电针通过降低促肾上腺皮质激素释放因子调节肠-脑相互作用障碍的大鼠模型

摘要

客观的。针灸治疗肠易激综合征(IBS)有效;然而，其作用机制还没有完全弄清楚。目的探讨电针对肠-脑相互作用障碍的双重调节机制。方法。慢性不可预测轻度应激(CUMS)产生大鼠肠易激综合征模型。32只大鼠中的8只被分配到空白对照组。其余24只大鼠接受14天的CUMS治疗。存活并造模成功的大鼠随机分为CUMS组、CUMS+EA组和CUMS+PB(匹那维溴铵)组。治疗后14天，CUMS+EA组大鼠在ST25处针刺(Tianshu), ST36 (Zusanli), SP6 (三阴交)，及LR3 (Taichong)每天15分钟。CUMS+PB组大鼠给予松阴每天2.7 mg/mL灌胃。在基线、第15天和第30天测量内脏痛阈值、在升高+迷宫试验(EPMT)中展开双臂的时间百分比(OT%)和蔗糖偏好试验(SPT)中的蔗糖偏好(SP%)。实验结束时检测occluden -1 (zonula occluden -1)的表达、肠上皮结缔组织形态、下丘脑CRF和CRF- r1 mRNA表达、肠黏膜肥大细胞(IMMC)和CRF- r1的双染色。结果。与空白对照组相比，CUMS组下丘脑内脏痛阈压、ZO-1、OT%、SP%、CRF、CRF- r1 mRNA表达及IMMC、CRF- r1双染色均明显降低。同时，CUMS组的连接结构形态不明显。与CUMS组相比，CUMS+EA组SP%显著增加，而CUMS+PB组与CUMS+EA组无显著差异。两组结缔组织形态清晰可见。而上述其它参数在两组中的表达均明显增加。与CUMS+PB组相比，CUMS+EA组中ZO-1表达明显增强。其他参数在两组间无明显差异。结论。EA治疗可以降低下丘脑CRF和CRF- r1的表达，缓解焦虑和抑郁，同时降低CRF- r1在胃肠道粘膜的表达，增加ZO-1的表达，调节紧密连接(tight junction, TJs)修复肠黏膜屏障。上述作用提示EA可能具有缓解肠易激综合征胃肠道症状和心理症状的双重作用，提示EA在调节肠易激综合征大鼠肠-脑相互作用紊乱方面可能具有双重治疗作用。

1.介绍

IBS是一种常见的慢性胃肠疾病，以反复发作的下腹部不适和排便习惯改变为特征[1]。它已经成为一个公共卫生问题，因为它的高流行率[2,3.，病理不清，治疗不理想[4]。内脏过敏是肠易激综合征的主要表现，与焦虑、抑郁等相关[5]。此外，最新发布的罗马IV提示肠易激综合征的发病机制主要是肠-脑相互作用障碍[6]。

有相当多的研究发现针刺可以改善胃肠运动，降低肠道通透性，减少内脏过敏反应[7,8]。我们之前的多中心随机对照试验表明，EA对IBS有效，在缓解焦虑方面优于洛哌丁胺[9]。然而，针刺调节胃肠症状和心理症状的潜在机制仍有待进一步研究。

越来越多的证据表明，CRF主要产生于下丘脑室旁核，与中枢CRF- r1结合可引起排便习惯改变、内脏过敏以及焦虑样或抑郁样行为等情绪障碍[10]。

肥大细胞是广泛分布于肠粘膜的重要免疫细胞。IBS患者IMMC的数量和活性均与肠道通透性呈正相关[11]及腹痛[12]。过分泌CRF可激活IMMC细胞膜上CRF- r1的表达[13]。也有研究表明CRF过表达导致TJ改变，增加肠道通透性[14]。TJs是形成上皮屏障的细胞间连接中最重要的蛋白，其损伤可增加肠道通透性[15]。ZOs是TJs的组成部分之一[16]，已发现其表达降低导致结肠粘膜通透性增加[17]。因此，过分泌CRF激活CRF- r1可增加IMMC表达和肠道通透性，降低ZO-1表达，从而导致IBS的胃肠症状和心理症状。

