文摘

客观的。弹力素的减少与一些炎性疾病相关。外生弹力素可能是一个治疗炎症性肠病。小数据显示抑弹性酶蛋白的表达在结直肠癌的患者。在这里,我们试图探索抑弹性酶蛋白表达在结肠直肠癌的人体组织。方法。我们检查了抑弹性酶蛋白的蛋白表达人体组织相邻nontumor和结直肠肿瘤的免疫组织化学(包含IHC)或定量实时聚合酶链反应(存在),然后分析了临床和RNA-seq数据在癌症基因组图谱(TCGA)数据库确认弹力素水平和结直肠肿瘤之间的关系。结果。88配对样本,68结直肠癌组织表示抑弹性酶蛋白的高表达与52匹配相邻的非癌变组织。和抑弹性酶蛋白的mRNA水平35配对组织表现出类似的趋势。RNA-seq和临床数据438年大肠癌组织和41,TCGA数据库中正常组织。弹力素mRNA RNA-seq数据显示,即使是调节的双重的结肠直肠癌样品比相邻的非癌变样本( vs。 ; )。之间没有显著的相关性被发现抑弹性酶蛋白表达与年龄、性别、肿瘤侵袭性阶段,淋巴结转移、远处转移蛋白和mRNA水平。然而,抑弹性酶蛋白表达与临床分期是基于与指导方针在蛋白质水平但不是mRNA水平。结论。抑弹性酶蛋白是调节在结直肠癌患者,结果为外生弹力素治疗潜在的局限性。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)是一种慢性非特异性炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。最近,越来越IBD的发病率已经显示出在亚洲人群,这是低发生率区域之前(1]。炎症性肠病的主要治疗是anti-TNF -α治疗,但40%的病人没有回应2]。基础之上,这是至关重要的寻求保护和有效的治疗方法。

关键炎症性肠病的发病机制仍不清楚,但综合效应的遗传、免疫、环境和微生物因素是被广泛接受的3]。先前的研究已经证实,蛋白酶和蛋白酶抑制剂发挥重要作用在慢性炎症4- - - - - -5]。弹力素是一种低分子量antiproteinase,对抗人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE),胰弹性蛋白酶,蛋白酶3和内源性血管弹性蛋白酶和也有几个功能,如抗炎、免疫调节、antimicrobe,抗,血管重建和伤口愈合6]。弹力素的减少与几位炎性疾病相关7]。最近,我们还发现,在活跃的IBD患者抑弹性酶蛋白减少,与疾病活动负相关(8]。此外,一些研究证实,probiotic-expressed弹力素防止炎症和恢复体内平衡在结肠炎动物模型(9- - - - - -11),这表明外源性弹力素可能是一个治疗炎症性肠病。然而,弹力素已报告在一些肿瘤的微分表达式。抑弹性酶蛋白过表达和分泌的官腔乳腺癌和卵巢癌,领导一个增殖效应通过MAP激酶途径12]。弹力素增加,与食道癌的分化13]。相比之下,抑弹性酶蛋白表达下调在导管原位癌,浸润性乳腺肿瘤,卵巢囊腺瘤,卵巢肿瘤的边缘,和侵入性卵巢癌14]。因此,工程的安全probiotic-expressed抑弹性酶蛋白需要估计的,但数据显示,结肠癌癌抑弹性酶蛋白表达,这可能说明它在结直肠肿瘤中的作用。

在这项研究中,我们试图探索大肠癌的抑弹性酶蛋白表达在人类组织,这是以前从来没有调查。我们研究了抑弹性酶蛋白的蛋白表达在人类粘液组织相邻nontumor和结直肠肿瘤的免疫组织化学(包含IHC)。然后,我们分析了临床和RNA-seq数据在癌症基因组图谱(TCGA)数据库确认mRNA水平的选取和抑弹性酶蛋白和结直肠肿瘤之间的关系。

