在结直肠癌结肠粘膜微生物群:在沙特阿拉伯一个单中心宏基因组研究

文摘

背景和目的。因为基因和地理存在肠道菌群的变化,本研究的重点是建立一个评估微生物群的结直肠癌(CRC)病人在沙特阿拉伯通过宏基因组研究。方法。从2010年7月到2012年11月,结直肠癌患者参加我们医院为宏基因组研究。所有接受临床、内镜和组织学评估。粘膜微生物群样本收集从每个病人jet-flushing结肠粘膜与蒸馏水在统一的结肠段,其次是愿望,在结肠镜检查。总纯化dsDNA提取并量化之前使用一个Illumina公司宏基因组测序平台。令人满意的DNA样本( )受到宏基因组研究,其次是比较系统全面的分析。同等数量的年龄组的健康也检查结肠粘膜微生物群。结果。宏基因组数据29例(14雌性)年龄38 - 77年进行了分析。大多数11(37%)的患者超重(体重指数= 25 - 30)。直肠出血症状的18/29(62%),而症状贫血症状的11/29 (37%)。结肠癌的位置是在14个(48%),直肠在盲肠的增长在8 (27%)。肝曲增长被发现1例(3%),下降结肠增长中发现2(6%),4例(13%)患者横结肠增长。宏基因组进行分析,共3.58克读取被测序,和321.91 g数据用于分析。本研究确定了11个属特定于结直肠癌患者对照组相比,属。脆弱拟杆菌和梭菌属被发现显著普遍癌组与对照组相比。结论。当前的研究有着深刻的了解到微生物群的结直肠癌患者在沙特阿拉伯和确认各种属明显出现在这些患者与对照组相比。

1。介绍

宏基因组是一个分子文化无关微生物学的方法,直接从环境样品中遗传物质恢复进行了研究。它已成为一种最健壮的sequence-driven方法研究成分和粘膜肠道微生物群的遗传潜力。宏基因组分析已经开始展示功能的广度和代谢微生物的潜力。它被用来展示重要代谢患病和健康个体之间的差异。虽然个体的肠道微生物群反映了伟大的变化在人们根据他们的年龄、地理起源、健康状况,饮食的变化,它倾向于长期保持稳定(1]。

肠道微生物群的改变可导致结肠内炎症的发展,等炎症与结肠肿瘤的发展。虽然微生物群的精确机制通过参与癌症发展仍然是难以捉摸的,消息是,然而,明确:微生物群有助于癌症风险通过影响一些基本主机进程(2]。这意味着可改变的危险因素干预调节肠道微生物群有助于减少结肠癌的发病率和死亡率。

患结直肠癌(CRC)的风险之间存在明显差异,在人口和地理区域(3]。因此,致癌作用的各个方面在结肠癌解决由不同人员不时在沙特阿拉伯(4- - - - - -8),但我们最好的知识和文献检索后,似乎没有现有的数据关于微生物群在CRC的角色在这个世界的一部分。因此,我们提示进行这项研究,首次在沙特阿拉伯,我们试图反思粘膜CRC患者肠道菌群的作用。

将谨慎地提到粘膜微生物群的生活接近肠道上皮细胞相比,腔内微生物群,可以想象,它将互动更直接与宿主的免疫系统比鲁米那/粪便细菌。很可能粘膜微生物群可能更直接参与诱导结肠致癌作用。此外,营养的可用性的黏液层上皮细胞也完全不同,在肠道内腔环境。实质性的差异粘膜和粪便微生物成分已被证明存在9,10]。因此,我们选择粘膜样本而不是为这个宏基因组研究CRC患者粪便样本。的微生物群与年龄和准确性控制。

2。材料和方法

这项研究是在完全符合进行良好的临床实践指南的世界医学大会赫尔辛基宣言》和国王法赫德的研究指导医疗城(KFMC),利雅得。这项研究是通过伦理委员会批准的阿卜杜勒阿齐兹国王科技城和KFMC,利雅得。

2.1。入选标准为研究对象

在研究期间(2010年7月和2012年11月),所有结肠镜检查患者在国王法赫德医疗城(KFMC),利雅得,被要求提供具体的书面同意,可能会出现在这个研究。样品收集以下类型的病人结肠镜检查过程中被处理。(1)情况下(一)成人患者诊断结直肠癌的诊断是基于内镜和组织学标准。(2)控制(一)接受筛查结肠镜检查的患者检查与普通结肠镜检查程序。(b)接受结肠镜检查程序降低胃肠道出血的患者曾有痔疮,肛门裂缝。(c)腹痛患者进行结肠镜检查过程,证明有一个正常的结肠镜检查检查