我们推测EA可以降低下丘脑和胃肠道粘膜CRF和CRF- r1的表达，同时上调ZO-1的表达，调节TJs以修复肠黏膜屏障。因此，EA可能在减轻IBS大鼠胃肠道和心理症状以及调节肠脑相互作用紊乱方面发挥双重作用。

2。材料和方法

2.1。动物和研究设计

SD大鼠（性别一半，8周龄，体重和 )均来自四川医学科学院，成都，中国。它们被关在单独的笼子里(雌雄分开)，保持12小时的光/暗循环(8点亮灯)，食物和水可以随意获得。本实验获得了成都中医药大学实验动物福利伦理委员会的批准(参考号:2016 - 02)。实验依据《国家实验动物护理与使用指南》(修正案2)(中国国务院，2013年)进行。所有的努力都是为了尽量减少痛苦。

适应1周后，32只大鼠中有8只被分配到空白对照组。其余24只大鼠接受14天的CUMS治疗。以结直肠膨胀(CRD)压、OT%、SP%作为模型建立指标。存活成功造模的大鼠随机分为CUMS组、CUMS+EA组和CUMS+PB组。治疗14天后，进行上述行为测试。所有动物在异氟醚麻醉下实施安乐死。在整个实验过程中，动物被分成2-4组饲养，除非它们被隔离、高密度的饲养或进行行为测试。

2.2。和过程

压力累积过程包括以下七个方法:高密度住房24 h,分离住房24 h,克制2 h, 45°C温暖游泳5 - 10分钟,尾巴夹20分钟,不可避免的冲击15分钟(2妈,30年代,270年代),和1 h [240 Hz shaking-crowding18]。所有的方法都是随机使用的，而不是连续使用同一种方法。在治疗期间，除空白对照组外，所有大鼠均持续暴露于应激源中。

2.3。EA治疗

选取治疗肠易激综合征常用的四个穴位。它们是ST25 ST36 SP6和LR3。ST25位于肚脐水平处前中线外侧5毫米处。ST36位于膝关节后外侧，在纤维小头下方5mm处。SP6位于后肢外踝突出处10毫米以上。LR3位于足背的第一和第二跖骨之间。EA是由一个受过良好训练的针灸师执行的，每天一次，连续14天。在治疗期间，大鼠受到抑制，但意识清醒。不锈钢一次性使用针灸针( ,在ST25和ST37处插入4-5 mm，在SP6和LR3处插入2-3 mm，连接EA仪(HANS-200A，中国南京)。电刺激以色散密集波的形式进行，频率分别为2hz和15hz，强度为1ma，持续15分钟[8,19,20.]。其他的动物只接受了15分钟的约束压力。

2.4。Pinaverium治疗

Pinaverium(法国雅培保健公司)溶于浓度为2.7 mg/mL的无菌蒸馏水中，以10 mL/kg灌胃给药给药组大鼠，每日一次。其他动物只接受蒸馏水灌胃[21,22]。

2.5。内脏痛觉过敏的行为评估

在行为评估前24小时，小鼠被剥夺食物但可以自由饮水。在乙醚麻醉下，将制备好的撒克逊碱覆盖的结直肠扩张球囊完全插入降结肠和直肠。将大鼠放入透明丙烯酸盒子( )在30分钟内都不能逃脱或转身直到完全从麻醉中恢复。气球的导管通过一个三肢管连接到一个台式模型血压计。将气球插入大鼠肠道，每隔5秒充气5毫米汞柱，直到观察到腹壁明显收缩。选择扩张时间20s和两次扩张间隔5min。采用5个AWR评分(AWR 0 ~ AWR 4)评估内脏刺激强度[23]: AWR 0:无显著行为变化;AWR 1:鼠体不动或偶尔摆动头部;AWR2:轻度腹肌收缩;AWR 3:抬起腹部或使腹部平展;和AWR 4:身体拱或提升骨盆结构。疼痛阈值定义为大鼠在结直肠膨胀(CRD)过程中出现腹部扁平(AWR 3)时球囊内的最小压力[18]。所有的测量都由两位盲法观察者进行操作，重复三次，取平均值。

2.6。焦虑-抑郁的行为评估

2.6.1。蔗糖偏好测验(SPT)

