Endostar特定诱导血管生成的抑制作用人类肝细胞癌

文摘

调查的影响endostar特定人类肝细胞癌引起的血管生成,本研究系统地阐明HepG2-induced血管生成的抑制作用由50 endostar ng / mL 50000 ng / mL。我们采用荧光定量Boyden室分析、愈合实验,流式细胞术检测使用coculture系统,管形成的定量分析在活的有机体内肝癌引起的基底膜基质堵塞试验条件媒体(HCM)和HepG2与正常相比(不合格品)和L02肝细胞的媒体。然后,我们发现endostar作为肿瘤血管生成抑制剂可以强有力地抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移反应HCM四到六小时的行动后,抑制HCM-induced HUVEC迁移到损伤的部分在50毫微克/毫升剂量依赖性的方式和在24小时5000 ng / mL,并减少剂量依赖性的方式HUVEC增殖。Endostar抑制HepG2-induced管形成的HUVECs达到50 ng / mL。在活的有机体内基底膜基质堵塞的形成也显著减少endostar HepG2诱导系统中而不是在L02诱导系统。它可以得出结论,在细胞水平,endostar抑制HUVEC的angiogenesis-related生物行为针对肝细胞癌,包括迁移、粘附增殖,和管形成。在动物水平,endostar抑制反应肝细胞癌的血管生成人工基底膜矩阵。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是世界上第五个最常见的肿瘤,这是很难被治愈,容易复发。手术切除、肝脏移植,局部介入治疗,和一般化疗与限制(常规治疗1,2]。这是必须找到一个新的系统治疗肝细胞癌。一般化学疗法是针对肿瘤细胞,而抗血管治疗目的是血管内皮细胞已经成为第二个重要目标由于其稳定的性能、特异性、宽范围(3,4]。肝细胞癌是一种恶性血管肿瘤,在它增长癌症细胞通过各种途径诱导血管生成。

肝动脉造影观察丰富的血管,血管生成是HCC预后[紧密相连5]。免疫组织化学(包含IHC)使用特定CD34标记血管内皮细胞检测肝细胞癌是一种广泛应用的微脉管密度病理指标HCC预后[6]。成功的抗血管治疗结直肠癌(7)和肺癌(8,9肝细胞癌抗血管治疗提供了新的方向。

内皮细胞在血管生成发挥着重要作用。在多个抗血管因素,血管内皮抑制素是令人满意的,因为它是内生和多目标。血管内皮抑制素是c端氨基酸片段第八X型胶原蛋白,这是首先angioblastoma分离菌株的老鼠。血管内皮抑制素抑制血管内皮细胞的增殖和毛细管增长(10]。据报道,血管内皮抑制素能诱导内皮细胞的细胞凋亡和细胞周期阻滞11]。

动物实验表明,血管内皮抑制素可以显著抑制各种小鼠同种异体移植肿瘤的扩散12]。然而,有一些困难的应用基因工程重组人血管内皮抑制素在临床上因为表达的重组血管内皮抑制素大肠杆菌在形式难以纯化的包涵体和复合13]。血管内皮抑制素相比,endostar新重组人血管内皮抑制了他的标记(MGGSHHHHH)添加到它的n端使得它很容易纯化(14]。然而,这种修改是否影响血管内皮抑制素的生物活性有待进一步验证。

一些报道和统计显示,endostar潜在影响肝癌治疗:(a)的微脉管密度肝癌肿块是肝细胞癌术后复发的预后指标15)和(b)血管内皮抑制素在肝细胞癌的低表达水平和丰富的血管生成是肿瘤恶化[16]。(c) Endostar结合navelbine和顺铂治疗的另一个富血管肿瘤,非小细胞肺癌,表明他们可以改善晚期治疗效果和延长肿瘤进展时间中值阶段I, II, III试验(17]。(d)血管内皮抑制素含有质粒显示抑制抑制作用对人类肝癌细胞株bel - 7402及其异构裸小鼠移植瘤模型。小说(e)血管生成抑制剂阿瓦斯丁结合化疗是在二期临床实验可能延长肝癌患者的无进展生存(PFS) 6个月(18]。

在这个研究中,我们采用HUVEC细胞模型和正常L02肝细胞线。L02被用作控制抗血管评估在体外和在活的有机体内实验系统研究重组人血管内皮抑制素的影响(endostar)对人类肝癌细胞株HepG2-induced angiogenesis-related HUVECs的生物行为,这可能提供了理论和实验证据endostar被用作一种抗血管药物在肝细胞癌的治疗。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