2.2。排除标准

在表示由于结肠癌梗阻患者被排除在外。患者使用抗生素前两周结肠镜检查被排除在外。

2.3。数据收集

人口统计学和临床数据收集从所有参与者,包括年龄、性别和体重指数(BMI)。详细的病史,包括饮食、并发症和采取任何药物或程序执行的顺序,也从每个参与者获得,数据进入一个Microsoft Excel文件。

2.4。肠道准备和样本收集

后一个标准的肠道准备,包括聚乙二醇结肠准备,一个完整的结肠镜检查。在过程期间,蒸馏水被通过活检通道范围收集回来的愿望。统一的粘膜喷射清洗段结肠(盲肠,横向(左)和直肠结肠段)收集研究参与者。每个参与者的健康的粘膜也取样。网站的宏观粘膜异常在任何选择的四段也包括在内。最后,洗的50毫升,随着剩余结肠液体,通过工作吸吸气和活组织检查通道。所有段样品从每个结肠镜检查四15毫升试管收集并立即存放在−80°C进行进一步处理。

2.5。宏基因组测序总DNA提取

段样本每个参与者都是汇集和被认为是代表整个结肠最小化技术错误和变化。DNA样本离心机在5000 g×15分钟,和上层的丢弃。颗粒resuspended在10毫升裂解缓冲(0.5 M Tris-HCl;20毫米EDTA;10毫米氯化钠;0.1% SDS;pH值9.0),和混合均质离心法和颤抖的5 - 10分钟。

样品被稀释(1:2)10毫升裂解缓冲和均质为另一个5分钟。基因组DNA (gDNA)通过添加5毫升7.5醋酸铵沉淀和25毫升冰冷的乙醇(95 - 100%)。样本随后孵化−20°C 20 - 30分钟,和gDNA收集在4500×g离心后在室温下15分钟。球在600年resuspended DNAμL TE缓冲(Tris-EDTA, pH值8.0)和孵化65°C 15分钟。同等体积的phenol-chloroform:异戊醇溶液一度与DNA混合,混合物在离心机12000×g在室温下5分钟。上层水相转移到新管,在有机相的界面和丢弃。此步骤重复直到没有可见的蛋白质在界面。最后一个浮在表面的水相然后转移到一个新的管;两倍的乙醇添加到水相,和存储的解决方案是在一夜之间。第二天,DNA是乙醇沉淀如上所述。结果DNA颗粒resuspended在50μL TE缓冲。的质量和浓度提取的gDNA验证用1%琼脂糖凝胶电泳和一个量子位荧光计3.0(生活技术,卡尔斯巴德,CA)。

2.6。宏基因组DNA库建设和测序

Paired-end (PE)宏基因组DNA进行图书馆建设,根据制造商的说明(测序工具和试剂,Illumina公司,圣地亚哥,CA)。高质量从低质量的读取与读取分离“N”基地,适配器污染,或人类DNA污染Illumina公司原始数据使用BWA-SW算法(H,杜宾r . 2010,生物信息学)。平均而言,高质量的读入所有样本的比例大约是98.1%,和插入大小的PE克隆范围从313个基点,至381个基点。测序和数据处理进行北京基因组研究所Illumina公司GAIIx和HiSeq 2000平台利用序列的样本。

2.7。基因目录结构

前72随机选择样本组合建立nonredundant基因集。预测开放阅读框(orf)的72个样本一致,和基因对高于95%的身份被分组。与类似的基因合并组,每组最长的子组用于表示。因此我们组织nonredundant基因集的所有预测基因剔除冗余子。159年优质读入阶段I, II, III,我们执行从头组装和基因预测使用SOAPdenovo v1.06(罗等。:“SOAPdenovo2:一个经验改进节约内存短内容新创汇编”。GigaScience 2012 1: 18)和GeneMark v2.7 (Ter-Hovhannisyan Vardges, et al。“基因预测小说真菌基因组与无监督算法使用一个从头开始培训”;基因组研究18.12(2008):1979 - 1990),分别。所有预测基因两两对齐使用咩咩的叫声,和基因可以对齐(> 90%的基因长度)超过95%的另一个基因的身份(不允许空白)被裁员,导致nonredundant基因目录。结肠的目录样本进一步结合前面构造元达到基因目录相同的方式通过消除冗余。

2.8。生物信息学分析管道

我们受到多个样本粘膜微生物群metagenome比较系统发育分析理解cultivation-independent肠道微生物群的生态学和系统发育差异样品(图1)。我们都一致的高质量阅读已知细菌,真菌,原生动物的,或人类肠道基因从NCBI数据库,RDP或MetaHIT。对于每一个样本,我们比较配对校准和比对数据库。