动物在笼中习惯2瓶水3天后，在处理前6小时取出水瓶。每只动物可自由选择白水和2%蔗糖溶液，持续12小时。瓶子的位置在测试笼子的左边或右边被平衡。测定12h暗循环期间的水分摄入量和蔗糖摄入量。蔗糖对水的偏爱被用作一种快感测量[18]。

2.6.2。高架+迷宫测试(EPMT)

在EPMT物上由两个加形的装置进行 张开双臂 enclosed arms elevated 50 cm from the floor. The EPM was conducted in a room illuminated by a single red light bulb over the centre of the maze. Each rat was placed on the maze for 5 min. The apparatus was novel to the rats at the time of testing, and each rat was tested only once. After each rat test, the maze was wiped with ANNE Q (pet deodorant) to prevent odours causing disturbance to the following rats. Sessions were video recorded and scored for (1) time spent in the open arms, (2) time spent in the closed arms, (3) time spent in the central area, and (4) the total time of each subject by an observer blind to the animal’s group. A rat was considered to have entered or spent time in an arm only when all four paws were in the respective arm. The percentage of time in the open arms to the total time deducted from the central area was analysed [24,25]。

2.7。组织抽样

处死大鼠后，迅速采集下丘脑和远端结肠(肛门近端3cm)。用0.9%生理盐水冲洗肠道内容物。将清洁后的结肠迅速置于4%聚甲醛中，室温固定48 h后进行免疫组化分析。位于视交叉后缘和垂体前叶之间的下丘脑被锡纸包裹并迅速放入液氮中。然后，将下丘脑从液氮中取出，保存在−80℃，用于后续的荧光定量PCR (fq-)分析。

2.8。PCR检测下丘脑CRF和CRF- r1 mRNA

使用TriPure分离试剂(德国罗氏公司)按照说明书从下丘脑组织中提取总CRF RNA和CRF- r1 RNA，使用NanoDrop 2000超显微分光光度计(Thermo，美国)测定RNA数量。cDNA是使用逆转录酶试剂盒(Roche，德国)合成的。使用的基因特异性PCR引物(上海生工生物技术有限公司，中国)序列如下:CRF mRNA: forward: 5 -TCTCTGGATCTCACCTTCCACCTT-3 ;反向:5 -AGTTTCCTGTTGCTGTGAGCTTGC-3 ;CRF-R1 mRNA:正向:5 -TCGGGAGAAGGCTACCAGAC-3 ;反向:5 -GGCTTCGCACCCTTCCG-3 ;和β-actin mRNA:正向:5 -ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3 ;反向:5 -CTGACCCATACCCACCATCAC-3 。20例患者进行CRF mRNA和CRF- r1 mRNA的fq-RT-PCR检测μL取SYBR Green PCR Master Mix(德国罗氏公司)95℃2 min，使用LightCycler 480(德国罗氏公司)，在95℃15 s、60℃、60℃15 min的40个循环。

2.9。免疫组织化学

将结肠组织置于4%多聚甲醛中浸泡固定72 h，石蜡包埋，切成5片μ米厚的部分。切片经TBS洗涤后，在0.5% Triton X-100中孵育30分钟，用10%山羊血清在TBS中37℃封闭2小时。

2.9.1。CRF-R1和IMMC双重标记

切片用山羊anti-CRHR1/CRF-R (aa250-263，第26条)在37℃下孵育1 h。第07553号，Everest Biotech，英国)和兔抗肥大细胞胰蛋白酶抗体。(No. 196772, Abcam，美国)用10%山羊血清在4℃孵育过夜前用TBST稀释。第二天，切片被清洗，并与驴抗山羊IgG H&L (Alexa Fluor®488,Art。和驴抗兔IgG H&L (Alexa Fluor®647,Art.)。(No. 150075, Abcam, USA)，用10%山羊血清TBS在37℃下稀释1 h。切片清洗后，用防褪色安装介质覆盖，在200倍放大的荧光显微镜(Olympus BX51，日本)下检查。