实验使用HUVECs执行(ScienCell) HepG2(从上海细胞机构)和L02细胞机构)(从上海。HUVECs在内皮细胞培养介质(ECM;ScienCell)与内皮细胞增长1%补充补充(ecg;ScienCell), 5%胎牛血清(的边后卫,英杰公司公司),100 U /毫升青霉素(表达载体corp .),和100年μg / mL链霉素(表达载体corp .)。HepG2 L02和杜尔贝科修改鹰的培养基培养(DMEM,英杰公司集团)补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。所有的细胞都保持在5%的股份有限公司₂空气气氛湿润孵化器在37°C。90%汇合的细胞分离胰蛋白酶/ EDTA(表达载体corp .)和亚文化在适当的分流比。

2.2。动物

BALB c / J-severe联合免疫缺陷(SCID)小鼠获得从上海SLAC实验室和被用于人工基底膜塞的研究。

2.3。制备的HCM HepG2 L02两种

所描述的方法的莫洛兹et al。19),细胞被允许增长到80%融合。更换后与15毫升DMEM培养基加0.2%牛血清白蛋白(BSA,英杰公司集团),细胞被放置在5%的股份有限公司₂空气气氛湿润孵化器在37°C 24 h。HCM或不合格品收集和离心机为15分钟7000 rpm消除细胞碎片。浮在表面的,被超滤Amicon Ultra-15(微孔,MWCO 3 kd)获得蛋白质,然后被resuspended人类内皮细胞无血清培养基(SFM;英杰公司corp .) + 0.2% BSA。暂停收集和过滤。收集到的媒介是储存在−80°C。

2.4。迁移分析

HUVEC迁移进行了分析中描述的协议使用修改后24-well Boyden钱伯斯含有聚乙烯膜(他一一Bio-One)。HUVECs在SFM 0.2% BSA挨饿过夜。细胞使胰蛋白酶化,包含0.2% BSA在SFM resuspended,混合着endostar(南京先声药业有限公司)不同的最终浓度(0 ng / mL, 5 ng / mL, 50 ng / m, 500 ng / mL, 5000 ng / mL,和50000 ng / mL) 30分钟前加入参议院的混合物。HCM和不合格品混入endostar作为引诱剂放置在较低的井。SFM与10%的边后卫和SFM 0.2% BSA受雇为积极的和消极的控制,分别。细胞培养板在细胞培养孵化器孵化在37°C和5%的公司₂6 h。随后,所有细胞荧光标记了4M calcein-AM(σ)45分钟和孵化prewarmed trypsin-EDTA 10分钟,允许迁移细胞脱离底部的PET膜。最后,迁徙的细胞被量化的TECAN多功能读者的激发波长485 nm和发射波长520 nm)。

2.5。愈合试验

如前所述(执行愈合试验20.与一些改进)。HUVECs (每口井)被播种在ECM 24-well盘子和培养媒介融合的90%。HUVECs渴望4 h在SFM BSA为0.2%。细胞单层刮了无菌提示创建一个胞外区,然后拍照来确定损伤基线。媒体取代了HCM包含endostar不同的浓度。SFM和5%的边后卫和SFM 0.2% BSA被用作控制。迁移的细胞被记录在一个24小时奥林巴斯ix - 71倒置显微镜配备一个奥林巴斯相机。数据被Image-Pro +分析软件。

2.6。细胞粘附试验

粘附肿瘤细胞和内皮细胞之间的所述测量与一些修改(21]。HepG2和L02播种在96孔板前100%融合实验。HUVECs沾染了4米calcein-AM和使胰蛋白酶化。单一HUVEC暂停使用不同浓度的endostar 30分钟。与HCM在播种前HUVECs涨跌互现HepG2 cell-coating板(每)。盘子在37°C孵化1 h。不依从的细胞,每个被添加prewarmed仔细清洗无血清培养基,其次是温柔的旋转和反转的板和吸去多余的液体到滤纸或纸巾。这是重复四次,之后1毫升prewarmed无血清培养基被添加到每个。相对荧光单位(RFU)测量使用TECAN多功能读者的激发波长485 nm和发射波长520 nm)。粘附率的计算公式:粘附率= (RFU100%control−RFU0%control) / 100×(RFUsample−RFU0%control)。

