Fgf9的异常表达在癌症的发展与肛门直肠的鼠胚胎畸形

文摘

这项研究的目的是探讨纤维母细胞生长因子的作用9 (Fgf9)在正常和肛门直肠畸形(ARM)胚胎在癌症的发展。Fgf9表达化验正常鼠胚胎和接触引起的胚胎与手臂ethylenethiourea (ETU)胚胎第十天(E10)。Fgf9表达式被免疫组织化学染色化验,免疫印迹和实时定量聚合酶链反应(存在)。免疫组织化学染色显示Fgf9表达式E13和E16天之间的时空变化。Fgf9-positive成为主流的间质细胞泄殖腔E13 E14灯头和融合现场urorectal隔和泄殖腔膜,直肠上皮和E15肛膜。Fgf9-positive细胞明显减少肛膜破裂后E16天。Fgf9-positive染色明显减少胚胎的手臂与正常的胚胎相比E13 E15。西方的屁股和存在的结果一致,与显著增加Fgf9表达式后肠和直肠正常胚胎的胚胎E15的手臂从E13。然而,两组之间没有差别E16天。这些结果表明,肛门直肠的胚胎发生可能取决于Fgf9信号的感应。 The expression of Fgf9 was downregulated in ETU-induced ARM embryos, which might be related to the development of ARM.

1。介绍

肛门直肠畸形(ARM)是先天畸形发生在大约2500 - 3500年全球活产(1,2),通常与多个畸形有关。临床表现不同从肛门狭窄、肛门直肠瘘持久泄殖腔(3]。尽管新生儿护理和手术技术的进步,许多患者手臂很长一段时间仍需要接受挑战,包括肠和膀胱功能障碍,性功能障碍和社会心理问题(4,5]。病因、胚胎学和发病机理知之甚少的手臂也是有争议的。目前的证据表明,手臂是一个复杂的多基因疾病和链接Hox基因家族,声波刺猬信号,Wnt信号通路,骨形态发生蛋白4 (Bmp4)和纤维母细胞生长因子10 (Fgf10) [6- - - - - -10]。

fgf组成的22位基因家族编码乙酰肝素sulfate-binding蛋白质和细胞生长调节器和胚胎发育与纤维母细胞生长因子受体结合后(Fgfrs)。先前的研究已经记录了Fgf10和Fgfr2b基因的异常表达在老鼠胚胎臂(10,11的角色),但Fgf基因家族的其他成员在手臂的形成并没有被研究过。有证据Fgf9和Fgf10互惠epithelial-mesenchymal信号是不可或缺的在某些器官发生12,13]。胚胎发育期间Fgf9活动臂尚未被证实。为了揭示Fgf9的监管效果的手臂,我们分析了分布和表达水平的Fgf9 E13 E16天在老鼠胚胎ethylenethiourea——通过免疫组织化学方法(ETU)诱导的手臂,免疫印迹和实时定量聚合酶链反应(存在)。

2。材料和方法

2.1。模型制备及标本收集

动物伦理委员会批准的这项研究是与中国医科大学附属盛京医院。创建手臂胎鼠模型的过程被描述之前(14]。55 time-mated怀孕的老鼠被随机分配到一个正常的或一只手臂集团和gavage-fed,要么ETU 1%的单一剂量125毫克/公斤(奥德里奇化工有限公司潘茨堡,德国)或同等体积的生理盐水胚胎第十天(E10)。E0,精子在阴道涂片可见后一夜之间交配。剖腹产进行E13-16,大约三分之一的恢复胚胎在4%多聚甲醛固定24小时至48小时之内。胚胎被脱水和嵌入在石蜡,和3.5μm连续矢状部分被切割和安装在幻灯片准备免疫组织化学染色。免疫印迹和存在化验后肠和直肠剩余的胚胎在放大解剖,立即冻结在液态氮,并存储在−80°C到使用。

2.2。免疫组织化学染色

如前所述(执行免疫组织化学染色15)使用一个s p高灵敏度工具包(Maixin生物技术,福州,中国)。抗原检索,幻灯片被加热沸腾0.01 mol / L的pH值6柠檬酸缓冲了10分钟。冷却到室温后,非特异性结合位点被3%过氧化氢酶抑制剂和正常山羊血清。一夜之间,组织部分被孵化在4°C的anti-Fgf9兔多克隆抗体1:150迪勒(Abcam,剑桥,英国)。第二天早晨,放钱的部分被允许孵化与生物素化的山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体在室温下为20分钟。颜色是与开发3,3 - - - - - -diaminobenzidine (ZsBio,北京),以及部分与苏木精复染色。组织是由光学显微镜观察和拍摄数码显微镜摄像头(尼康Eclipse Ci、东京、日本)。负控制准备通过省略一级或二级抗体或孵化的当量浓度多发地兔抗血清。

