丙酮酸乙酯通过调节Nrf2通路和促炎细胞因子对大鼠胆管结扎致肝纤维化的影响

抽象

目的。本文旨在研究丙酮酸乙酯(EP)对胆道结扎(BDL)所致实验性肝纤维化的影响，并探讨其分子机制。材料与方法。将大鼠随机分成三组：假手术组中，BDL组和BDL + EP基团。肝纤维化是引起胆总管结扎并用血清生化参数水平进行评估，马松染色，α-SMA表达和I型胶原沉积。测定肝组织中Nrf2信号通路相关抗氧化基因Nrf2、SOD2、NQO1、GSH-Px的水平。同时，HMGB1、IL-1的mRNA表达水平β肿瘤坏死因子-α，并分析HSP27。在bdl诱导的肝纤维化大鼠中，血清ALT、AST水平显著升高，肝纤维化评分高，α-SMA表达和胶原沉积。结果。与BDL组相比，EP给药可以减少纤维化水平和实质上增加Nrf2的信号传导途径有关的抗氧化基因的表达。此外，EP显著抑制HMGB1的mRNA表达水平，IL-1β肿瘤坏死因子-α和HSP27。结论。结果表明，EP施用能有效抑制肝纤维化诱导大鼠BDL，其可以与Nrf2的介导的抗氧化酶系统的活性增强相关联，并且下调炎性基因。

1.简介

肝纤维化是肝脏反复损伤的常见结果，以细胞外基质(ECM)沉积为特征。活化的肝星状细胞(HSCs)是肌成纤维细胞的主要来源，也是成纤维过程中产生ecm的主要细胞[1- - - - - -4]。活性氧(ROS)已被证实是肝纤维化发生和发展的关键步骤[5]，不仅会导致肝细胞过度损伤，还会显著导致星状细胞活化[6,7]。以往的研究表明，通过ROS介导的细胞因子对HSC活化作出了贡献。最近，据报道，超氧阴离子（O₂^-），乙醛，和花生四烯酸能刺激造血干细胞。此外，ROS可以促进对蛋白质和mRNA水平，这是炎症的胆汁淤积性肝纤维化的启动子早期生长反应因子-1的表达。

核因子红细胞2相关因子2（Nrf2的）是调节抗氧化酶和阶段2解毒的关键转录因子。在暴露于氧化或电应力，胞质Nrf2的被磷酸化和易位至细胞核，在那里它通过与亮氨酸拉链区域的转录因子（的bZIP）家族[相互作用结合至抗氧化反应元件（ARES）8,9]和导致的Nrf2的信号传导途径有关的基因阵列，如血红素加氧酶1（HMOX1），NADPH醌氧化还原酶-1（NQO1），过氧化氢酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（谷胱甘肽过氧化物酶）10- - - - - -12]。这些抗氧化酶在ROS的消除中发挥重要作用。

丙酮酸乙酯（EP），丙酮酸的亲脂性衍生物，比丙酮酸更安全，更稳定，但丙酮酸得到保护作用。EP已被广泛接受作为保护剂，并显示出在临床剂量是安全的。它的保护作用是由于它的抗氧化性能[13,14,抗炎13,15]和抗细胞凋亡作用[16,17]。EP能有效地清除^ h₂O₂阿,₂^-,哦^-。此外，EP可以抑制高迁移率族蛋白1（HMGB1）的释放[17]，白介素-1β(il - 1β），和肿瘤坏死因子-α（TNF-αα)。因此，我们推测EP是否发挥保护作用，阻止肝纤维化的进展。

2.材料和方法

2.1。动物和实验设计方法

Male Sprague-Dawley rats (250 g-280 g) were obtained from DaShuo (Chengdu, China), and the Institutional Animal Care and Use Committee of Chengdu Medical College approved the experimental protocol. All rats were housed in plastic cages (4 rats per cage) with maintained conditions (20-22°C, 54% humidity, and 12 h light/dark cycle) and had free access to a standard rodent diet and water. The rats were acclimatized for 1 week prior to use.