2.7。CFSE-Labeled流仪结果

coculture系统如前所述成立(22)有一些变化。立即在试验之前,HUVECs和HepG2沾carboxyfluorescein succinimidyl氨基酸酯(CFSE)(分子探针)和PKH-26红色荧光细胞链接器(Sigma-Aldrich),分别作为协议。部分的标记细胞立即修复,作为积极控制。HUVECs镀在12-well板(每口井)单独或在比1:4 HepG2相比。完整的附件后,细胞被饿死在SFM + 0.2% BSA 6 h和对待endostar额外1 h。媒体所取代的混合物SFM加上2%的边后卫一起endostar相应的浓度。48小时后,HUVECs收获,在细胞固定液固定,通过流式细胞术分析。数据分析CELLQuest和ModFit获得增殖指数。积极的控制采用第一代。抑制率的计算是通过以下公式:。

2.8。管形成分析

管的形成是评估如前所述20.]。50L稀释增长的因素都可以降低人工基底膜(Becton Dickinson)瓦96 -孔板底部在4°C, 37°C对凝胶化。HUVECs被播种密度每在SFM、HCM和不合格品。coculture实验,混合物HUVECs和HepG2 1: 1的比例被播种在HCM的基底膜基质。Endostar不同浓度的补充道。所有管形成实验观察使用奥林巴斯ix - 71倒置荧光显微镜和图像数字捕获在镀后24小时。小管形成评估通过计算小管分支的数量和总覆盖面积小管在每个字段的视图Image-Pro +软件。

2.9。在活的有机体内基底膜基质堵塞试验

血管生成进行了分析使用在活的有机体内基底膜基质堵塞试验(如前所述)(23]。短暂,GFR-Matrigel HepG2 / L02和endostar 2: 1: 1体积比彻底混合在4°C。雄性BALB / c SCID小鼠麻醉注射GFR-Matrigel的混合和HepG2皮下注射(南)左上方背。GFR-Matrigel L02细胞混合物注入在右上角部分使用prechilled结核菌素注射器(27-gauge针)。GFR-Matrigel和endostar受雇为空白的混合控制和注射在左下角背。从第二天开始,8毫克/公斤endostar每天给小鼠腹腔内注射。植入后七天,老鼠牺牲。与周围的皮肤被移除和多血管基底膜基质插头被拍到(37)。然后人工基底膜塞在500年被均质μL (radioimmunoprecipitation(里帕;Beyotime)缓冲区。匀浆离心机在1000×g收集暂停。血红蛋白测定的OD值使用TECAN多功能读者吸收波长420纳米。ANVOA测试结果进行了分析。

3所示。结果

3.1。Endostar的影响HCC-Induced HUVEC迁移

Boyden室迁移试验表明,当使用HCM作为引诱剂迁移明显诱导HUVEC的4 - 6 h与浓度可抑制由endostar 5 ng / mL 50000 ng / mL。时的浓度endostar 50 ng / mL, 500 ng / mL,抑制效果是最重要的()(图1)。

愈合试验表明,HCM诱导HUVEC迁移到伤口面积可抑制由endostar(图2(一个))。24小时后,endostar的抑制效应浓度从50 ng / mL的浓度5000 ng / mL(图2 (b))。

3.2。Endostar的影响HCC-Induced HUVEC附着力

在细胞粘附试验,每组的粘附率和抑制率计算RFU如图3。显示HUVEC的细胞数量,坚持HepG2被添加endostar下降。endostar向粘附的抑制效果HUVEC HepG2的能力从50增加其浓度升高ng / mL 5000 ng / mL。

3.3。Endostar的影响HCC-Induced HUVEC增殖

CFSE-labeled流仪分析的结果分析了CELLQuest ModFit和每个样本的π值计算并表现出图4,这表明endostar显著抑制的HUVEC增殖HepG2 cocultured HCM系统和文化系统存在剂量依赖的相关性。此外,endostar对HUVEC的增殖的抑制效果更重要在coculture系统比HCM系统()。

3.4。在HCC-Induced Endostar管形成的影响

管形成试验表明,诱导HUVEC网管结构HepG2明显减少了添加endostar不同浓度(图5(一个))。分析Image-Pro +显示长度(图5 (b)(图),区域5 (c)(图),和数量5 (d))的基底膜基质净管由HUVEC endostar政府后所有下降。抑制效应浓度时最重要的是50 ng / mL。

3.5。在HCC-Induced Endostar血管生成的影响在活的有机体内

在活的有机体内基底膜基质堵塞试验表明,GFR-Matrigel + HepG2 GFR-Matrigel + L02可以在皮下形成包含初始塞船SCID鼠。最初的船只的数量的插头被endostar下降。在图6(一),当endostar的浓度0 ng / mL,有大量的初始形成的血管塞GFR-Matrigel + HepG2和插头的颜色是深红色。endostar浓度时50 ng / mL,最初的血管明显减少,除了一个巨大的初始船的插头。当endostar的浓度是500 ng / mL,有一些微小血管的插头。当endostar的浓度是5000 ng / mL,插头是苍白的颜色。均质化后,endostar-treated插头的匀浆OD值下降,表明endostar显著抑制HepG2-induced血管生成(图6 (b))。