2.9。系统分类的子

分类作业对NR90 BLASTp对齐工具进行数据库。联合打击值大于1 e-5被移除,重要的比赛值的顺序相同的被用于确定分类群。我们评估每个基因的分类协会由一个共同的祖先——最低MEGAN43 (LCA)为基础的算法实现。

2.10。统计分析

模块从ipath(引用)中提取测试评估通过Wilcoxon测试控制和癌症之间的组织。Chao1丰富度指数、香农指数和辛普森多样性指数被用来描述α我们的细菌群落的多样性特征。一个值< 0.05被认为是显著的。

β多样性被用来评估情况和控制之间的多样性。主坐标分析(PCoA)基于未加权的UniFrac距离指标被用来证明有粘膜细菌社区之间的差异情况和控制,这是证实了置换多元方差分析(PERMANOVA) PCoA CRC患者。

3所示。结果

32例了CRC宏基因组研究,但其中三个被排除在外,因为较低的DNA样本的数量。最后,29日的数据证实了CRC患者进行了分析以及一群年龄——准确性控制。在这项研究中,有14名女性和15名男性从38岁到77年。

大多数11(37%)的患者超重(体重指数= 25 - 30)。5个(24%)病人分配到肥胖类我(体重指数= 35 - 40)。肥胖第三类体重指数> 40观察一个54岁的男性的话题。只有4个(13%)患者正常BMI(体重指数=年龄在18岁至25岁之间)。一个病人在我们的研究中被观察到轻微薄(BMI = 17 - 18.5),一位66岁的女性的体重指数仅为15.66,如表所示1。

直肠出血是最常见的(18/29,62%)表示CRC组的特点,和11/29或37%的患者出现贫血症状。在结肠镜检查检查,CRC的位置在14(48%),直肠和盲肠的增长在8 (27%)。还有肝曲增长1(3%)和下行结肠增长2(6%),4例(13%)患者横结肠增长(表1)。没有我们的结肠癌患者有家族性综合征或任何结肠癌家族史。

CRC是腺癌的组织学证实了两个histopathologists经验在所有患者的胃肠道组织学。

宏基因组分析和控制的情况下进行如表所示2,总共3.58 G读取测序,约321.91 G数据被用于分析。有用的读入每个样本一致通过soap 4.3 M基因集1 2。平均70.33%读可以映射到基因集;马克斯配给可以达到81.36%。

Chao1丰富度指数、香农指数和辛普森多样性指数用来描述α我们的细菌的多样性特征社区数据所示2和3。模块提取ipath Wilcoxon(引用)测试的测试之间的CRC,对照组为0.23。

所有的结果都映射到9.9 9和10基因集。稀疏的组织之间的区别很重要,如图1。然而,香农α多样性显示病变组之间没有显著性差异,对照组,如图3。

β多样性表明案件之间有着显著的多样性和控制。主坐标分析(PCoA)基于未加权的UniFrac距离指标表明,有一个分离之间的粘膜细菌社区情况下和控制,这是证实了置换多元方差分析(PERMANOVA) PCoA在结直肠癌,如图1。

这是进一步观察到华润集团统计上显著高于11属控制相比,如表所示3。这些属Atopobium,Beggiatoa,洋葱,Collinsella,Comamonas,Finegoldia,梭菌属,Gemella,李斯特菌,Methanobrevibacter,Parvimonas,Peptoniphilus,消化链球菌属,Porphyromonas,月形单胞菌属,Shuttleworthia,Solobacterium,Thermoanaerobacter,Verrucomicrobiales,鼠疫的。细菌的富集在结直肠情况下如图4。

此外,subanalysis肠杆菌科透露说enterotype1在15 CRC患者enterotype2被发现出现在2例。有六个患者enterotype3积极的CRC群。Enterotype1观察更频繁地出现在对照组比CRC组(图5)。

4所示。讨论

致癌作用在结直肠癌(CRC)代表一个异构过程中不同的体分子的改变,可以影响饮食和环境和微生物暴露。最近的证据表明一个重要联系CRC的细菌和微生物群从而确认旧的关系,结直肠致癌作用观察过去。有多种研究表明,肠道的存在拟杆菌vulgatus,拟杆菌stercoris,梭状芽胞杆菌物种都直接与高风险的CRC (3]。假设一些肠道细菌生产genotoxins加强肠道致癌作用,改变免疫应答和肠道微环境,激活致癌信号通路(11]。