EP购自Solarbio(中国北京;纯度98%)。动物被随机分为三组:假手术组( ),在BDL组（ ),和BDL + EP组（ )。在假手术组，大鼠接受了不结扎胆总管(BDL)的剖腹手术。在BDL组中，接受BDL的大鼠发生肝纤维化。在BDL+EP组，大鼠接受BDL治疗，并腹腔注射乳酸林格氏液稀释的EP (40)μg / ml;每天40毫克/1000克)。根据BDL诱导肝纤维化的过程，将各组进一步分为3个亚组(分别为2、4、6周;对于假性分组: ;对于BDL分组： ;对于BDL+EP子组: )。BDL操作全身麻醉下完成。剖腹已经作出，胆总管是局部，双重结扎，而这两个连字[之间切18]。

2.2。模型

当在深度麻醉下处死大鼠，剖腹制成，而在腹腔液收集体积测量。将血液从心脏收集，然后除去，并立即加权肝组织。从左侧肝叶切片切成几片。它们中的一些被固定在10％缓冲的中性福尔马林;其他人在-80℃下冷冻mRNA和蛋白检测。

根据以下公式[19]，计算肝脏指数:

2.3。血清生化分析

Blood samples were obtained and separated by centrifugation (3000× g, 15 min) to collect serum. Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels were measured using an Auto Chemistry Analyzer (Hitachi, Japan). The test reagents were obtained from Jiancheng (Nanjing, China).

2.4。肝切片的组织病理学检查

固定组织石蜡包埋，切片，脱蜡，再水化。苏木精和伊红染色(H&E)进行组织学检查，马尾松三色染色进行胶原沉积。按照汤普森提出的评分标准[19，肝纤维化半定量评分如下。得分0:缺席;分1:痕迹，纤细的萼片存在;评分2:连接肝静脉的轻度纤细间隔;评分3:萼片中、宽或发育良好;评分4:重度肝硬化。每个肝脏切片取6个字段，得到平均值。

2.5。免疫组织化学

免疫组织化学，固定肝切片(5μm厚)脱蜡，再水合，0.3%非特异性过氧化氢酶阻滞，高压提取抗原，10%非特异性山羊血清酶阻滞。随后，切片用多克隆抗大鼠抗体孵育α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白，1:200稀释;Nrf2(稀释1:1:100;、SOD2(稀释1:100;Hsp27(稀释1:100;和HMGB1(稀释1:200;Proteintech)。切片用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤后，用Polink-1-HRP-DAB检测系统对兔抗体孵育1 h，然后DAB显像。最后，的积极表达αα-SMA，Nrf2的，SOD2，Hsp27的，和HMGB1分别在400倍观察到的光显微镜（Olympus BX 53，日本）下。10个阳性区随机取和使用Image-Pro的加6.0软件进行分析。

2.6。免疫荧光

冷冻肝组织切成段（15 μ米厚）和用甲醇固定。Sections were pretreated previously, incubated in the mixture of anti-CK19 and anti-Nrf2 antibodies (anti-CK19 antibody, rabbit, 1 : 150, BioTECH; anti-Nrf2 antibody, mouse, 1 : 100, Santa Cruz, USA) overnight at 4°C. Then, sections were washed with PBS, incubated with fluorescence secondary antibody (anti-mouse Alexa Fluor 488-conjugated, 1 : 100, green; anti-rabbit Alexa Fluor 594-conjugated, 1 : 100, red; Proteintech) for 2 h at 37°C. Next, sections were rinsed with PBS and mounted by DAPI. All sections were photographed, and the positions of CK19 and Nrf2 were observed with a light microscope (Olympus/BX51, Tokyo, Japan) at 400x. The images were analyzed using Image-Pro Plus 6.0 software.