2.9.2。ZO-1的表达

切片用anti-ZO-1在37℃孵育1 h(第3条)。(美国Abcam公司，No. 96587)用10%山羊血清用TBST稀释，4℃孵育过夜。第二天，冲洗切片，用生物素标记的二抗孵育，用10%山羊血清TBS稀释，37℃孵育1 h。洗涤后，用防褪色裱贴介质覆盖切片，用光学显微镜(德国徕卡DM1000)放大400倍进行检查。

2.10。透射电子显微镜（TEM）

在结肠组织被切开后 ,将样品在2.5%戊二醛中，4℃下固定2 h，用0.1 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次45 min。样品用1%四氧化锇固定1小时，如前所述冲洗，用1%醋酸铀酰染色2小时。用丙酮脱水后，将组织分别浸泡在丙酮和环氧树脂溶液中，在45℃包埋聚合3 h, 65℃包埋聚合48 h。将样品切成70 nm的超薄切片，用醋酸铀酰染色40 min，柠檬酸铅染色15 min。样品在日本日立HT7700显微镜下进行结肠组织超微结构分析。

2.11。统计分析

采用SPSS V.15.0软件(SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺斯州，美国)进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验来检验数据的正态性。正态分布和非正态分布的数据表示为 和中位数(IQR)。采用单因素方差分析(ANOVA)和事后最小显著性差异(LSD)检验进行正态性假设和方差数据的同质性。当不符合正态性假设和方差齐性时，采用非参数Kruskal-Wallis检验。邓肯和曼-惠特尼分别采用参数检验和非参数检验进行两两比较。 被认为是统计显著。

3.结果

3.1。基线特征

1只大鼠17天后死亡，最终样本量如下:空白对照组( ）暨集团( ）和+ EA组( ）和CUMS + PB组（ ）。研究中没有其他死亡病例或排除病例。

3.2。EA对内脏痛觉过敏的影响

如图所示1(一)，四组间CRD压力基线(43.34(16.67)、40.84(16.68)、38.35(9.14)、36.67(15.42)差异无统计学意义。 ）。与空白对照组相比，其余三组CRD压力明显降低(21.67 (10.84)，40.00 (16.67); ;15.00(13.34)对40.00 (16.67)， ;20.00(9.16)对40.00 (16.67)， ）。此外，与处理后的CUMS组相比，CUMS+EA和CUMS+PB组CRD压力显著升高(23.33 (6.67)vs. 18.34 (11.67)， ;26.67(6.67)对18.34 (11.67)， ）。两组治疗组间差异无统计学意义(23.33 (6.67)vs. 26.67 (6.67)， ）。

3.3。EA对肠上皮屏障TJs的影响

3.3.1。ZO-1的平均光密度

如图所示1 (b)，与空白对照组相比，CUMS组肠上皮屏障中ZO-1的平均光密度明显受到抑制(1.54(0.18)，而空白对照组为2.87 (0.76)， ）。与CUMS组相比，CUMS+EA和CUMS+PB组均显著提高了ZO-1的平均光密度(2.12(0.10)，而不是1.54 (0.18)， ;2.00(0.18)对1.54 (0.18)，p< 0.01)。此外，CUMS+EA组的ZO-1平均光密度比CUMS+PB组增加更明显(2.12 (0.10)vs. 2.00 (0.18)，p< 0.01)。

3.3.2。ZO-1免疫组化染色

如图所示1 (c)空白对照组肠上皮顶部有大量sepia ZO-1阳性表达。而CUMS组ZO-1的阳性表达明显低于空白对照组，且CUMS组的颜色明显较浅。CUMS+EA和CUMS+PB组ZO-1阳性表达的数量和着色深度在空白对照组和CUMS组之间。

3.3.3。EA对肠上皮细胞下的TEM连接结构的形貌的影响

如图所示2空白对照组肠上皮细胞TJs、黏附连接、缝隙连接、桥粒在透射电镜下清晰可见。而在CUMS组，TJs的结构不明显，没有黏附连接、缝隙连接和桥粒。在CUMS+EA组中，TJs和黏附连接结构清晰可见，桥粒数量少于空白对照组。在透射电镜下，CUMS+PB组的黏附连接、缝隙连接和桥粒清晰;但TJs的间隙较空白对照组大。

