，”CPT：与定量药理学药理学系统卷。5，没有。8，第418-426，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术

版权

版权所有©2019斯坦尼斯Rejchrt等。这是下发布的开放式访问文章知识共享署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。