2.7。免疫印迹分析

根据标准协议，80μ制备并通过BCA测定试剂盒（密钥生成）来确定g总蛋白样品。然后，20 μg总蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移至PVDF膜（密钥生成），并用5％BSA在含有0.5％Tween 20的Tris缓冲盐水中，然后用初级（多克隆兔抗大鼠SOD2孵育antibody, ZSGBBIO, China, 1 : 1000) and secondary antibody (goat-anti-rabbit antibody, ZSGBBIO, China, 1 : 8000).β-肌动蛋白(一抗，1:200;二抗:1:6000;(Santa Cruz Biotechnology, Inc.， Santa Cruz, CA, USA)被用作内部控制。用化学发光试剂(KeyGEN)对蛋白条带进行可视化。

2.8。Nrf2 ELISA检测

Liver tissues were homogenized and centrifuged at 4°C (5000×g/10 min) in PBS buffer with protease inhibitors. Then, protein concentration was determined by a BCA method. The ELISA kit for Nrf2 was performed according to the protocol provided by the manufacturer (Hongju, Shanghai, China). Finally, when the reaction stopped, the optical density of each well was determined at 450 nm.

2.9。实时逆转录-聚合酶链反应分析

总RNA在肝组织用TRIzol试剂（DBI Bioscience公司，德国）分离。然后，2 μ使用MultiScribe™逆转录酶(DBI Bioscience)将总RNA的g逆转录为cDNA。使用PCR热循环器(Bio-Rad，美国)，用SYBR Green PCR Master Mix x (DBI Bioscience)标准方法测定基因表达。定量RT-PCR至少进行3次，引物序列汇总见表1。根据德尔塔-Δ阈一式三份样品进行分析（ΔΔCt)方法，用于定量基因表达水平。

2.10。统计分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。定量数据表示为 （SEM）和方差进行单向分析（ANOVA）。 被认为是重要的。

3.结果

3.1。EP可改善bdl诱导的肝损伤

肝组织的结构完全保持和假手术组中仍然排序。无序小叶结构和胆管上皮增生在BDL BDL和EP +组中观察到。然而，EP的施用减少了BDL + EP基团与BDL组相比在肝脏病理生理学特征（图1(一))。

进行与马森染色的肝切片的形态分析。我们观察到正常的形态，与假手术组中稀有的ECM沉积。在BDL组显示的改变的形态，与厚的胶原束。与此相反，BDL + EP组显示出较低的ECM沉积（图1 (b))。肝纤维化评分显示肝纤维化的进展。BDP+EP组在2、4周时肝纤维化评分低于BDL组(图)1 (c), )。这些观察结果表明，EP可能推迟肝纤维化进展。

生化分析结果如图所示1 (c)。BDL组血清AST和ALT水平明显高于假手术组( )。与BDL组比较，EP显著降低肝纤维化大鼠ALT和AST水平( )。这些意见建议，EP能有效防止鼠肝损坏。

3.2。EP的影响上α-SMA表达和ECM

经免疫组织化学染色，观察α-SMA和I型胶原蛋白主要在纤维间隔、炎症区和门脉区表达。在正常肝组织中，存在有序的I型胶原表达;在假手术组，其表达明显。相比之下，BDL和BDL+EP组的collage I表达更为紊乱(图)2(一个)和2 (b))。的更高的正数α与假手术组相比，BDL组检测到-SMA，而of的表达水平αα-SMA的BDL + EP组中明显高于BDL组显著下，特别是在2和4周（图2 (c), )。RT-PCR结果显示，与sham组相比，BDL及BDL+EP组I型胶原mRNA水平升高。但与BDL组相比，EP组I型胶原mRNA水平明显降低(图)2 (d))。

3.3。EP对炎症基因表达的影响

本实验分析了HMGB1的免疫组化阳性表达水平。与假手术组相比，BDL组在第2、4、6周时肝组织中HMGB1表达增高(图)3(一个), )。

HMGB1、IL-1的RT-PCR相对表达β和肿瘤坏死因子-α进行了分析。EP治疗显著减弱HMGB1表达，和BDL + EP组中观察到较低水平相比，BDL组，特别是在4和6周（图3 (b), )。与假手术组相比，IL-1β和肿瘤坏死因子-αBDL组表达水平明显升高。然而，EP治疗抑制了它们的增长，而在第2、4、6周时，BDL+EP组比BDL组低(图)3 (c)和3 (d), )。结果表明，EP可下调炎症反应。