在这项研究中,我们有意地选择宏基因组研究结肠洗而不是在粪便样本的证据来支持粘膜微生物群映射是深远的。粘膜微生物群保持密切与肠上皮细胞的交互的粪便中发现的微生物群,还有重要的主体差异性以及粪便和粘膜社区成分之间的差异已经证明了Eckburg et al。12]。

受试者在这项研究中使用的标准肠效用可能认为改变粘膜相关的微生物群的多样性。然而,哈勒尔等人发现分类学分类并没有透露重大变化在门级,但只有在属水平。这项研究的作者得出结论,变化的程度凸显了需要考虑的重要性肠道准备的潜在影响力的影响实验研究[13]。

我们的研究表明,CRC病例显著富集的11个属与对照组相比,如表所示3。宏基因组测序显示特定的物种,如梭菌属nucleatum,消化链球菌属stomatis,Parvimonas微米,明显出现在大量的CRC患者比控制。梭菌属nucleatum已被确认有tumor-based免疫逃避机制bacteria-dependent CRC的发病机制。Gur等人已经证明了梭菌属nucleatum绑定不受NK-mediated杀死肿瘤和免疫细胞攻击由于Fap2 fusobacterial蛋白质之间的相互作用和免疫细胞抑制性受体TIGIT等肿瘤浸润淋巴细胞自然杀伤细胞(14]。乘法的属我们的人口可能是一个指针指向目标微生物的研究在未来。

另一生物发现很明显呈现在我们的研究中p . anaerobius。它与一个toll样受体2对结肠癌细胞TLR2和TLR4增加活性氧化物种的水平,促进胆固醇合成和细胞增殖。镍等。显示的水平p . anaerobius被发现的人类结肠肿瘤组织和腺瘤与nontumorous相比组织。这项研究的作者推测,这种细菌会增加结肠发育异常的小鼠模型CRC (15]。

在动物实验中,无菌鼠喂食了凳子从个人与CRC发达的比例明显高于高档发育不良( )和宏观息肉( 从控制)比老鼠粪便16]。这表明,CRC患者的粪便微生物群可以促进肿瘤发生在无菌鼠,隐含CRC和微生物群的关系。

梭菌属,月形单胞菌属,消化链球菌属是其他属大量出现在我们的CRC患者。这些butyrate-producing细菌已确定在大肠癌病例Hibberd et al。也(17]。厚壁菌门的存在、变形菌门和拟杆菌门又明显高于CRC患者比控制,如表所示3。在一项由徐和江18),在正常微生物群,癌症,和腺瘤组织观察。作者发现,细菌与潜在的肿瘤发生脆弱拟杆菌和梭菌属,在癌组织中较为常见,而一些短链脂肪酸(SCFA)生产微生物多健康组。的共生体埃希氏杆菌属更丰富的腺瘤患者在他们的研究。作者描述的研究提出一些细菌,如Butyricicoccus,大肠杆菌,梭菌属可能作为潜在生物标志物正常,腺瘤,分别和癌症组。

大多数的研究参与者被肥胖。肥胖与结肠癌和糖尿病。在这两种条件下微生物群的作用被描述(19]。可能是一个险恶的关系存在,且考虑到全球流行的肥胖和糖尿病,可能谨慎地提到减少结肠癌的后果,这些修改的因素应该很积极解决。

遗传差异在CRC患者肠道菌群通过Goyal et al。20.),和当前研究的结果确定变化11属在这个示例的沙特阿拉伯CRC患者。我们研究的局限性是,样本容量小,但它却提供了洞察这些肠道微生物的可能参与CRC患者在这个世界的一部分。

硬币的另一面是,知识的潜在作用的微生物群触发CRC可以建议一些保护性干预结肠癌致癌作用。为了解决这个问题,Hibberd et al。17)观察益生菌LGG施加有利影响和减少CRC的速度发展。这个益生菌干预目标微生物群可用于人类与其他膳食补充剂或药物共轭作为早期结肠癌的预防战略的一部分,经过进一步的临床验证。

最后,众所周知,CRC是最治愈的癌症之一,5年生存率约64% (21]。这些见解微生物之间的关系,宿主基因型,和炎症可以显示早期诊断策略,CRC的预防措施和治疗疗法。此外,预计研究微生物生态失调可能推动CRC患者护理的临床应用。因此,这项研究可能被视为一个潜在的参考在这个领域为CRC的早期诊断,诊断测试时基于肠道微生物群的分析,终于发现了。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究项目是由阿卜杜勒阿齐兹国王科技城(没有。- 29 - 243)。