2。材料和方法

2.1。临床样本

九十例结肠癌患者登记,组织病理学确诊结肠癌切除后的北京大学第一医院从2017年到2018年。一双活检样本结肠癌组织和邻近nontumor从每个病人组织收集,储存在-80°C在液态氮冷冻后。和这些患者的临床资料,包括年龄、性别、临床分期、肿瘤侵袭性阶段,淋巴结转移和远处转移。所有的肿瘤样本( )和相邻nontumor组织( )被用于组织微阵列分析探讨抑弹性酶蛋白的表达蛋白质,但只有八十八对患者用于统计,由于缺失的临床信息。结肠癌样本,35配对组织被用于定量实时聚合酶链反应(存在)。病人包括50名男性和38岁女性,年龄在32到91年。本研究通过北京大学第一医院伦理委员会和每个病人提供了书面知情同意(20171376)。

2.2。免疫组织化学分析

组织标本被中性10%福尔马林固定石蜡和嵌入。抑制内源性过氧化物酶活动的部分3%过氧化氢,deparaffinization和补液之后。又组织孵化了兔反弹力素(1:100;圣克鲁斯,CA)一夜之间在4°C。孵化后anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶(1:100;Dako、斯特鲁普、丹麦)在室温1小时,3、3 - - - - - -diaminobenzidine (DAB)用于可视化抑弹性酶蛋白的表达。与苏木精复染色后,在光学显微镜下观察到的部分。

免疫染色的弹力素被两名有经验的调查人员独立完成。染色强度的分数如下:1(-布朗),2(弱布朗),3(温和的棕色)和4(棕色的)。染色程度是根据阳性细胞的速度:0(0 - 5%),1(6 - 25%),2(26 - 50%),3(51 - 75%)和4 (76 - 100%)。最后的分数被定义为的总和的强度和范围的分数。当遇到最后得分的差异,这是两个调查员之间通过讨论来解决。为基础的标本被分为两组最后得分:高(> 4)和低(≤4)。

2.3。RNA提取和存在

冷冻结肠组织的总RNA分离使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。的质量和浓度使用NanoDrop 2000分光光度法测定RNA(美国马热费希尔科学)。然后,逆转录酶工具包(豆类生物科技集团、大连、中国)被用来生成的互补。存在7500年应用生物系统公司进行实时PCR系统SYBR绿色主组合(大热费希尔科学岛,纽约,美国)。引物的序列如下:选取转发:5 - - - - - -CTTCTTGA——TCGTGGTGGTGTTC-3和反向:5 - - - - - -AACGGGATCTTGTCCATTGAAT-3 ,和3 -磷酸甘油醛脱氢酶:5 - - - - - -GCCTGGTCACCA——GGGCT-3和反向:5 - - - - - -AATTTGCCATGGGTGGAATC-3 。

2.4。结直肠癌TCGA的数据分析

的临床和RNA-seq数据459结直肠癌患者和41 TCGA正常组织取自数据库(https://cancergenome.nih.gov/)。TCGA的临床数据是一个抽象的数据库,包括年龄、性别、临床分期、肿瘤侵袭性阶段,淋巴结转移和远处转移。患者综合临床信息和mRNA水平的弹力素被录取,其中包括438结直肠癌样品和41终于正常组织。本文使用的数据呈现给公众没有限制和限制。信使rna表达水平的选取进行了分析对象与不同的临床病理特征。差异表达基因在癌症样本与正常组织进行。

2.5。统计方法

2.5.1。疣状分

一群高分的比例计算。配对卡方检验是用于分析肿瘤和nontumor组织之间的比例,在不同临床病理的特点。一群高分的比例之间的关系和临床病理的变量计算卡方检验或确切概率法。生存分析是不同蛋白质含量的弹力素组之间相比kaplan meier曲线和生存率较。

2.5.2。TCGA RNA中存在的数据或数据库

连续变量被显示为平均值和标准偏差。RNA-seq弹力素水平和临床病理特征之间的关系是由一个独立的两个示例 - - - - - -测试。小动物——一张长有值小于0.05的定义为统计上的显著差异。采用SPSS 20.0软件进行统计分析。和基因的差异表达分析是通过EBSeq。