3.4。EP对Nrf2和HSP27表达的影响

通过HSP27和Nrf2免疫组化，假手术组细胞淋巴瘤阳性，而BDL和BDL+EP组细胞淋巴和核阳性细胞较多(图)4(一)和4 (b))。免疫荧光双重染色显示，Nrf2蛋白在肝细胞和胆管上皮细胞（表达图4 (c))。

通过mRNA分析，我们发现在第2、4、6周时，BDL组的HSP27水平高于sham组(图)4 (d), )。然而，EP逆转HSP27的增强相比，BDL组，特别是在第4周（图4 (d), )。我们发现在第2、4、6周时，BDL组的Nrf2表达水平高于sham组。与BDL组相比，EP在2和4周时增加了肝纤维化大鼠的Nrf2水平(图)4 (d), )。

采用ELISA法定量分析Nrf2蛋白。BDL组Nrf2蛋白表达高于sham组(2、4、6周， ,分别）。EP治疗显着增加的Nrf2蛋白表达;它有BDL + EP组比BDL组中较高的水平，特别是在第4周（图4 (d), )。

3.5。EP对Nrf2信号通路相关基因表达的影响

免疫组化SOD2观察到假手术组细胞淋巴细胞阳性，BDL和BDL+EP组细胞淋巴和核阳性细胞较多(图)5(一个))。Nrf2的信号传导途径有关的基因（SOD2，NQO1，和GSH-Px）的mRNA表达水平进行分析。我们注意到，SOD2表达水平的BDL组较假手术组中较高处第2，第4和6周。相较于BDL组，EP给药增加在2和4周在肝纤维化大鼠SOD2电平（图5 (b), )。与此相反，NQO1和GSH显示BDL组比假手术组在较低水平，和更高水平的BDL + EP组比那些BDL组中观察到，尤其是在第4周（图图5（d）和5 (e), )。western blot检测SOD2蛋白，与其mRNA表达呈现相似趋势(图)图5（c）, )。这些数据表明，EP可以提高SOD2蛋白表达。所有上述结果表明，EP可以增加Nrf2的信号传导途径有关的基因的表达。

3.6。实验原理图

在肝保护方面，EP主要用于预防和减轻肝脏的氧化和炎症损伤。在本研究中，EP对肝纤维化的保护作用主要是抗氧化作用。机制图显示HSP27调节Nrf2激活的假设(图)6)。HSP27可能通过与JUN相互作用影响Nrf2和AREs的显带，导致Nrf2的激活降低。氧化应激条件的增加导致细胞坏死死亡，细胞外释放乙酰化的还原型HMGB1，作为炎症细胞因子。据报道，活化的巨噬细胞和单核细胞分泌HMGB1是在多种细胞因子的炎症刺激下产生的。肿瘤坏死因子-α，IL-1，和IFN-γ。

4。讨论

本研究表明，EP能抑制肝纤维化进展大鼠，将其通过血清ALT和AST水平和肝纤维化内容的改进表示。EP的抑制肝纤维化过程中的作用与EP提高Nrf2的信号传导途径有关的抗氧化剂蛋白的表达和降低炎症因子表达相关联。

EP收到了兴趣，脂肪肝，肝缺血再灌注损伤，以及急性发作，慢性肝功能衰竭的保肝作用[20.]。EP下调促炎多个蛋白质的表达，包括IL-1β肿瘤坏死因子-α和HMGB1在内毒素血症和脓毒症[动物实验21]。作为内源性危险信号分子，HMGB1可以诱导各种促炎细胞因子分泌和加重炎性过程[22]。