引用

1. 邹,l .方和m·h·李,“生态失调的肠道微生物群在促进大肠癌的发展,“杂志的报告》第六卷,没有。1、1 - 12,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 问:朱,r .高、w·吴和h .秦“肠道微生物群的作用在结直肠癌的发病机制,“肿瘤生物学,34卷,不。3、1285 - 1300年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. w·e·摩尔和l·h·摩尔的肠道分布范围的人群结肠癌的风险高,“应用与环境微生物学,卷61,不。9日,第3207 - 3202页,1995年。视图:谷歌学术搜索
4. m . n . Khabaz j·a·马格拉比t Nedjadi et al ., " Val / Val GSTP1酶的基因型影响大肠癌易感性在沙特阿拉伯吗?”神经内分泌学字母,37卷,不。1,46 - 52点,2016页。视图:谷歌学术搜索
5. r . n . Alharithy“RETN基因的多态性,对结肠癌在沙特的病人,”沙特医学年鉴,34卷,不。4、334 - 339年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. s . a . Elsamany a . s . Alzahrani m·m·穆罕默德et al .,“二模式和生存的结果在年轻患者结直肠癌:沙特阿拉伯西部的经验,“亚洲太平洋癌症预防杂志》上,15卷,不。13日,5239 - 5243年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. m·a .青年外交官访华团h·a·Nounou m . s . Alanazi o . Alharby n .阿赞和h . m .赛义德,”cox - 2和MMP-2基因的单核苷酸多态性之间的关联和大肠癌易感性在沙特人口,”亚洲太平洋癌症预防杂志》上,15卷,不。12日,第4994 - 4989页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. h . Alkhalidi和h . Kfoury”地位的错配修复基因hMSH2和hMSH6结直肠癌在沙特患者:免疫组织化学分析,“东地中海健康杂志,18卷,不。11日,第1117 - 1114页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. s . g .丹尼尔,c . l .球,d . g . Besselsen t . Doetschman和b . l .赫维茨”功能改变肠道微生物转化生长因子β缺乏结肠癌。”mSystems,卷2,不。5,pp. e00065-e00017, 2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. Allali, s . Delgado p i栗色的et al .,“肠道微生物组成和功能差异肿瘤和肿瘤邻近组织从美国和西班牙军团”肠道微生物》第六卷,没有。3、161 - 172年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 渡边r . Shigefuku t y菅野et al .,”梭菌属nucleatum同时发现在化脓性肝脓肿和先进的乙状结肠癌,”厌氧生物48卷,第146 - 144页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. p·b·Eckburg e . m . Bik c·n·伯恩斯坦et al .,“人类肠道微生物菌群的多样性,”科学,卷308,不。5728年,第1638 - 1635页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. d·l·哈勒尔y . Wang Antonopoulos et al .,“结肠灌洗标准改变了人类结肠mucosal-associated微生物群的自然状态,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。2篇文章e32545 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. c . Gur o . Mandelboim, g . Bachrach”“先生们,这是les微生物,auront什么年检”:先生们,这是微生物的人最后一句话(路易·巴斯德)梭菌属nucleatum保护从杀死肿瘤的免疫细胞。”OncoImmunology,4卷,不。9篇文章e1038690 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. y倪,v . h . y . Wong w . c . s . Tai et al .,“宏基因组研究的预防效果乳杆菌GG在Apc肠息肉形成^{分钟/ +}老鼠。”应用微生物学杂志,卷122,不。3、770 - 784年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. l . s . h . Wong赵,x张et al .,“强饲法结直肠癌患者的粪便样本促进肠道致癌作用在无菌和传统的老鼠,”胃肠病学,卷153,不。6,1621 - 1633页。e6, 2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. 答:a . Hibberd莱拉,a·c·Ouwehand et al .,“结肠癌患者肠道菌群改变和修改由益生菌干预,”BMJ开放胃肠病学,4卷,不。1,文章e000145, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. k .徐和b .江”,分析mucosa-associated微生物群在结直肠癌,”医学科学监控,23卷,第4430 - 4422页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. h . Tilg“肥胖、代谢综合征和微生物群:多个交互,”临床胃肠病学杂志,44卷,补充1,S16-S18, 2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. s . Goyal p . Nangia-Makker l . Farhana y,和a . p . n . Majumdar“种族差异在结直肠癌:肠道微生物和癌症干细胞,”世界干细胞》杂志上,8卷,不。9日,第287 - 279页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j·m·韦斯·r·Pfau e·s·奥康纳et al .,“死亡阶段的权利——与左侧结肠癌:分析监测、流行病学、和结束results-Medicare数据,”临床肿瘤学杂志卷,29号33岁,4401 - 4409年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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