2.3。蛋白质提取和免疫印迹分析

组织收集的肛门和直肠手臂模型和正常大鼠胚胎是汇集和用重蒸馏的H₂O含有蛋白酶抑制剂。蛋白质提取(50μ在90°C g)被加热变性5分钟,然后存放在冰箱−80°C到使用。蛋白质样本由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page);Beyotime、上海、中国),转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Billerica的微孔,MA),阻止5%脱脂牛奶Tris-buffered盐水为1.5 h在室温下,一夜之间和孵化在4°C主anti-Fgf9兔多克隆抗体(Abcam,剑桥,英国;1:1000迪勒)。膜是孵化与辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体(Beyotime,上海,中国;1:1000迪勒)在室温下2 h。化学发光底物工具包(BeyoECL明星;Beyotime、上海、中国)是用于检测应用。在每一个车道,β肌动蛋白作为内部标准规范化蛋白表达。

2.4。核酸提取、逆转录和rt - pcr

试剂盒(美国生活表达载体技术,卡尔斯巴德,CA)试剂用于收集从肛门和直肠组织中提取总RNA从正常和手臂的胚胎。总RNA分离的纯度是由260:280海里吸光度比值,将介于1.8和2。提取的RNA是储存在−80°C。逆转录执行一个商用设备(豆类,大连,中国)。5提出了Fgf9引物用于存在 - - - - - -GCAGTCACGGACTTGGATCATTTA-3和反向5 - - - - - -TCCACACCACG AATGCTGAC-3 。的表达β肌动蛋白看家基因(豆类,大连,中国)作为内生控制。LightCycler(豆类,大连,中国)总反应系统和SYBR绿色PCR反应混合液(豆类,大连,中国)。反应项目化验20μL的样本,包括在95°C predenaturation 30年代,5 s在95°C的变性,30年代的退火60°C,和40个周期。放大后,系统(应用生物系统公司7500年,新加坡)自动生成每个样例的CT值。2的计算^−ΔΔCT值是用来比较基因表达在正常和手臂的组织。

2.5。统计分析

GraphPad Prism 6. x。C是用于统计分析。Fgf9差异表达在正常和部门组织进行比较 - - - - - -测试。结果表示为 。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。一般的观察

没有观察到畸形在223年从正常的老鼠胚胎。胚胎的数量在不同妊娠年龄如表所示1。所有271 ETU-treated胚胎有短或没有尾巴;没有一个胚胎在子宫内死亡。手臂在ETU-treated胚胎的79%,和最常见的畸形是持久泄殖腔或rectourethral瘘在光学显微镜下。臂组胚胎的数量在不同妊娠年龄如表所示2。

3.2。免疫组织化学结果

E13正常组,泄殖腔形成最后的尾巴,和urorectal隔(一致)的泄殖腔分为泌尿生殖窦(UGS)和原始直肠(后肠)。丰富Fgf9-immunopositive泄殖腔间质细胞存在,和一些积极的上皮细胞中表达后肠(数字1(一)和1 (b))。E14灯头,一致的后代和泄殖腔分为UGS和后肠。Fgf9-positive细胞主要是表现在间质,包括用户需求说明书和后肠。少数阳性细胞在肠道上皮细胞和周围的肛门(数字2(一个)和2 (b))。E15,一致的上皮细胞融合与泄殖腔膜(CM),导致直肠尿道的分离。CM还没有被打破。许多Fgf9-positive细胞被认为在融合的用户需求说明书和厘米。强阳性细胞存在于结肠和直肠的上皮细胞,尤其是在终端直肠和肛门膜(数字3(一个)和3 (b))。在E16天从尿道直肠完全分离,肛门膜破裂。直肠与外界沟通。Fgf9-positive细胞被认为在结肠和直肠的上皮和融合的网站用户需求说明书和厘米,但阳性细胞明显减少(数字4(一)和4 (b))。

E13在胳膊上,泄殖腔没有通常的结构,Fgf9-positive细胞很少出现在间质和上皮(数字1 (c)和1 (d))。E14灯头,后肠到厘米的距离比较长,和弱阳性Fgf9所包含的间质细胞(数字2 (c)和2 (d))。E15,瘘是明显在直肠和尿道之间,并与CM用户需求说明书没有融合。Fgf9-positive细胞间质内的分散用户需求说明书,并没有出现在直肠上皮(数字3 (c)和3 (d))。E16天,用户需求说明书没有融合与CM;只有零星的Fgf9一致和直肠的间质细胞(数字4 (c)和4 (d))。