以往的研究报道，HMGB1密切参与了纤维化疾病包括囊性纤维化，肝纤维化和肺纤维化23,24]。转化生长因子-β（TGF-β)在肾纤维化中，HMGB1也可能驱动细胞因子家族[25]，而促炎性细胞因子和血管生成因子可以直接刺激HSC活化肝纤维化。我们的研究结果表明，EP能抑制HSC活化如EP显著下调的HMGB1水平在4周和6周的肝纤维化的由BDL诱导，而IL-1β和肿瘤坏死因子-α水平大幅下降。

此外，一些报道表明，EP的抗炎作用是由于ROS相关的信号转导子和转录激活子（STAT）的抑制信令[26,27]。本研究还介绍了EP的抗氧化和抗炎作用。氧化应激和炎症反应在肝纤维化的发生、发展过程中发挥了重要作用。Nrf2是抗氧化反应元件介导的基因表达的中心调节因子。大量证据表明，Nrf2在解毒器官特别是肝脏中高表达。Nrf2通过与ARE相互作用，诱导多种抗氧化应激下游靶点表达，保护肝细胞在常见慢性肝病发展过程中免受氧化损伤[28- - - - - -30.]。咖啡因与人参皂苷Rg1已通过SOD，NQO1和GST [Nrf2的的介导的诱导显示出抑制肝纤维化31- - - - - -33]。Nrf2的激活可能是一种预防或改善毒性肝损伤和纤维化的新策略。EP是一种有效的活性氧清除剂，能清除H₂O₂另一个ROS和OH-。我们的结果显示，在BDL手术4周时，EP可以提高Nrf2和SOD2蛋白的表达水平，并提高SOD2、Nqo1和GSH-Px mRNA的表达水平。对比BDL组和假手术组，我们发现Nrf2自发激活。此外，在肝细胞和胆管上皮细胞中可以观察到Nrf2的激活，而在EP处理后Nrf2靶基因SOD2、NQO1和GSH-Px明显升高。有趣的是，在2周时，与BDL组相比，BDL+EP组Nrf2升高无统计学差异，而SOD2水平升高有统计学差异。我们认为，SOD2在氧化应激下是自发激活的，更敏感，可能随着Nrf2的增加呈指数增长。结果表明，EP能够通过促进Nrf2通路的激活增强肝纤维化的内源性抗氧化能力。

在本研究中，EP也抑制HSP27的提高。上一页纸表明有HSP27和Nrf2的[之间的相关性34]。我们发现HSP27、Nrf2和JUN同步共表达，而JUN参与了Nrf2的激活过程。我们推测HSP27可能参与了Nrf2激活的调控。JUN可与Nrf2的bZIP相互作用，被认为是Nrf2结合AREs启动Nrf2信号通路相关基因的关键事件。JUN包括c-JUN、JUN- d、JUN- b，其中c-JUN可抑制Nrf2与AREs结合，减少Nrf2激活[35]。因此，HSP27可能通过与JUN的相互作用影响Nrf2和AREs的带化，导致Nrf2激活并降低HSP27的表达，HSP27是一种可被热休克和氧化应激等多种应激诱导的小HSP [36]。

总之，EP表现出对肝纤维化显著保护，从生化指标及病理组织学的逆转证明。EP的保护作用可能是主要是由于其抗氧化和抗炎性质。然而，结果表明，EP表现在肝纤维化的高级阶段显著的保护，但并没有有效阻止肝硬化。更详细的研究是必需的。

数据可用性

没有数据支持这项研究。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

作者的贡献

永华宗和王明孝张参加了这项研究的设计，他们都进行了统计分析。永华宗进行了研究，王明孝张收集重要的背景信息，并起草了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。帅李和文谦齐进行了概念，设计，知识产权内容定义，文献检索，数据采集，数据分析，以及手稿的准备。李娟和通化刘提供的数据采集，数据分析和统计分析的援助。陈露进行文献检索，资料采集和编辑稿件。慧君杨和小松胡锦涛进行审稿。全体作者都阅读并同意稿件的内容。永华宗和王明孝张同等贡献这项工作。

致谢

这项工作得到了四川省重点实验室项目基金(编号:sys10 - 002)。

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