4所示。讨论

HCC-induced内皮细胞迁移的机理通常被认为与肝癌细胞的各种细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)家族,纤维母细胞生长因子(FGF)家庭,Angiopoietin2, Angiotropin,肿瘤坏死因子(TNF)集落刺激因子(csf),科学家趋化因子与ELR基序、肝细胞生长因子(HGF),血小板内皮细胞粘附分子- (PECAM -) 1,和整合蛋白(24]。这些细胞因子网络建立了互动;然而,每个细胞因子的权重是未知的。一般来说,endostar可以抑制趋化迁移引起的内皮细胞的多个由肝细胞分泌的细胞因子。在荧光定量迁移室实验中,多种细胞因子诱导趋化内皮细胞的迁移,这是抑制endostar后补充道。当endostar添加浓度为4 h - 6 h 5 ng / mL - 50000 ng / mL,抑制作用与浓度表示,这是最重要的50 ng / mL和500 ng / mL。

划痕实验也发现类似的结果。划痕后,HCM诱导趋化内皮细胞迁移到受伤的部分。endostar添加24 h时,浓度从5 ng / mL 50000 ng / mL,内皮细胞的抑制趋化迁移能力受伤的部分HCM浓度。虽然两个实验建议endostar可以抑制内皮细胞迁移引起的HCM,最有效的浓度不同,依赖于不同的endostar动作时间。

内皮细胞的粘附机制诱导肝癌细胞通常被认为与VEGF的分泌,FGF-2肝癌细胞和整合蛋白(和)、VE-cadherin和PECAM-1调节内皮细胞,可以改善内皮细胞的粘附影响肝癌细胞(25]。Endostar可以有效地抑制肝癌引起的内皮细胞的粘附,检测到的荧光定量粘连的实验。HUVEC细胞的数量,是激活HCM,坚持HepG2 endostar添加时显著降低。当endostar的浓度从5 ng / mL 50000 ng / mL,粘附抑制效应浓度。

肝癌细胞诱导血管内皮细胞的增殖通过两种方法:一是分泌一些细胞因子如VEGF-family, fgf家族,angiopoietin-2, EGF, csf,血管生成素,科学家趋化因子与ELR基序,胰岛素样生长因子- 1 (IGF),促红细胞生成素和白介素- 8 (IL)。另一个是通过整合蛋白与血管内皮细胞直接接触和VE-cadherin26]。Coculture实验表明endostar显著抑制扩散HUVEC cocultured HepG2和培养HCM孤单。HUVEC的抑制效果更明显与HepG2 cocultured比HUVEC培养仅在HCM,这表明endostar抑制内皮细胞的增殖受多种因素影响,诱导肝癌细胞。

管形成试验发现了类似的结果。一方面,管的形成提高了肝癌细胞分泌活跃等因素TGF -肿瘤坏死因子-,angiotropin [27]。在另一方面,肝癌细胞改善管的形成通过直接接触PECAM-1和VE-cadherin [28]。

在基底膜基质,网管结构明显减少了添加endostar。时的浓度endostar 50 ng / mL - 5000 ng / mL,抑制的峰值点50 ng / mL,暗示endostar抑制内皮细胞的管结构形成受多种因素影响,诱导肝癌细胞。

多种细胞因子如VEGF-family、TNF,angiotropin EGF和HGF密切相关在活的有机体内血管生成(29日]。我们的研究结果还表明,肝癌细胞可以诱导更多的血管,而endostar显著抑制诱导血管生成。检测血红蛋白数量在插头表明浓度从50 ng / mL 5000 ng / mL, endostar可以显著抑制肝癌诱导血管生成剂量依赖性。

总之,我们的研究使用修改后一系列经典在体外实验,比如Boyden室迁移数组,愈合试验,细胞粘附试验,CFSE-labeled流仪分析,和管形成化验分析的抑制效应endostar HCC-induced内皮细胞迁移、粘附、增殖,管的形成,表明endostar可以抑制肝癌的血管生成在体外。我们也分析了HCC-induced血管生成的抑制作用在活的有机体内通过修改人工基底膜塞分析压制,这表明endostar可以抑制肝癌的血管生成在活的有机体内。

endostar抑制HCC-induced血管生成的分子机制仍需进一步说明。然而,我们的研究证实endostar对多个因素影响和HCC-induced血管生成抑制效应。结果提供理论和实验依据endostar抗血管治疗的作用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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