3.4。EA对焦虑和抑郁类行为的影响

如图所示图3（a），四组间OT%在基线期间差异无统计学意义(40.37(17.03)、38.21(16.21)、35.99(28.74)、36.76(26.11)。 ）。所有接受CUMS组显示在OT％统计学显著相比减少空白对照组（10.37（12.48）与29.10（21.70）， ;13.94(13.86)对29.10 (21.70)， ;11.99(14.54)对29.10 (21.70)， ）。处理后，CUMS+EA、CUMS+PB组OT%较CUMS组明显升高(32.60(43.12)、3.67 (8.05)， ;15.43(14.62)对3.67 (8.05)， ）。两组比较，32.60 (43.12)vs. 15.43(14.62)差异无统计学意义， ）。

如图所示图3（b）无显著差异，在基线时的四组之间SP％（89.44（34.26）发现，69.27（31.88），68.78（22.31），和69.39（30.32）， ）。建立模型后，与空白对照组(38.91(34.77)和79.51(22.57)相比，其他三组的SP%显著降低， ;44.93(10.72)对79.51 (22.57)， ;和44.06（18.58）与79.51（22.57）， ）。处理后，CUMS+EA和CUMS+PB组的SP%明显高于CUMS组(71.69 (29.39)vs. 53.35 (29.77)， ;53.92(37.35)对53.35 (29.77)， ）。两组治疗组间差异无统计学意义(71.69 (29.39)vs. 53.92 (37.35)， ）。

3.5。EA对下丘脑CRF和CRF- r1的影响

如图所示图3（c），与空白对照组相比，CUMS组下丘脑CRF的相对表达量明显升高(1.75 (0.77)vs. 0.92 (0.40)， ）。与CUMS组相比，CUMS+EA和CUMS+PB均明显抑制CRF的表达(1.25 (0.45)vs. 1.75 (0.77)， ;1.02（0.58）与1.75（0.77）， ）。CUMS+EA和CUMS+PB组间差异无统计学意义(1.25 (0.45)vs. 1.02 (0.58)， ）。

如图所示3 (d)，与空白对照组相比，CUMS组下丘脑CRF-R1表达明显提高(5.18(8.02)，而空白对照组为0.67 (1.29)， ）。与CUMS组相比，CUMS+EA和CUMS+PB显著抑制CRF-R1的表达(0.92 (0.87)vs. 5.18 (8.02)， ;1.15(0.55)对5.18 (8.02)， ）。还有就是CUMS + EA和CUMS + PB组（0.92（0.87）与1.15（0.55）之间没有显著差异， ）。

3.6。EA对胃肠道粘膜CRF-R1和MC的影响

如图所示图4（a），与空白对照组相比，CUMS组胃肠道粘膜MC和CRF-R1的双免疫染色细胞明显增加(90.50(9.00)，而空白对照组为40.50 (9.75)， ）。与CUMS组相比，CUMS+EA和CUMS+PB均显著减少CRF-R1和MC双染色的细胞数量(57.00 (12.00)vs. 90.50 (9.00)， ;56.50(16.75)对90.50 (9.00)， ）。无显著差异的CUMS + EA和CUMS + PB组（57.00（12.00）与56.50（16.75）之间发现，p >0.05)。

为评价MC和CRF-R1在胃肠道粘膜的相关性，在大鼠胃肠粘膜切片上对MC和CRF-R1进行双标记。结肠黏膜中与MC共定位的CRF-R1比例较高。细胞内CRF-R1免疫反应性为绿色细胞质染色，红色为IMMC染色阳性，而CRF-R1和IMMC双染色为黄色，如图所示4 (b)。

4.讨论

据指出，在功能性胃肠病的罗马IV标准该IBS是肠脑互动的障碍，进一步阐述在IBS [肠道和情绪症状之间的interinfluence的重要性26]。内脏超敏是肠易激综合征的主要表现，也是其病理生理原因之一。此外，20% - 60%的IBS患者存在焦虑、抑郁等精神障碍，与IBS呈正相关[27]。