3.3。免疫印迹分析

Fgf9蛋白表达后肠和直肠的开发过程中被西方墨点法化验。Fgf9发现30 kDa乐队能够从正常的蛋白质提取和手臂的组织。每个乐队都对相应的规范化β肌动蛋白带。Fgf9表达式从E13 E15在正常大鼠胚胎,但相对较低的手臂胚胎。Fgf9蛋白质表达两组之间的差异是显著的E13 E15(图5)。E13,相对表达 在正常的胚胎, 在手臂的胚胎。E14灯头上相应的值 和 并被 和 E15。在E16天Fgf9开始减少的表达在正常和手臂组,两组之间没有统计学差异。相对表达 在正常的胚胎, 在手臂的胚胎。

3.4。存在分析

Fgf9 mRNA表达化验后肠和直肠的正常老鼠和手臂。Fgf9 mRNA的表达明显高于正常胚胎比手臂胚胎E13 E15,所计算的2^−ΔΔCT(E13: vs。 ;E14灯头: vs。 ;E15: vs。 ; )(数据6(一)- - - - - -6 (c))。E16天,两组之间没有差别(E16天: vs。 ; )(图6 (d))。

4所示。讨论

手臂是一个病理过程,是由复杂的因素造成的。虽然之间有激烈的辩论学者持有不同的观点,人们普遍认为,手臂与发育不良的泄殖腔和融合的失败与CM用户需求说明书14,16]。用户需求说明书的融合与分离的CM是至关重要的的直肠尿道E15在老鼠胚胎。在E16天直肠肛膜破裂,与外部通信。ETU-induced胳膊鼠胚胎,一致没有融合maldeveloped厘米和背厘米。

在这项研究中,我们研究的时空表达模式Fgf9在正常肛门直肠的开发通过免疫组织化学染色法,免疫印迹分析和实时rt - pcr。Fgf9-positive细胞间质中表达主要是一致的和后肠E13 E14灯头,免疫组织化学。E15,免疫反应性的细胞主要是发现在直肠上皮,肛膜和网站一致的融合和厘米。在E16天Fgf9-positive细胞明显削弱。西方墨点法和存在显示Fgf9蛋白质和mRNA的表达从E13 E15,增加但Fgf9肛膜破裂后表达降低。如此高的特定Fgf9时空表达表明Fgf9可能在肛门直肠的发展起着关键的作用。

有一个不平衡的时空表达Fgf9在手臂的发展。E13 E14灯头,Fgf9-positive细胞很少出现在泄殖腔间质。在E15 Fgf9-positive细胞分散在用户需求说明书,并且没有一个出现在直肠上皮。E16天肛膜不破裂;只有零星的Fgf9一致的间质细胞和直肠。西方墨点法和存在显示Fgf9蛋白质和mRNA的表达显著减少后肠和直肠的手臂胚胎比正常胚胎E13 E15。这些结果表明,Fgf9参与癌症的形成和异常表达Fgf9形态发生中可能涉及的手臂。

Fgf9是一个重要的成员互惠mesenchymal-epithelial Fgf信号通路介导细胞在胚胎发生相互作用。Fgf9首次报道在人类神经胶质瘤细胞系和分泌的多肽,是活跃在肺癌和骨骼发育和类固醇生成产后睾丸间质细胞(17- - - - - -20.]。它是高度保守的,> 93%序列的身份在非洲爪蟾蜍,老鼠,老鼠,和人类21),这表明Fgf9跨物种进化很重要,可能有类似的功能。

动物实验表明,Fgf10正常肛门直肠的发展至关重要,和Fgf10失效导致基因复制的手臂10]。但畸形是一个类型;没有直肠上皮和直肠之间没有瘘和尿液排出。据推测,孤立的手臂没有其他异常可能发生不由于删除Fgf10基因本身,而是一个突变的监管元素控制直肠Fgf10表达式。Fgf9诱导间质扩散和移植间充质Fgf10表达式在盲肠和肺部的发展(12,22- - - - - -24]。Fgf9-Fgf10互惠epithelial-mesenchymal细胞相互作用对胚胎发育至关重要的盲肠和肺。和Fgf9的表达影响的功能Bmp4和Wnt通路(肛门直肠的发展至关重要23,24]。我们假设Fgf9可能影响癌症的发展作为转录因子通过调节Fgf10的表达。

我们观察到显著差异的表达Fgf9之间正常的胚胎和手臂在癌症的发展。结果表明,肛门直肠的形态可能取决于Fgf9信号的感应,Fgf9的差别,对这些可能的原因之一。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号81200445)。

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