3所示。结果

3.1。表达抑弹性酶蛋白在大肠癌组织和Nontumor正常组织

八十八年成对人类癌症组织和选择nontumor组织进行免疫组织化学分析。受试者50男性和38岁女性,平均年龄 ,年龄在32到91年。88配对样本,68(77.3%)结直肠癌组织表示抑弹性酶蛋白的高表达与52例(59.1%)相比,与相邻的非癌变组织(表1, ;数据1(一)和1 (b))。和35对肿瘤和nontumor样本相同的队列中存在测量。结直肠癌组织显示mRNA的弹力素水平高于nontumor组织(表1, )。此外,438年RNA-seq数据大肠癌组织和41正常组织进行了分析。结果表明,抑弹性酶蛋白是调节的双重的结直肠癌与nontumor组织相比(表样本1, )。结果表明,抑弹性酶蛋白表达在结直肠癌患者增加蛋白质和mRNA水平,相比之下,TCGA nontumor结肠组织的免疫组织化学评分和分析数据库。

3.2。抑弹性酶蛋白的表达在结直肠癌患者在不同临床病理特性比Nontumor组织

基于抑弹性酶蛋白的高表达在肿瘤组织中与nontumor组织相比,八十八成对人体组织被除以不同临床病理的参数,包括临床分期、肿瘤侵袭性阶段,淋巴结转移和远处转移。抑弹性酶蛋白的高表达评价免疫染色观察评分在所有子组。然而,癌症样本之间抑弹性酶蛋白的表达和匹配相邻nontumor组织在某些子组没有显著差异,包括iii iv期临床阶段( ),肿瘤侵袭性阶段T4 ( ),阶段N1-N2淋巴结转移( ),和远处转移阶段M1(表2)。系统性的结肠直肠癌RNA-seq数据的生物信息学分析样本癌症基因组图谱(TCGA)执行。438之间的微分表达式分析大肠癌组织和41 nontumor组织显示,癌症样本和高弹力素mRNA水平匹配相邻nontumor样本在所有情况下,除了一些子组没有显著差异,也就是说。III期临床阶段,阶段T4肿瘤的侵袭性,和舞台N1淋巴结转移(表3)。

3.3。抑弹性酶蛋白表达与临床病理特征之间的关系在大肠癌患者

抑弹性酶蛋白表达与临床病理特征之间的关系分析了免疫染色分数和mRNA结直肠癌患者的数据。77.27%(68/88)癌症组织显示免疫组织化学方法的高分。如表所示4没有发现显著相关,在蛋白质和mRNA水平,抑弹性酶蛋白表达与年龄、性别、肿瘤侵袭性阶段,淋巴结转移和远处转移。然而,抑弹性酶蛋白表达与临床分期是基于美国癌症联合委员会(与)准则在蛋白质水平( )但不是mRNA水平( )。

3.4。结直肠癌患者的生存分析抑弹性酶蛋白的表达

之间的总生存期(OS)比较高、低蛋白弹力素水平在88年大肠癌患者。平均总生存时间 天低表达组相比 天高表达组(图2)。两组无意义的操作系统之间的差异被发现( )。

4所示。讨论

低分子量antiproteinase抑弹性酶蛋白,发现在某些人类上皮组织,包括支气管上皮细胞、肠上皮细胞,女性生殖上皮,乳腺上皮细胞,和一些免疫细胞,如单核细胞、肺泡macrophagocytes,中性粒细胞,T细胞。选取有几个功能,如抗炎、免疫调节、抗菌、抗、血管重建和伤口愈合6]。抑弹性酶蛋白的表达与一些炎性疾病相关。例如,抑弹性酶蛋白的表达增加是显示在牛皮癣患者(15];然而,弹力素水平下降在受试者患有牙周炎(16),细菌性阴道炎(17),哮喘18),急性呼吸窘迫综合征(19]。最近,我们还发现,弹力素降低活跃的IBD患者和与疾病活动负相关8]。前面的结果表明,肠道蛋白酶和antiprotease失衡可能发挥重要作用在IBD患者中,这可能会影响肠道炎症。弹力素的差别但另一种可能是,对这些结果在炎症性肠病的恶化,而不是原因。此外,一些研究表明,外生管理人类重组弹力素预防炎症动物模型。例如,瓦尚et al。20.)发现,治疗组小鼠的肺肺泡空间重组人类弹力素鼻内减少LPS-induced嗜中性粒细胞浸润和KC MIP-2和炎症标志物。莫塔et al。9]改造乳酸bacteria-expressed抑弹性酶蛋白重组和管理急性和慢性结肠炎小鼠模型,显示炎症的缓解和恢复肠道内稳态。Bermudez-Humaran et al。21]乳酸菌分泌弹力素的疗效相比,il - 10, TGF -β1在结肠炎小鼠模型,表明乳酸菌产生il - 10或TGF -β1只从事一些炎症参数,但是政府领导的弹力素显著减少炎症指标。基于这些结果,弹力素由乳酸菌可以有效治疗炎症性肠病病人在未来。然而,弹力素的微分表达式已报告在一些肿瘤,甚至与贫穷相关的结果,包括卵巢癌(12),乳腺肿瘤(14),和食道癌症13]。一个问题是提出了基于这些发现;交付乳酸菌抑弹性酶蛋白的治疗IBD患者是安全或致癌。但很少有数据显示抑弹性酶蛋白的表达在结直肠癌患者,不能说明它在结直肠肿瘤中的作用。