AWR是肠道敏感性的主要指标。既往研究发现，当十二指肠受到强烈扩张刺激时，IBS患者的疼痛阈值明显低于健康患者[28]。在本研究中，我们使用相应的血压计对AWR痛阈值(AWR 3)的读数作为内脏敏感性的指标。结果还显示，慢性阻塞性睡眠呼吸暂停后，IBS大鼠内脏痛阈明显降低。此外，EA和PB治疗可有效降低内脏过敏，但无明显差异。这一发现与其他研究表明针刺可降低内脏超敏反应，降低肠道通透性，改善胃肠运动一致[7,8]。此外，EA的作用相当于指南推荐的药物PB。

TJs损伤可破坏肠上皮屏障，增加肠通透性[29,30.]。在IBS患者的结肠ZO-1的表达明显降低并且反比于肠黏膜通透性[31]。本研究发现结肠中ZO-1表达减少，TEM下TJ结构模糊，无黏附连接、缝隙连接和桥粒，显示肠上皮屏障受损，粘膜通透性增强，与前述报道一致。在我们的研究中，EA和PB有效的改善了结肠ZO-1的表达，恢复了肠上皮屏障，EA优于PB，这与HX Shang的情况相似:针刺克罗恩病12周后，肠上皮中ZO-1的表达较美萨拉嗪升高[32]。此外，EA和PB处理后的ZO-1免疫组化染色数量和染色深度均较好。透射电镜下可见改善的TJs和EA的黏附连接清晰，但改善的桥粒不清楚;同时，带PB的黏附连接、缝隙连接和桥粒均有可见的结构;然而，TJs的改善并不明显。先前的一项实验发现，EA治疗的大出血大鼠表现出强大的ZO-1结构，且其ZO-1表达明显高于模型组[33]。我们的结果和他们的相似。因此，EA通过增强TJs中ZO-1的表达，改善肠上皮屏障，降低肠黏膜通透性。

以OT%和SP%评价精神障碍大鼠的焦虑样行为。本实验中，造模后大鼠OT%和SP%均明显下降，且EA和PB均能有效提高OT%。EA能显著提高SP%至相对正常水平，PB对其无有效影响。因此，EA在改善抑郁样行为方面可能优于PB，尽管两种治疗方法之间没有显著差异。这一结果与以下发现一致:EA可以提高抑郁大鼠的SP%，减轻大鼠的焦虑和抑郁样行为，其作用与抗抑郁药PB相似[34]。

已有研究表明，中枢CRF-R1的激活与精神障碍、内脏过敏和肠道运动的增加有关[35];肠道CRF-R1的激活与肠道运动引起的腹痛和内脏过敏有关[13,36]。激活的肠道CRF-R1可增加IMMC的含量。我们的研究发现，IBS大鼠下丘脑CRF、CRF- r1 mRNA表达水平、胃肠粘膜CRF- r1表达水平、IMMC表达水平均明显升高。EA和PB均能有效降低下丘脑CRF和CRF- r1的表达，下调胃肠道粘膜CRF- r1和IMMC的表达。EA在减弱下丘脑CRF和CRF- r1表达方面优于PB，而在降低CRF- r1和IMMC表达方面同样有效。因此，EA可以有效下调下丘脑和IMMC中CRF- r1的表达，降低下丘脑CRF的表达，减轻大鼠内脏过敏和焦虑抑郁样行为，符合Wu HG的研究[37]。他发现EA可以减弱IBS大鼠内脏超敏性，其与结肠黏膜MC降低和脱颗粒率有关。

总之,我们的研究表明,EA可以降低下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子的表达和CRF-R1,缓解精神障碍,同时减少的表达CRF-R1胃肠粘膜,减少IMMC,增加ZO-1表达式,并调整套修复肠道粘膜屏障,这表明一个潜在的双重治疗作用EA在缓解IBS的胃肠道症状和心理,这意味着EA可能调节肠易激综合征大鼠的肠-脑相互作用紊乱。

数据可用性

支持本研究结果的数据可从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

YC和YZ共同参与了手稿的起草工作。SYZ和YL作为协通信作者设计了这项研究。HZ、SYZ和YL对手稿进行了修改。YC、YZ和DL完成了大部分的实验工作。YC, YZ, SYZ参与了数据分析。所有作者批准最终版本接受出版。

致谢

感谢成都中医药大学针灸推拿学院实验室。国家自然科学基金(No. 81503665)资助。

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