根据我们所知,这是第一个研究探讨抑弹性酶蛋白表达在结肠直肠癌。在这项研究中,77.3%的结直肠癌组织表示抑弹性酶蛋白的表达增加59.1%匹配相邻的非癌变组织。和弹力素mRNA调节是双重的结肠直肠癌样品比相邻的非癌变样品没有意义。以前的一些研究报道类似的趋势在其他肿瘤。Labidi-Galy et al。12)表明,高档卵巢癌抑弹性酶蛋白表达的调节。山本et al。13]表示73.5%的食管癌患者观察到免疫反应性与抑弹性酶蛋白抗体和抑弹性酶蛋白表达与分化程度有关。然而,卡鲁索et al。14)指出,抑弹性酶蛋白的表达减少导管原位癌的24%和83%的浸润性乳腺肿瘤与正常乳腺组织。这些结果表明,观察抑弹性酶蛋白在肿瘤的多效性的表达,在不同的癌症需要确认。

此外,我们的结果表明,抑弹性酶蛋白表达与临床分期的基础上,与指导方针在蛋白质水平但不是mRNA水平。和无意义的差异之间的总生存期(OS)高、低组的弹力素水平在这项研究中被发现。这种类似的趋势也观察到在食道癌症13),通过对比抑弹性酶蛋白的水平开贫困结果卵巢癌,胶质母细胞瘤,乳腺肿瘤与细胞增殖相关的(12,14]。因此,抑弹性酶蛋白表达改变,弹力素水平之间的关系,在各种癌症临床病理的因素也不同。

虽然我们的数据显示,弹力素水平可能不会影响结直肠癌的进步很明显,upregulation弹力素在癌症组织,特别是在早期阶段。一些临床研究反映慢性炎症状态显示增加患结直肠癌的风险;模式被广泛称为inflammation-dysplasia-carcinoma [22]。抑弹性酶蛋白表达增加结直肠癌的早期阶段,这可能是一种自适应海拔的炎症状态。弹力素的差别,但对这些恶性肿瘤可能是由于炎症微环境改变或抑弹性酶蛋白的疲惫。我们发现抑弹性酶蛋白表达在上皮细胞和免疫细胞在正常结肠粘膜上皮虽然主要是染色。除了上皮细胞分泌的增加,我们需要注意的角色免疫闲暇抑弹性酶蛋白表达在结肠癌的发展。但也有一些限制观察抑弹性酶蛋白表达的潜在来源。肿瘤发生结肠粘膜的正常结构受损,病理部分只能在结直肠癌评估几个网站。抑弹性酶蛋白表达的作用在结直肠癌的发展在未来需要更多的基础研究。

5。结论

抑弹性酶蛋白是调节在结直肠癌患者,结果为外生弹力素治疗潜在的局限性。

数据可用性

临床数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

Yun刘和于田的贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81800492),北京市自然科学基金(7174358)和北京大学第一医院的青年临床研究项目(2017号cr08)授予Guigen腾。